生物技術(shù)概論細(xì)胞工程課件

第四章細(xì)胞工程

CellEngineering主要講授內(nèi)容：1細(xì)胞工程概述2植物細(xì)胞工程3動(dòng)物細(xì)胞工程4微生物細(xì)胞工程本章要求：理解細(xì)胞工程的概念；掌握植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法；理解植物非試管快繁的基本原理和方法；理解植物細(xì)胞培養(yǎng)、人工種子、細(xì)胞融合的基本原理和方法；了解植物細(xì)胞工程的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景；理解單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞核移植與動(dòng)物克隆、染色體轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞等研究的基本原理與方法；了解動(dòng)物細(xì)胞工程的研究進(jìn)展與應(yīng)用；了解微生物細(xì)胞工程的基本原理；了解微生物細(xì)胞工程的研究進(jìn)展與應(yīng)用。1.1細(xì)胞工程概念細(xì)胞工程：在細(xì)胞水平上研究、開(kāi)發(fā)、利用各類(lèi)細(xì)胞的工程，即人們根據(jù)科學(xué)設(shè)計(jì)改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，并通過(guò)無(wú)菌操作，大量培養(yǎng)細(xì)胞、組織乃至完整個(gè)體的技術(shù)（教材P60）。細(xì)胞工程：應(yīng)用細(xì)胞學(xué)的方法，按照我們?nèi)祟?lèi)的需要和預(yù)定的設(shè)計(jì)，有目的、有計(jì)劃地保存、改變和創(chuàng)造新細(xì)胞及其遺傳物質(zhì)，從而產(chǎn)生新的種或者品種的技術(shù)。細(xì)胞工程：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，在細(xì)胞水平進(jìn)行的遺傳操作。1細(xì)胞工程概述細(xì)胞工程：是指以細(xì)胞為基本單位進(jìn)行培養(yǎng)、增殖（細(xì)胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)）或按照人們的意愿改造細(xì)胞的某些生物學(xué)特性，從而創(chuàng)造新的生物和物種，以獲得具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物產(chǎn)品。它主要由兩部分構(gòu)成，其一是上游工程，包含細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞遺傳操作和細(xì)胞保藏三個(gè)步驟。另一個(gè)則是下游工程，是將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去，以生產(chǎn)生物產(chǎn)品的過(guò)程。1.1細(xì)胞工程概念1.2細(xì)胞工程研究的對(duì)象

細(xì)胞或其組成部分和構(gòu)成的組織、器官等如染色體、細(xì)胞核、原生質(zhì)體、整個(gè)細(xì)胞、受精卵、胚胎、組織或器官。1細(xì)胞工程概述1.4細(xì)胞工程的優(yōu)點(diǎn)1.4.1

細(xì)胞工程開(kāi)辟了基因重組的新途徑，它不需要經(jīng)過(guò)分離、提純、剪切、拼接等基因操作只需將細(xì)胞遺傳物質(zhì)直接轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，就能夠形成雜交細(xì)胞，因而提高了基因轉(zhuǎn)移的效率。1細(xì)胞工程概述1.4.2細(xì)胞工程克服了常規(guī)雜交的局限性，使遠(yuǎn)緣雜交有了新的途徑。它不僅可以在植物一植物之間，動(dòng)物與動(dòng)物之間，微生物與微生物之間進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，甚至可以在動(dòng)物與植物、動(dòng)物與微生物之間進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交物種。土豆—番茄、山綿羊、大豆—煙草、芹菜—胡蘿卜。1.4.3用細(xì)胞工程的技術(shù)來(lái)改造和創(chuàng)造新生物，比起用基因工程技術(shù)來(lái)稍為容易些。1.4細(xì)胞工程的優(yōu)點(diǎn)1.5細(xì)胞工程與其他生物工程的關(guān)系細(xì)胞工程與其他生物工程的關(guān)系1細(xì)胞工程概述優(yōu)質(zhì)植物快速培育與繁殖動(dòng)物胚胎工程快速繁殖優(yōu)良、瀕危品種利用動(dòng)植物細(xì)胞培育生產(chǎn)活性產(chǎn)物、藥品新型動(dòng)植物品種的培育供醫(yī)學(xué)器官修復(fù)或移植的組織工程轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的生物反應(yīng)器工程珍稀動(dòng)植物資源的保存與保護(hù)在遺傳學(xué)發(fā)育學(xué)等領(lǐng)域的理論研究在能源、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用1.6細(xì)胞工程的應(yīng)用2植物細(xì)胞工程2.1植物組織培養(yǎng)2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)2.3植物非試管快繁2.4植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合2.5人工種子的研制2.6植物細(xì)胞工程研究進(jìn)展（綜述）2.1植物組織培養(yǎng)

（Planttissueculture）2.1.1幾個(gè)重要概念2.1.2對(duì)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的要求2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟2.1.4主要植物組織培養(yǎng)技術(shù)2植物細(xì)胞工程

脫分化

再分化

外植體愈傷組織生長(zhǎng)點(diǎn)

幼莖、根

小植株

植物組織培養(yǎng)：

在無(wú)菌條件下，將離體的植物器官（根尖、莖尖、葉、花、果實(shí)、種子等）、組織（花藥、胚乳、皮層、髓組織等）、細(xì)胞（體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等）、胚胎（成熟或未成熟的胚）、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、叢生芽或長(zhǎng)成新的完整的植株的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。由于在試管內(nèi)培養(yǎng)，且培養(yǎng)的是脫離植株母體的培養(yǎng)物，所以也叫“離體培養(yǎng)”（Cultureinvitro）或“試管培養(yǎng)”（Intest-tubeculture）。2.1.1幾個(gè)重要概念外植體(Explant)：植物組織培養(yǎng)中用來(lái)進(jìn)行離體無(wú)菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。愈傷組織(Callus)：外植體產(chǎn)生的排列疏松而無(wú)規(guī)則且沒(méi)有發(fā)生分化的薄壁細(xì)胞。

脫分化（dedifferentiation）：原來(lái)已經(jīng)分化,并且具有一定功能的體細(xì)胞(或性細(xì)胞),喪失了原有的結(jié)構(gòu)和功能,又重新恢復(fù)了分裂功能,就叫做植物細(xì)胞的脫分化。2.1.1幾個(gè)重要概念接種室培養(yǎng)室2.1.2對(duì)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的要求觀察與鑒定室大棚2.1.2對(duì)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的要求2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟

()2.1.3.1培養(yǎng)基配制2.1.3.2滅菌2.1.3.3接種2.1.3.4培養(yǎng)2.1.3.5試管苗馴化移栽2.1.3.6試管苗增殖率的估算2.1.3.7快速繁殖工作的計(jì)劃安排

2.1植物組織培養(yǎng)有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分：（配成母液

）碳水化合物：蔗糖和葡萄糖，白糖節(jié)約成本一般的使用濃度為2%—4%。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（常稱(chēng)為激素）：配成母液

生長(zhǎng)素：NAA、IAA、IBA、2，4－D；細(xì)胞分裂素：KT(激動(dòng)素)、6-BA(6-芐基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2－iP（2－異戊烯腺嘌呤）、4PU、CPPU（吡效?。┖蚑DZ（噻重氮苯基脲）。其它：赤霉素（GA3）；脫落酸（ABA）；多效唑（PP333

）水：①一個(gè)完善的培養(yǎng)基成分

②培養(yǎng)基的種類(lèi)：按培養(yǎng)基組成特點(diǎn)分類(lèi)第一類(lèi)為含鹽量高的培養(yǎng)基，如MS、LS、BL、ER。第二類(lèi)為硝酸鉀含量高的培養(yǎng)基，如B5、N6、SH。第三類(lèi)是無(wú)機(jī)鹽中等含量培養(yǎng)基，如H和Nitsch培養(yǎng)基。第四類(lèi)為低鹽含量基本培養(yǎng)基，如White、WS和HE培養(yǎng)基。

按培養(yǎng)基的功能分類(lèi)脫分化培養(yǎng)基初代培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基壯苗培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基２.1.3.1培養(yǎng)基

的配制2.1.3.1培養(yǎng)基

的配制③怎樣選取最佳培養(yǎng)基方案（例：MS+6BA0.5mg/L+NAA1mg/L+Su3%+Agar0.6%）對(duì)于某個(gè)待培養(yǎng)的目的植物來(lái)講：查資料-----預(yù)備性試驗(yàn)----觀察培養(yǎng)物的反映-----調(diào)整：?jiǎn)我蜃釉囼?yàn)，多因子試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)-----逐步添加和逐步排除基本培養(yǎng)基的選擇激素的選擇：激素種類(lèi)、濃度、激素配比糖的選擇：糖的種類(lèi)、濃度的選擇瓊脂的選擇：主要是濃度的選擇附加物的選擇：香蕉汁、活性炭、椰子汁等濃度為mg/L細(xì)胞分裂素0.5

1.5

34.5生長(zhǎng)素0

（1）（2）（3）（4）0.5

（5）（6）（7）（8）1.0

（9）（10）（11）（12）1.5

（13）（14）（15）（16）④培養(yǎng)基的配制方法（藥品室進(jìn)行）MS+6-BA0.5+NAA1+Su3%+Agar0.6%500mL

水+母液：激素或其他成分：如活性碳等糖類(lèi)：一般30g/L瓊脂：一般6－8g/L加熱溶化：pH值調(diào)整：定容：分注、封口：滅菌：2.1.3.1培養(yǎng)基

的配制2.1.3.2滅菌①濕熱滅菌：培養(yǎng)基及布制品的滅菌幾種排氣的方法：時(shí)間與體積的關(guān)系：放氣方法：容器的體積/mL在121℃滅菌所需最少時(shí)間/min20-501575-15020250-500251000302.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟②灼燒滅菌：用于無(wú)菌操作的器械95%的酒精+酒精燈火焰上灼燒接種器殺菌器：如圖③過(guò)濾滅菌：不耐熱的物質(zhì)2.1.3.2滅菌④干熱滅菌：玻璃器皿及耐熱用具等⑤紫外線(xiàn)和熏蒸滅菌：空間滅菌所用（培養(yǎng)室、接種室等）⑥一些物體表面用藥劑噴霧滅菌

2.1.3.2滅菌⑦消毒劑表面滅菌：植物材料（超凈工作臺(tái)上，接種室）

消毒劑因素材料采集的因素老嫩因素部位因素天氣因素季節(jié)因素時(shí)間因素

外植體消毒步驟2.1.3.2滅菌消毒劑因素消毒劑使用濃度去除難易消毒時(shí)間（分）效果次氯酸鈣9％－10％易5－30很好次氯酸鈉2％易5－30很好過(guò)氧化氫10％－12％最易5－15好溴水1％－2％易2－10很好硝酸銀1％較難5－30好氯化汞0.1％－1％較難2－25最好抗生素4－50mg/L中30－60較好酒精70％－75％易數(shù)秒－5分好漂白粉飽和易5－30很好2.1.3.2滅菌外植體消毒步驟材料→自來(lái)水→蒸餾水→75%酒精30~60S無(wú)菌水3~4次→10%次氯酸鈉或次氯酸鈣飽和液或0.1~0.2%升汞（吐溫）5~15min→無(wú)菌水洗5~8次。2.1.3.2滅菌２.1.3.３接種（接種室）2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟2.1.3.４培養(yǎng)Culture（培養(yǎng)室）培養(yǎng)方法

固體培養(yǎng)法

液體培養(yǎng)法

培養(yǎng)步驟

初代培養(yǎng)：愈傷組織；原球莖；頂芽和腋芽的發(fā)育；不定芽的發(fā)育；體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育；初代培養(yǎng)外植體的褐變繼代培養(yǎng)：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等生根培養(yǎng):2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟培養(yǎng)條件：環(huán)境培養(yǎng)條件：溫度（Light)、濕度（Humidity)、光照［光質(zhì)（Lightwave)、光強(qiáng)（Lightintensity)、光周期（Lightperiod)］化學(xué)環(huán)境條件：滲透壓（Penetratingpressure)、ｐＨ、氣體（Gas)1.3.４培養(yǎng)2.1.3.5試管苗馴化移栽①試管苗與大田苗在生理、形態(tài)等方面的差異②異養(yǎng)型自養(yǎng)型③無(wú)菌有菌④管理：保持小苗的水分供需平衡。防止菌類(lèi)滋生。一定的溫、光條件。保持基質(zhì)適當(dāng)?shù)耐庑浴?/p>

2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟2.1.3.6試管苗增殖率的估算①基本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)每一周期（從接種當(dāng)天到再次可供接種的當(dāng)天）需要多少天每一周期每一瓶能接種多少瓶每瓶有多少苗①基本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)每一周期（從接種當(dāng)天到再次可供接種的當(dāng)天）需要多少天每一周期每一瓶能接種多少瓶每瓶有多少苗2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟②計(jì)算出年增殖率的理論值年增殖率：Y；每周期增殖的倍數(shù)：X；

全年可增殖的周期數(shù)：n=365/每一周期的天數(shù)；

Y=Xn

2.1.3.6試管苗增殖率的估算仙茅（石蒜科）葡萄（葡萄科）茶樹(shù)（山茶科）麻瘋樹(shù)（大戟科）油樟（樟科）生姜（姜科）蘭草（蘭科）蘆薈蘭草麻瘋樹(shù)移栽2.1.3.7快速繁殖工作的計(jì)劃安排人工的配置安排實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)的時(shí)間安排增殖瓶數(shù)的控制污染的估測(cè)2.1.3植物組織培養(yǎng)的步驟2.1.4植物主要的組織培養(yǎng)技術(shù)2.1.4.1植物脫毒與快繁技術(shù)2.1.4.2花藥及花粉培養(yǎng)2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)2.1植物組織培養(yǎng)2.1.4.1植物脫毒與快繁技術(shù)2.1.4植物主要的

組織培養(yǎng)技術(shù)①意義快速繁殖，保持優(yōu)良品質(zhì)生產(chǎn)無(wú)毒苗，提高苗木品質(zhì)節(jié)約土地快速繁殖：一片樹(shù)葉能變一座森林一年內(nèi)可從一個(gè)蘭花莖尖繁殖出400萬(wàn)株遺傳性狀均一的健康植株；花葉芋：常規(guī)繁殖：幾倍——幾十倍組培繁殖：幾萬(wàn)——數(shù)百萬(wàn)倍月季、菊花、牡丹、山茶等。脫毒花卉：去病毒后，植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，花朵變大，色澤鮮艷，抗逆能力提高，產(chǎn)花數(shù)量上升。預(yù)計(jì)在21世紀(jì)，這一技術(shù)的應(yīng)用將更為廣泛。如：蘭花、大麗花、水仙、天竺葵菊花等。脫毒馬鈴薯：增產(chǎn)40-200%(2000-2500kg/畝)。紅薯：增產(chǎn)30%以上。草莓：增產(chǎn)500-1000千克/畝2.1.4.1植物脫毒與快繁技術(shù)2.1.4.1植物脫毒與快繁技術(shù)②植物脫毒技術(shù)為什么植物需要脫毒?脫毒方式：熱處理脫毒→病毒鈍化(寄主植物很少或不會(huì)受到傷害)溫湯浸漬處理：在50℃左右的溫水中浸漬10分鐘至數(shù)小時(shí)。缺點(diǎn)：易使材料受傷。熱空氣處理：35-40℃，幾十分鐘，長(zhǎng)可達(dá)數(shù)月溫?zé)嶂委熓遥ㄏ洌﹥?nèi)。缺點(diǎn)：缺陷是并非能脫除所有病毒熱處理需與其他方法配合應(yīng)用才可獲得良好的效果。

生長(zhǎng)點(diǎn)（約0.1-1MM區(qū)域）幾乎不含或含病毒很少.分生區(qū)域內(nèi)無(wú)維管束，病毒只能通過(guò)胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長(zhǎng)速度。

莖尖培養(yǎng)脫毒2.1.4.1植物脫毒與快繁技術(shù)其他途徑脫毒

愈傷組織培養(yǎng)脫毒

僅有部分單個(gè)細(xì)胞含有病毒——病毒的復(fù)制速度趕不上細(xì)胞的增殖速度或有些細(xì)胞通過(guò)突變獲得了抗病毒的抗性。缺陷——植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會(huì)產(chǎn)生變異植株，并且一些作物的愈傷組織尚不能產(chǎn)生再生植株。

化學(xué)療法脫毒

許多化學(xué)藥品（包括嘌呤、嘧啶類(lèi)似物、氨基酸、抗菌素等）對(duì)離體組織和原生質(zhì)體具有脫毒效果。2.1.4.1植物脫毒與快繁技術(shù)③脫毒效果檢測(cè)抗血清(antiserum)鑒定：已知植物病毒——核蛋白（抗原）制備抗體；抗血清+未知的病毒植物→可見(jiàn)的沉淀（試管）酶聯(lián)免疫吸收鑒定（ELISA）：已知植物病毒（抗原）+一抗（已制備）——二抗（酶）——酶的顯色底物溶液——酶標(biāo)儀檢測(cè)電子顯微鏡（electricmicroscope)檢查法：直接觀察病毒的有無(wú)或種類(lèi)指示植物法(indicatingplant)：被鑒定植物的汁液接種指示植物或嫁接接種法（指示植物作為砧木，被鑒定植物作接穗）指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的專(zhuān)化性癥狀的寄主植物。2.1.4.1植物脫毒與快繁技術(shù)2.1.4.2花藥及花粉培養(yǎng)①概念與意義花藥培養(yǎng)：花藥培養(yǎng)是把花粉發(fā)育到一定階段的花藥接種到培養(yǎng)基上，來(lái)改變花粉的發(fā)育程序，使其分裂形成細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而分化成胚狀體，產(chǎn)生再生植株，或形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。屬器官培養(yǎng)還是細(xì)胞培養(yǎng)？花粉培養(yǎng)：花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來(lái)，以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。由于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的植株都是單倍體植株。優(yōu)點(diǎn)：不受花藥的藥隔，藥壁、花絲等體細(xì)胞的干擾；缺點(diǎn)是較比花粉培養(yǎng)難度大。屬器官培養(yǎng)還是細(xì)胞培養(yǎng)？為何更多的要花藥培養(yǎng)?(藥壁提供營(yíng)養(yǎng))共同的目的：花粉細(xì)胞→單倍體(haploid)細(xì)胞→單倍體植株（但不是最終目的但具應(yīng)用潛力，為什么？）→經(jīng)染色體加倍→正常結(jié)實(shí)二倍體植株。

2.1.4植物主要的

組織培養(yǎng)技術(shù)2.1.4.2花藥及花粉培養(yǎng)單倍體植物三個(gè)明顯的特點(diǎn)：

體細(xì)胞染色體數(shù)減半；

生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減小；

雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮?，有的甚至不能進(jìn)入有性世代。單倍體的應(yīng)用潛力：迅速獲得純合型材料，縮短育種年限

獲得育種中間材料

與誘變育種相結(jié)合可以提高誘變頻率與細(xì)胞融合相結(jié)合，使這一育種途徑更具有實(shí)際應(yīng)用意義

作為遺傳工程受體更為有效（當(dāng)代表達(dá)）

用作基礎(chǔ)遺傳研究的各個(gè)領(lǐng)域加倍后的二倍體特點(diǎn)：屬于真正的純系。和常規(guī)多代自交純化方法相比，可節(jié)省大量的時(shí)間和勞力。

2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)②花藥培養(yǎng)的基本程序是：

外植體選擇－外植體(花蕾)預(yù)處理—外植體消毒—?jiǎng)內(nèi)』ㄋ帯臃N—誘導(dǎo)培養(yǎng)—分化培養(yǎng)花藥培養(yǎng)前給予一定的低溫處理是十分必要的。

煙草、茄子3～5℃72小時(shí)

水稻10℃10～14天

柑橘3℃5～10天

馬鈴薯4℃48小時(shí)低溫處理的作用：可以激發(fā)花粉母細(xì)胞產(chǎn)生兩個(gè)相等核:一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核一個(gè)生殖核；

保持高比例的強(qiáng)生活力花粉，同時(shí)延緩體細(xì)胞組織的衰老；激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚；

促使細(xì)胞同步分裂。2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)③花藥培養(yǎng)中單倍體形成的途徑營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑:生殖核退化,營(yíng)養(yǎng)核發(fā)育生殖細(xì)胞發(fā)育途徑:營(yíng)養(yǎng)核退化，生殖核發(fā)育營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞同時(shí)發(fā)育的途徑:花粉均等分裂途徑:

2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)形成胚狀體或愈傷組織④花粉及小孢子培養(yǎng)花粉培養(yǎng)的基本程序是：

取材時(shí)期的確定－外植體(花蕾)預(yù)處理—外植體消毒—花粉或小孢子的分離—接種—培養(yǎng)取材時(shí)期的確定四分體—單核早期—單核晚期—雙核早期—雙核晚期—三核期預(yù)處理有利于改變正常的發(fā)育途徑，而且還可以促進(jìn)花粉植株的形成花粉或小孢子的分離:花藥→小燒杯(有基本培養(yǎng)基)→擠壓花藥(注射器內(nèi)管)花粉釋放→過(guò)濾(尼龍篩)→低速離心（100-160r/min)→吸管吸掉碎片→加入新鮮培養(yǎng)基→連續(xù)進(jìn)行兩次過(guò)濾，到每毫升含103-104個(gè)花粉/mL

培養(yǎng)方法

花藥看護(hù)培養(yǎng)

花粉懸浮培養(yǎng)（微室培養(yǎng)）

2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)⑤單倍體植株的鑒定與二倍化鑒定方法：形態(tài)學(xué)鑒定染色體分析單倍體植株的二倍化：繼代加倍創(chuàng)傷法加倍秋水仙素處理加倍2.1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)包括胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)。①植物胚培養(yǎng)(embryocultureofplants)克服雜交育種中雜種胚的早期夭折胚培養(yǎng)包括成熟胚(matureembryo)培養(yǎng)；幼胚(immatureembryo)培養(yǎng)幼胚培養(yǎng)中，常見(jiàn)的生長(zhǎng)方式有三種：(1)、胚性發(fā)育(embryonaldevelopment)幼胚接種到培養(yǎng)基上以后，仍然按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式發(fā)育，最后形成成熟胚(有時(shí)甚至可能類(lèi)似種子)，然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株，這種途徑發(fā)育的幼胚一般一個(gè)幼胚將來(lái)就是一個(gè)植株。(2)、早熟萌發(fā)(earlymaturesprouting)幼胚接種后，離體胚不繼續(xù)胚性生長(zhǎng)，而是在培養(yǎng)基上迅速萌發(fā)成幼苗，通常稱(chēng)之為早熟萌發(fā)。在大多數(shù)情況下，一個(gè)幼胚萌發(fā)成一個(gè)植株，但有時(shí)會(huì)由于細(xì)胞分裂產(chǎn)生大量的胚性細(xì)胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現(xiàn)象就是所謂的叢生胚現(xiàn)象。(3)、愈傷組織(callus)在許多情況下，幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。一般來(lái)講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)②子房培養(yǎng)子房培養(yǎng)包括授粉前和授粉后的子房培養(yǎng)。材料的選擇品種間的差異胚囊發(fā)育時(shí)期與花粉發(fā)育時(shí)期的相關(guān)性（大麥）花粉發(fā)育時(shí)期胚囊發(fā)育時(shí)期

單核中期大孢子四分體

單核靠邊期單核至四核胚囊

二核花粉期八核胚囊

三核花粉期成熟胚囊

2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)中單倍體的來(lái)源和發(fā)育途徑由助細(xì)胞或胚囊的無(wú)配子生殖產(chǎn)生單倍體卵細(xì)胞、助細(xì)胞、反助細(xì)胞均可發(fā)育產(chǎn)生單倍體非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)③胚乳培養(yǎng)胚乳細(xì)胞的全能性？被子植物與裸子植物胚乳（三倍體或單倍體？）（在離體培養(yǎng)條件下，胚乳細(xì)胞是否與其它體細(xì)胞和花粉一樣，具有全能性而再生植株。）大多數(shù)被子植物的胚乳是三倍體，能否通過(guò)胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株而得到無(wú)籽結(jié)實(shí)；通過(guò)胚乳培養(yǎng)技術(shù)，探索改良農(nóng)、林及園藝植物三倍體育種技術(shù)的可能性。到目前為止，已有40多種植物的胚乳進(jìn)行了培養(yǎng)。其中蘋(píng)果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等的胚乳培養(yǎng)得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、葉等或得到愈傷組織。2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳為配子體的一部分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此它是單倍體組織。在被子植物中胚乳是雙受精的產(chǎn)物，在倍性上屬于三倍體，事實(shí)上我們培養(yǎng)胚乳的首要目的也是為了直接獲得三倍體植株。2.1.4.3植物胚胎培養(yǎng)2.2.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

2.2.2固定化細(xì)胞培養(yǎng)2.2.3植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質(zhì)生產(chǎn)2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)(suspensionculture)2植物細(xì)胞工程2.2.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2.2.1.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。植物細(xì)胞培養(yǎng)中常用方法。怎樣獲得單個(gè)游離細(xì)胞?（酶解）怎樣獲得小細(xì)胞團(tuán)？（愈傷組織分割；機(jī)械法；單細(xì)胞聚集）2.2.1.2基本過(guò)程：外植體（幼胚、胚軸、子葉等）→培養(yǎng)基→愈傷組織（松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)）或酶解物→震蕩培養(yǎng)→大量植物細(xì)胞→次生代謝產(chǎn)物2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)(suspensionculture)2.2.1.3懸浮培養(yǎng)三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：改善營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)：增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面；避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害；可以適當(dāng)改善氣體的交換。2.2.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2.2.1.4一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿(mǎn)足三個(gè)條件：·懸浮培養(yǎng)物分散性良好：細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系?！ぞ恍院茫杭?xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色?！ぜ?xì)胞生長(zhǎng)迅速：懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般2～3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。2.2.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2.2.1.5植物懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)：封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)組成、操作、有缺點(diǎn)（→半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)）實(shí)例（銀杏、冬青、薔薇等）2.2.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)

機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計(jì)的，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，其設(shè)備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因?yàn)橹参锛?xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，需要隨時(shí)補(bǔ)充水分和營(yíng)養(yǎng)，因此必須設(shè)計(jì)加液裝置；由于植物細(xì)胞的生理活動(dòng)需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計(jì)通氣裝置；為便于取樣觀察，一般還設(shè)計(jì)有取樣口。優(yōu)點(diǎn)：很高的溶氧系數(shù)，適于耐剪切力強(qiáng)的植物細(xì)胞培養(yǎng)。缺點(diǎn)：剪切力大實(shí)例：煙草細(xì)胞、水母雪蓮細(xì)胞等氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)

考慮到機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免，同時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點(diǎn)是攪拌不均勻。2.2.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2.2.1.6植物懸浮培養(yǎng)（小細(xì)胞團(tuán)）的目的（或應(yīng)用）：種質(zhì)保存—固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)得到大量植物細(xì)胞產(chǎn)物——基上進(jìn)行，如人參干細(xì)胞粉；紫草細(xì)胞消炎藥物得到次生代謝產(chǎn)物——液體培養(yǎng)(主要應(yīng)用)生物轉(zhuǎn)化——利用酶系的作用將第五轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物2.2.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2.2.2固定化細(xì)胞培養(yǎng)2.2.2.1固定化細(xì)胞：指固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好，產(chǎn)物易分離，利于連續(xù)化生產(chǎn)缺點(diǎn)：只適合分泌到細(xì)胞外的次生代謝物的生產(chǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)分裂旺盛時(shí)，次生代謝物產(chǎn)量低。采用固相培養(yǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)在惰性基質(zhì)中，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，可提高次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量.2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)(suspensionculture)2.2.2.2植物細(xì)胞固定化的方法①吸附法:利用各種固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法。吸附材料：多孔陶瓷、多孔塑料、多孔玻璃等。實(shí)例：多孔泡沫放入辣椒細(xì)胞的培養(yǎng)液中；2.2.2固定化細(xì)胞培養(yǎng)②包埋法包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等；

·附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。2.2.2.2植物細(xì)胞固定化的方法2.2.2.3固定化植物細(xì)胞的特點(diǎn)（與植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)對(duì)比）①減輕剪切力和其它外界因素對(duì)植物細(xì)胞的影響，提高植物細(xì)胞的存活率和穩(wěn)定性（載體的保護(hù)作用）②細(xì)胞不易聚集成團(tuán)（細(xì)胞被束縛在一定的范圍）③更換培養(yǎng)液容易④縮短生產(chǎn)周期（可以從培養(yǎng)基中不斷提取產(chǎn)物，因此，它可以進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)）。⑤固定化細(xì)胞易與培養(yǎng)液分離⑥細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，可提高次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。2.2.2固定化細(xì)胞培養(yǎng)消除代謝產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(培養(yǎng)周期——延遲期（細(xì)胞很少分裂或剛剛開(kāi)始分裂），直線(xiàn)生長(zhǎng)期（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞生長(zhǎng)分裂旺盛時(shí)，次生代謝物產(chǎn)量低，細(xì)胞數(shù)目迅速增長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率保持不變生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)最快，而細(xì)胞的干重和蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)較慢），減緩期（細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)速度減緩），靜止期（細(xì)胞分裂停止，細(xì)胞數(shù)目恒定。培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)耗盡，必須進(jìn)行繼代培養(yǎng)，進(jìn)入靜止期之前，細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)減慢，而細(xì)胞鮮重和干重增長(zhǎng)超過(guò)了細(xì)胞數(shù)的增長(zhǎng)，并一直持續(xù)到靜止期）

2.2.2固定化細(xì)胞培養(yǎng)

2.2.2.4固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)平床培養(yǎng)系統(tǒng)立體培養(yǎng)系統(tǒng)2.2.2固定化細(xì)胞培養(yǎng)2.2.2.5固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用2.2.2固定化細(xì)胞培養(yǎng)掃描圖：P115（細(xì)胞培養(yǎng)書(shū)）2.2.2固定化細(xì)胞培養(yǎng)2.2.3植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質(zhì)生產(chǎn)

利用培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)有用物質(zhì)（次生代謝物質(zhì)）的原理細(xì)胞的全能性：培養(yǎng)細(xì)胞具有該物種的藥物生物合成（次生代謝物質(zhì)）的全能性。每個(gè)植物活細(xì)胞都具有該物種的新陳代謝、應(yīng)激性和自體復(fù)制等生命基本屬性，在合適的離體培養(yǎng)條件下，可以展現(xiàn)這些特征屬性。。植物次生代謝產(chǎn)物是指植物中一大類(lèi)非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)程稱(chēng)為次生代謝。2.2.3.1一般程序

①選材培養(yǎng)器官、組織的選擇：取有藥效成分的部位，且該部位較易形成愈傷組織。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的選擇：自然條件下，一般植物生長(zhǎng)不活躍的部分，如老葉、果實(shí)和種子，傾向于積累次生代謝物，而分生組織等快速生長(zhǎng)的部分，次生代謝物的含量低。植物離體培養(yǎng)下，一般脫分化的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，很難積累次生物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞接近于衰老時(shí)，才趨向于積累次生代謝物質(zhì)。2.2.3植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質(zhì)生產(chǎn)②細(xì)胞株系建立建立懸浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）合成能力高的細(xì)胞株系的篩選與更新：篩選高產(chǎn)的細(xì)胞株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。

對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的選擇有兩個(gè)基本要求：（1）有用物質(zhì)的合成積累能力強(qiáng)（2）生長(zhǎng)速度快

2.2.3.1一般程序③大量培養(yǎng)將選出的優(yōu)良細(xì)胞株擴(kuò)大繁殖后，可作為細(xì)胞工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子”，進(jìn)行大量培養(yǎng)。④產(chǎn)品提取與純化從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化有的產(chǎn)品。2.2.3.1一般程序2.2.3.2培養(yǎng)方法——二步培養(yǎng)法

細(xì)胞生長(zhǎng)與次生物質(zhì)的產(chǎn)生對(duì)培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的要求不同，因而在細(xì)胞工廠化培養(yǎng)中采用二步培養(yǎng)方法，既使細(xì)胞生長(zhǎng)快，又使次生物質(zhì)代謝多。第一步，促進(jìn)細(xì)胞分裂，解決生物量生產(chǎn)問(wèn)題；第二步，促進(jìn)次生代謝物合成，解決次生物質(zhì)的積累問(wèn)題。在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利于次生物質(zhì)的積累。（一部分細(xì)胞用于提取物質(zhì)，另一部分用于繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞周期）

2.2.3.2

培養(yǎng)方法——二步培養(yǎng)法

2.2.3.3提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素

①細(xì)胞株系生物合成能力以特異的器官為材料篩選生物合成能力強(qiáng)的細(xì)胞株

Wayner等用檸檬葉、雞眼藤的培養(yǎng)物，經(jīng)過(guò)篩選細(xì)胞株系，其次生代謝物是該植物完整植株的10倍。Zenk從長(zhǎng)春花的培養(yǎng)物中，篩選出高產(chǎn)細(xì)胞株系，其生產(chǎn)根堿和阿瑪堿的總量，比親本植物高1.5倍，是親本植物根含量的5倍。②培養(yǎng)基中添加前體前體：有用次生代謝物的前驅(qū)物。煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物質(zhì)—煙堿酸加入，會(huì)增加煙堿的生成量。（前體物質(zhì)的加入時(shí)間非常重要，應(yīng)注意。）③培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（激素）的作用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化與再分化，而且能影響次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加吲哚乙酸（IAA），能合成煙堿，而在含有2,4-D的培養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。2.2.3.3提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素④培養(yǎng)條件的影響光照、溫度等影響次生代謝在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件使紫紅色愈傷組織能夠生成大量的花箐苷，并且低溫條件下，生成量高。2.2.3.3提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素2.2.3.4細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與有用物質(zhì)的生產(chǎn)生物堿類(lèi)黃酮類(lèi)萜類(lèi)菑體類(lèi)蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)①生物堿苦參的愈傷組織——苦參堿——降血壓、擴(kuò)張血管，治冠心病。烏頭愈傷組織——烏頭堿——驅(qū)寒、散風(fēng)、通經(jīng)、止痛長(zhǎng)春花愈傷組織——長(zhǎng)春花堿——治白血病高效藥喜樹(shù)葉愈傷組織——喜樹(shù)堿——抗腫瘤黃連愈傷組織——小蘗堿（黃連素的主要成分）——抗菌消炎②萜類(lèi)物質(zhì)利用人參愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)皂苷已進(jìn)入工廠化生產(chǎn)。紫杉醇③醌類(lèi)物質(zhì)利用紫草、決明等愈傷組織培養(yǎng)，生產(chǎn)具有抗細(xì)菌活性的醌類(lèi)物質(zhì)。④蛋白質(zhì)商品胰島素多數(shù)從動(dòng)物的胰臟提取，但價(jià)格昂貴。從苦瓜離體培養(yǎng)物種可提取胰島素。SOD、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶⑤類(lèi)黃酮類(lèi)：銀杏黃酮、花青素、查爾酮⑥菑體類(lèi)：VD、激素、強(qiáng)心苷2.2.3.4若干有用物質(zhì)的生產(chǎn)2.2.3.5存在問(wèn)題

植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)盡管有種種優(yōu)點(diǎn)，但與微生物培養(yǎng)比還存在許多問(wèn)題。生長(zhǎng)速度較慢，通常完成一次生產(chǎn)周期需4~5周才能完成；而微生物的工業(yè)發(fā)酵只需幾天就可完成發(fā)酵全過(guò)程。植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的總量一般比植物本身低，這主要是由于大多數(shù)離體培養(yǎng)細(xì)胞不能合成和積累所期望的化合物，當(dāng)然也有些細(xì)胞株系產(chǎn)量高，這與微生物大不相同。2.2.3.5存在問(wèn)題生產(chǎn)技術(shù)上還存在一些問(wèn)題。培養(yǎng)過(guò)程需要復(fù)雜的培養(yǎng)基及附加物，且易受細(xì)菌、真菌的污染；次生物的產(chǎn)量不甚穩(wěn)定，成本較高等。2.2.3.5存在問(wèn)題2.3植物非試管克隆技術(shù)TechniqueofEfficient&RapidNon-tubePlantCloning該技術(shù)是基于一個(gè)集溫度、濕度、光照、二氧化碳濃度、蒸發(fā)系數(shù)、營(yíng)養(yǎng)液濃度等為一體的傳感器（智能葉片），通過(guò)計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)為植物的離體材料創(chuàng)造最佳的生根環(huán)境，并采用無(wú)土栽培及技術(shù)，實(shí)現(xiàn)苗木快速繁殖的一項(xiàng)高新技術(shù)。2植物細(xì)胞工程基本流程：插床設(shè)置（苗床或營(yíng)養(yǎng)袋）→鋪設(shè)基質(zhì)→插穗來(lái)源→插穗規(guī)格（硬枝或綠枝）扦插專(zhuān)用藥劑處理（藥劑型號(hào)）→扦插生產(chǎn)周期安排→插后智能葉片管理(T、R、光照、殺菌、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液)→育苗生根成活→煉苗移栽→定植大田或苗圃繼續(xù)培養(yǎng)非試管繁殖與組培的區(qū)別非試管繁殖組培培養(yǎng)地點(diǎn)試管內(nèi)大田內(nèi)成活率移栽成活率低移栽成活率高成本投入成本高投入成本低操作操作復(fù)雜操作簡(jiǎn)易品種范圍快繁品種范圍窄繁品種范圍廣非試管繁殖與傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)繁殖的區(qū)別非試管繁殖傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)繁殖季節(jié)限制不受季節(jié)限制受季節(jié)限制集約化程度土地使用率高，有高度的集約化與規(guī)?；恋厥褂寐实停s化與規(guī)?；桓咂贩N限制品種限制不大，傳統(tǒng)扦插品種限制大插穗需求量對(duì)插穗需求量小傳統(tǒng)扦插對(duì)插穗需求量大操作管理與勞動(dòng)投入有優(yōu)勢(shì)無(wú)優(yōu)勢(shì)根系發(fā)達(dá)，成活率高不發(fā)達(dá)，成活率較低智能葉片智能模擬計(jì)算機(jī)豆腐菜（馬鞭草科）桂花（木樨科）葡萄（葡萄科）松（松科）2.4植物原生質(zhì)體制備與融合幾個(gè)概念：什么是原生質(zhì)體：？原生質(zhì)體制備：將旺盛生長(zhǎng)的植物細(xì)胞起來(lái)，懸浮在含滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中，加入適量的細(xì)胞壁水解酶，在一定條件下作用一段時(shí)間，使細(xì)胞壁破壞。除去細(xì)胞壁碎片、未作用的細(xì)胞等，即得。原生質(zhì)體培養(yǎng)是將植物原生質(zhì)體在一定條件下培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)細(xì)胞壁再生而形成細(xì)胞，再分裂成細(xì)胞團(tuán)的過(guò)程。2植物細(xì)胞工程植物原生質(zhì)體的特點(diǎn)（與植物細(xì)胞比）：仍然具細(xì)胞全能性：？（學(xué)生總結(jié)）吸收能力增強(qiáng)→利于….?（學(xué)生總結(jié)）分泌能力增強(qiáng)→利于….?（學(xué)生總結(jié)）穩(wěn)定性較差→不利于….?（學(xué)生總結(jié)）解決？原生質(zhì)體融合，即體細(xì)胞雜交。用人工的方法，把分離的不同品種或不同種的原生質(zhì)體誘導(dǎo)成融合細(xì)胞，再經(jīng)離體培養(yǎng)誘導(dǎo)分化和再生完整植株的整個(gè)過(guò)程。若取材為體細(xì)胞，則成為體細(xì)胞雜交。原生質(zhì)體制備和培養(yǎng)是原生質(zhì)體融合的先導(dǎo)技術(shù)2.4.1基本程序：原生質(zhì)體制備（材料的選擇、酶的使用、滲透壓的調(diào)控、原生質(zhì)體的收集與純化、原生質(zhì)體活力的測(cè)定）→原生質(zhì)體融合（自發(fā)融合、誘導(dǎo)融合）→雜種細(xì)胞選擇→雜種細(xì)胞培養(yǎng)→由雜種組織再生植株→雜種或胞質(zhì)雜種植株的鑒定2.4植物原生質(zhì)體制備與融合電融合法：不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問(wèn)題；二是融合效率高；三是融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便。PEG誘導(dǎo)融合法：融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。其缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。雜種細(xì)胞選擇設(shè)計(jì)一個(gè)選擇程序，使在某種條件下只有雜種細(xì)胞生長(zhǎng)，而任一親本卻不能在此條件下生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)速度緩慢、或中途夭折借助于精巧的顯微操作技術(shù)將融合體和雜種細(xì)胞直接挑選出來(lái)進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)1、外觀選擇·互補(bǔ)選擇·熒光標(biāo)記選擇2．體細(xì)胞雜種的鑒定2.4植物原生質(zhì)體制備與融合鑒定：通過(guò)雜種植株和親本植株的形態(tài)學(xué)特征來(lái)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定：雜種和親本的核型分析生化鑒定：雜種和親本的同工酶譜分析分子生物學(xué)的方法：RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定雜種植株和親本植株的其它特性2.4植物原生質(zhì)體制備與融合2.4.2細(xì)胞融合的意義克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，為廣泛重組遺傳物質(zhì)開(kāi)辟新途徑(如野生種的有效利用等）

可縮短育種年限利用細(xì)胞融合技術(shù)轉(zhuǎn)移細(xì)胞器（如葉綠體、線(xiàn)粒體等）及目的基因等。

2.4植物原生質(zhì)體制備與融合2.５人工種子（artificialseeds）的研制2.５.1合成種子（syntheticseeds）或體細(xì)胞種子（somaticseeds）任何一種繁殖體，無(wú)論是在涂膜膠囊中包裹的、裸露的或經(jīng)過(guò)干燥的，只要能夠發(fā)育成完整的植株，均可稱(chēng)之為人工種子。2植物細(xì)胞工程2.5.2優(yōu)點(diǎn)：2.5.2.1在無(wú)性繁殖植物中，有可能建立一種高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品種的種性，又可以使之具有實(shí)生苗的復(fù)壯效應(yīng)；2.5.2.2可以對(duì)優(yōu)異雜種種子不通過(guò)有性制種而快速獲得大量種子，特別是對(duì)于那些制種困難的植物更具有重要的實(shí)用意義；

·2.５人工種子的研制2.5.2.3對(duì)于一些不能正常產(chǎn)生種子的特殊植物材料如三倍體、非整倍體、基因工程植物等，有可能通過(guò)人工種子在短期內(nèi)加大繁殖應(yīng)用；2.5.2.4與田間制種相比，可以節(jié)省制種用地，且不受季節(jié)限制，可以實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，同時(shí)還避免了種子攜帶病原菌的危險(xiǎn)；2.5.2.5與利用試管苗相比，可以避免移栽困難，且可以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化操作，同時(shí)還便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。2.５人工種子的研制

2.5.3人工種子包被繁殖體的預(yù)處理（脫水干燥和強(qiáng)制休眠）→繁殖體的包埋(海藻酸鈉作包埋介質(zhì))→貯存與萌發(fā)2.５人工種子的研制2.5.4人工種子的發(fā)展和應(yīng)用前景2.5.4.1微器官人工種子可能最先用于無(wú)性繁殖植物2.5.4.2人工種子可用于天然種子繁殖后代群體變異大的植物2.5.4.3以體細(xì)胞胚為繁殖體應(yīng)用的可能性及需要注意的問(wèn)題2.５人工種子的研制小結(jié)：植物細(xì)胞工程的應(yīng)用快速繁殖：一片樹(shù)葉能變一座森林一年內(nèi)可從一個(gè)蘭花莖尖繁殖出400萬(wàn)株遺傳性狀均一的健康植株；花葉芋：常規(guī)繁殖：幾倍——幾十倍組培繁殖：幾萬(wàn)——數(shù)百萬(wàn)倍月季、菊花、牡丹、山茶等。植物育種胚培養(yǎng)：對(duì)遠(yuǎn)緣雜交后雜種胚早期敗育的雜種植物進(jìn)行胚培養(yǎng)，得到遠(yuǎn)緣雜種：如山茶花、百合和鳶尾等許多花卉。煙草與大豆、煙草與天仙子、矮牽牛與小花矮牽牛、番茄與矮牽牛都得到了雜種植株。單倍體育種：花粉培養(yǎng)，如在矮牽牛的育種中已應(yīng)用。芽變：如蘭花；綠色菊花花瓣培養(yǎng)——開(kāi)紫花的植株；玉簪嵌合體培養(yǎng)——金色斑點(diǎn)兼綠色斑點(diǎn)的植株；百合——四倍體：花大早花。體細(xì)胞突變體篩選：在組織培養(yǎng)過(guò)程中，植物的體細(xì)胞會(huì)發(fā)生各種各樣的變異。利用植物細(xì)胞的全能性，可以將突變細(xì)胞培養(yǎng)成完整的植株，從而豐富植物的遺傳變異，選育出新的品種和類(lèi)型。離體誘變育種：可采用愈傷組織誘變、花粉培養(yǎng)等多種方法，來(lái)進(jìn)行花卉育種。體細(xì)胞雜交和植物基因工程：如番茄與馬鈴薯的細(xì)胞融合。輻射育種培育無(wú)病毒苗(脫毒苗）脫毒花卉：去病毒后，植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，花朵變大，色澤鮮艷，抗逆能力提高，產(chǎn)花數(shù)量上升。預(yù)計(jì)在21世紀(jì)，這一技術(shù)的應(yīng)用將更為廣泛。如：蘭花、大麗花、水仙、天竺葵菊花等。脫毒馬鈴薯：增產(chǎn)40-200%(2000-2500kg/畝)。紅薯：增產(chǎn)30%以上。草莓：增產(chǎn)500-1000千克/畝植物種質(zhì)保存用組織培養(yǎng)方法保存愈傷組織、胚狀體、莖尖等組織：可節(jié)省大量人力和物力。也不會(huì)受自然環(huán)境的變化和病蟲(chóng)危害而流失。保存800個(gè)品種的葡萄種質(zhì)需占地15畝，維持費(fèi)用也十分昂貴。用試管保存，在溫度9℃以下，植株便暫停生長(zhǎng)，每年只需換轉(zhuǎn)1次。8OO個(gè)葡萄品種，每個(gè)品種重復(fù)6個(gè)，只需1平方米場(chǎng)所。如有需要，隨時(shí)可按極快速度再?gòu)?fù)制出來(lái)。有的在液氮（-196℃）中保存。P1772.6植物細(xì)胞工程研究進(jìn)展

（學(xué)生綜述）3動(dòng)物細(xì)胞工程3.1動(dòng)物細(xì)胞工程概述3.2動(dòng)物細(xì)胞工程的主要技術(shù)及其實(shí)踐意義單克隆抗體技術(shù)細(xì)胞核移植與動(dòng)物克隆染色體轉(zhuǎn)移干細(xì)胞研究3.3動(dòng)物細(xì)胞工程研究進(jìn)展與應(yīng)用3.1動(dòng)物細(xì)胞工程概述3.1.1動(dòng)物細(xì)胞特性3.1.1.1動(dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞比較3.1.1.2動(dòng)物細(xì)胞在活體內(nèi)的特性動(dòng)物細(xì)胞在胚胎期即已高度分化，而且這種分化是不可逆轉(zhuǎn)的，

·活體內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞按照分裂能力可以分為三大類(lèi)：

第一類(lèi)是能保持繼續(xù)分裂能力的細(xì)胞；

第二類(lèi)細(xì)胞群是永久失去分裂能力的細(xì)胞；

第三類(lèi)是靜止細(xì)胞群，即所謂的G0細(xì)胞。3動(dòng)物細(xì)胞工程3.1.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)要求3.1.2.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求溫度pH溶氧及氣體環(huán)境滲透壓3.1動(dòng)物細(xì)胞工程概述3.1.2.1動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求天然培養(yǎng)基其優(yōu)點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果好；缺點(diǎn)是成分復(fù)雜、個(gè)體差異大、來(lái)源有限。

·天然培養(yǎng)基的種類(lèi)主要包括生物性體液（如血清）、組織浸出液（如胚胎浸出液）、凝固劑（如血漿）、水解乳蛋白等。3.1.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)要求合成培養(yǎng)基·合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境中已知物質(zhì)在體外人工條件的模擬，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)篩選、強(qiáng)化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。

·合成培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：既能給細(xì)胞提供一個(gè)近似于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標(biāo)準(zhǔn)化體外生存環(huán)境。

·合成培養(yǎng)基的主要成分：氨基酸、維生素、糖類(lèi)、無(wú)機(jī)離子和其它輔助成分。3.1.2.1動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求3.2動(dòng)物細(xì)胞工程的主要技術(shù)及其實(shí)踐意義3.2.1單克隆抗體技術(shù)路線(xiàn)單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱(chēng)為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology)。3動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)路線(xiàn)抗體的檢測(cè)與雜交瘤選擇單克隆抗體的大量生產(chǎn)單克隆抗體的鑒定3.2.1單克隆抗體技術(shù)路線(xiàn)應(yīng)用廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病診斷（高度的特異性與靈敏性）。生產(chǎn)各種免疫疫苗（降低生產(chǎn)成本，增加了疫苗的安全性

）某些腫瘤的治療廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究3.2.2細(xì)胞核移植與動(dòng)物克隆細(xì)胞核移植技術(shù)：是一種利用顯微操作技術(shù)將一種動(dòng)物的細(xì)胞