細(xì)胞表面分子的檢測與分析

細(xì)胞表面分子的檢測與分析第一頁，共三十八頁，2022年，8月28日

醫(yī)學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中心柳衛(wèi)凰細(xì)胞表面分子的檢測與分析第二頁，共三十八頁，2022年，8月28日流式在細(xì)胞表面分子檢測中的應(yīng)用免疫細(xì)胞及其亞群的檢測與功能分析例如：T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞等血液系統(tǒng)細(xì)胞表面標(biāo)志的研究例如：急性白血病的初步診斷與檢測、CD34+造血干細(xì)胞研究、 血小板分析輔助診斷相關(guān)疾病等細(xì)胞群體及細(xì)胞表面標(biāo)志變化的監(jiān)測例如：測定因試驗(yàn)或臨床治療引起的某些細(xì)胞表面標(biāo)志的變化細(xì)胞表面標(biāo)志構(gòu)成性質(zhì)的分析例如：蛋白、糖蛋白、類脂結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、比例的分析第三頁，共三十八頁，2022年，8月28日標(biāo)本來源外周血

全血溶血、PBMC骨髓穿刺液

體液、灌洗液實(shí)體組織

新鮮組織、石蠟包埋樣本培養(yǎng)的細(xì)胞

原代細(xì)胞細(xì)胞系：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞

第四頁，共三十八頁，2022年，8月28日一、新鮮實(shí)體組織樣本的制備酶消化法。常用的酶類試劑：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等機(jī)械法。1、剪碎法2、網(wǎng)搓法3、研磨法化學(xué)處理法。常用試劑：0.2%EDTA0.25%胰酶+0.2%EDTA注意：除消化過程外，其余步驟最好在4度環(huán)境下操作，提高細(xì)胞活性。標(biāo)本制備第五頁，共三十八頁，2022年，8月28日

標(biāo)本制備二、全血標(biāo)本的制備

“ABC”溶血（Beckman）取肝素鈉抗凝的外周血100ul，熒光標(biāo)記完成后，依次加入A液600ul，輕輕振蕩15s；B液260ul,輕輕振蕩15s；C液100ul,振蕩10s，免洗上機(jī)檢測。

“ACK”溶血（自配）

以1：3的比例取肝素鈉抗凝的外周血與ACK溶血劑混勻，室溫放置10min，離心去上清，再加入溶血劑溶血，反復(fù)2～3次，至紅細(xì)胞完全溶解。細(xì)胞重懸后，再進(jìn)行熒光標(biāo)記。第六頁，共三十八頁，2022年，8月28日標(biāo)本制備三、外周血單個核細(xì)胞的制備（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理鹽水稀釋成4ml，混勻；（2）沿試管壁緩緩加入4ml淋巴細(xì)胞分離液Ficoll，勿用力過大；（3）離心2000r/min，20min，離心后分層，上層為血漿層，中層為分離液層，底層為紅細(xì)胞層；（4）用吸管將上層與中層之間的單個核細(xì)胞層吸出，用生理鹽水洗兩遍，PBS重懸；（5）熒光標(biāo)記。第七頁，共三十八頁，2022年，8月28日四、貼壁細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備（1）將培養(yǎng)細(xì)胞用0.04％EDTA或0.25％胰酶消化3～7分鐘，至光鏡下見到貼壁細(xì)胞變圓還沒有漂浮為止，棄消化液，加PBS；（2）用吸管將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來，移入離心管中；（3）離心，1000r/min，5min；（4）加PBS洗兩遍；（5）PBS重懸，將細(xì)胞吹打均勻；（6）熒光標(biāo)記。標(biāo)本制備第八頁，共三十八頁，2022年，8月28日標(biāo)記方法直接免疫熒光法

特點(diǎn)：操作簡單、省時；特異性強(qiáng)；結(jié)果判斷較簡單。間接免疫熒光法

特點(diǎn)：適用范圍廣；抗體相對便宜；操作費(fèi)時；易產(chǎn)生非特異性染色，結(jié)果不易判斷。（建議只用于單標(biāo)檢測）直接、間接混合染色法

染色原則：一般情況下先間接后直接，特殊情況下可先直接標(biāo)記。推薦！第九頁，共三十八頁，2022年，8月28日對照設(shè)置陰性對照調(diào)節(jié)熒光探測器放大倍數(shù)，確定帶測標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值。常用的有：同型對照、封閉抗體對照、陰性細(xì)胞對照陽性對照檢測抗體特異性或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性?？瞻讓φ?/p>

確定待測標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值或檢測染色方法是否成功。補(bǔ)償對照

多色熒光標(biāo)記時，用于熒光光譜重疊的調(diào)節(jié)。第十頁，共三十八頁，2022年，8月28日同型對照（IsotypeControl）用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標(biāo)記④相同劑量和濃度⑤由未免疫動物血清純化而來第十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日雙色標(biāo)記熒光補(bǔ)償口訣：橫平豎直第十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日熒光補(bǔ)償對照分析類型管功能加入的抗體單色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC雙色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PC55Sample1,2……A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-ECDγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-ECDγ1-PC55Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDD-PC56Sample1,2……A-FITCB-PEC-ECDD-PC5第十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日注意事項(xiàng)樣本的采集、儲存樣本的染色全血樣本的溶血效果流式實(shí)驗(yàn)對照的設(shè)置第十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日樣本的采集手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本取材時，要避免出血或組織壞死。深低溫保存，以免組織發(fā)生自溶，DNA降解，造成檢測結(jié)果的誤差。采集靜脈血樣本時，要避免發(fā)生溶血。收集培養(yǎng)的細(xì)胞時，要注意選擇消化的方法和試劑。第十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日樣本的儲存原則：時間越短越好肝素抗凝的外周血和骨髓：室溫≦72小時EDTA抗凝的標(biāo)本：室溫≦

24小時ACD抗凝的外周血：室溫≦

72小時ACD不推薦用作骨髓穿刺液的抗凝粒細(xì)胞、血小板功能檢測：即刻檢測單核細(xì)胞表面抗原分析：≦1小時，4℃嗜酸性粒細(xì)胞表面抗原分析：≦24小時，4℃淋巴細(xì)胞免疫表型與DNA含量的分析：≦72小時第十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日樣本的染色影響抗原抗體反應(yīng)的因素

電解質(zhì)、反應(yīng)溫度與時間、PH值（7.2～7.4）流式抗體的選擇

根據(jù)流式細(xì)胞儀的類型選擇抗體抗體應(yīng)用級別、滴度和使用量的選擇根據(jù)抗原表達(dá)量選擇抗體第十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日溶血，即裂解紅細(xì)胞。它是流式細(xì)胞術(shù)分析白細(xì)胞的先決條件。溶血不好，白細(xì)胞群不能很好分開，溶血好壞直接影響檢測結(jié)果。因此，必須對溶血過程進(jìn)行嚴(yán)格控制。

全血樣本：溶血效果很重要影響溶血的因素：采血過程溶血劑的使用實(shí)驗(yàn)操作過程第十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日第十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日結(jié)語流式細(xì)胞術(shù)的樣本制備沒有一個黃金標(biāo)準(zhǔn)最佳樣本制備方法需要根據(jù)具體情況獨(dú)立設(shè)定評估第二十頁，共三十八頁，2022年，8月28日常用的熒光染料熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光深紅PerCP 488 670免疫熒光深紅第二十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日參考書籍《實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)彩色圖譜》王書奎主編《流式細(xì)胞術(shù)基本原理與實(shí)用技術(shù)》梁智輝主編《臨床流式細(xì)胞分析》王建中主編《流式細(xì)胞術(shù)》杜立穎主編第二十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)：人外周血T淋巴細(xì)胞亞群的

檢測與分析第二十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞粒細(xì)胞這三群細(xì)胞分別由具有不同功能的細(xì)胞組成這些細(xì)胞數(shù)量不等，甚至非常稀少這些細(xì)胞表達(dá)不同的標(biāo)記物，是用來區(qū)分它們的基礎(chǔ)第二十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日T淋巴細(xì)胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時升高CD3+CD4-CD8-有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,其表達(dá)/T細(xì)胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時此細(xì)胞亞群較低CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細(xì)胞病菌感染時升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細(xì)胞,感染時升高感染時升高第二十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日活化T淋巴細(xì)胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+活化的B細(xì)胞過敏患者中升高CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞NK細(xì)胞CD3-CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低,而病毒感染時升高CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強(qiáng)烈征兆第二十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日1.取新鮮抗凝血100ul，置于FCM測量管中；2.直接標(biāo)記法：加入帶熒光標(biāo)記抗人的單克隆抗體10ul，充分混勻，4℃閉光孵育20～30min;3.加入溶血劑A液600ul,輕輕振蕩15s,加入溶血劑B液260ul,輕輕振蕩15s，加入溶血劑C液100ul,振蕩10s,上機(jī)檢測。

ACK溶血劑:加入2mlACK溶血劑，充分混勻，反應(yīng)5min,1000r/min離心5min，去上清；重復(fù)一遍，用PBS洗滌1遍，收集細(xì)胞上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)步驟第二十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日ABC溶血劑配方A:0.12%甲酸(超純水配置)B:碳酸鈉6.0g/L;氯化鈉14.5g/L;

硫酸鈉31.3g/L(超純水配置)C:多聚甲醛10.0g/L(PBS配置)第二十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日ACK溶血劑配方150mM(8.025g)

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