青霉素生產(chǎn)工藝專家講座

青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝菌種發(fā)酵工藝流程培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)控制提取精制

1青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第1頁青霉素類抗生素青霉素(Penicillin)又稱盤尼西林，是人類發(fā)覺第一個(gè)抗生素，也是當(dāng)前全球銷量最大抗生素。青霉素是β-內(nèi)酰胺類抗生素中一類，是分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞系列生長久起殺菌作用一類抗生素。一個(gè)高效、低毒、臨床應(yīng)用廣泛主要抗生素。它研制成功大大增強(qiáng)了人類抵抗細(xì)菌性感染能力，帶動(dòng)了抗生素家族誕生。2青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第2頁青霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)青霉素是β-內(nèi)酰胺類抗生素中一類，含有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)；是分子中含有青霉素母核（青霉烷）各種化合物總稱。分子結(jié)構(gòu)球棍模型β-內(nèi)酰胺環(huán)6-氨基青霉烷酸3青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第3頁青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝4青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第4頁青霉素制備普通流程圖菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾提取及精制成品檢驗(yàn)成品包裝前體發(fā)酵階段提取精制5青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第5頁菌種當(dāng)前國內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，依據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，慣用菌種為綠孢子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉素。6青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第6頁菌種青霉素最初生產(chǎn)菌為音符型青霉菌，生產(chǎn)能力僅為幾十個(gè)單位，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。以后發(fā)覺適合深層培養(yǎng)新菌種——產(chǎn)黃青霉，生產(chǎn)能力100U/ml，經(jīng)不停誘變選育，當(dāng)前平均生產(chǎn)能力66000-70000U/ml，國際最高生產(chǎn)能力已超100000U/ml。7青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第7頁青霉素產(chǎn)生菌生長過程分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒降低，小空孢大空孢自溶菌絲生長久青霉素分泌期菌絲自溶期8青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第8頁1－4期為菌絲生長久，3期菌體適宜為種子。

4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，經(jīng)過工程辦法，延長此期，取得高產(chǎn)。

在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。9青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第9頁青霉素發(fā)酵過程中代謝改變分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三個(gè)階段。菌體生長階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在適當(dāng)環(huán)境中經(jīng)過短時(shí)間適應(yīng)，即開始發(fā)育、生長和繁殖，直至到達(dá)菌體臨界濃度。青霉素合成階段：這個(gè)階段主要合成青霉素，青霉素生產(chǎn)速率到達(dá)最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個(gè)階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)生菌呼吸強(qiáng)度普通無顯著改變。菌體自溶階段：這個(gè)階段菌體衰老，細(xì)胞開始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基氮增加，PH上升。10青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第10頁絲狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程

冷凍管（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）——大米孢子（26°C，種子培養(yǎng)56h）——一級(jí)種子培養(yǎng)液（27°C，種子培養(yǎng)，24h）——二級(jí)種子培養(yǎng)液（27~26°C,發(fā)酵,7天）——發(fā)酵液。11青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第11頁青霉素發(fā)酵過程青霉素發(fā)酵時(shí)，青霉素生產(chǎn)菌在適當(dāng)培養(yǎng)基、PH、溫度和通氣攪拌等發(fā)酵條件下進(jìn)行生長并合成青霉素。發(fā)酵開始前，相關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體和無機(jī)鹽等）必須先經(jīng)過滅菌，后接入種子。在整個(gè)過程中，需要不停通氣和攪拌，維持一定罐溫和罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入泡沫劑，假如酸堿控制發(fā)酵液PH，還需要間歇或連續(xù)加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補(bǔ)充碳源及氮源，或補(bǔ)進(jìn)其它料液和前體等以促進(jìn)青霉素生產(chǎn)。12青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第12頁青霉素發(fā)酵發(fā)酵工藝控制：

1.基質(zhì)濃度

2.培養(yǎng)基成份控制

3.溫度

4.pH值、溶氧

5.菌絲狀態(tài)6.泡沫控制13青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第13頁發(fā)酵工藝控制

1.基質(zhì)濃度：

在發(fā)酵過程中，經(jīng)常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長產(chǎn)生抑制（如葡萄糖阻遏和抑制,苯乙酸生長抑制）,而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成。所以，在青霉素發(fā)酵中通常采取補(bǔ)料分批操作法，以維持一定最適濃度。14青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第14頁發(fā)酵工藝控制2.培養(yǎng)基成份控制:

A.碳源：發(fā)酵中慣用乳酸或葡萄糖。

乳糖最為廉價(jià)，但因貨源較少，很多國家采取葡萄糖代替。但當(dāng)葡萄糖濃度超出一定程度時(shí)，會(huì)過分加速菌體呼吸，以至培養(yǎng)基中溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，造成pH下降，影響一些酶活性，從而抑制微生物生長和產(chǎn)物合成。當(dāng)前普遍采取淀粉酶水解產(chǎn)物，葡萄糖化液流加，以降低成本。15青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第15頁發(fā)酵工藝控制B.氮源：

主要有機(jī)氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。

玉米漿為較理想氮源，含固體量少，有利于通氣及氧傳遞，因而利用率較高。有機(jī)氮源還能夠提供一部分有機(jī)磷，供菌體生長。無機(jī)氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。16青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第16頁發(fā)酵工藝控制C.無機(jī)鹽：碳酸鈣用來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生雜酸，并控制發(fā)酵液pH值為菌體提供營養(yǎng)無機(jī)磷源普通采取磷酸二氫鉀。另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需硫。鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵含量在30ug/mL以下?，F(xiàn)在還有一些工廠采取鐵罐發(fā)酵，在發(fā)酵過程中鐵離子便逐步進(jìn)入發(fā)酵液；發(fā)酵時(shí)間愈長，則鐵離子愈多。鐵離子在50μg/ml以上便會(huì)影響青霉素合成。所以青霉素發(fā)酵罐采取不銹鋼制造為宜。17青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第17頁發(fā)酵工藝控制D.前體：前體加入是青霉素發(fā)酵關(guān)鍵問題之一。添加苯乙酸或者苯乙酰胺，能夠借?；D(zhuǎn)移作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提升青霉素G生產(chǎn)強(qiáng)度。但苯乙酸對(duì)發(fā)酵有影響，普通以苯乙酰胺很好。也有采取苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價(jià)格較貴。前體要在發(fā)酵開始20h后加入，并在整個(gè)發(fā)酵過程中控制在50μg/ml左右。前體用量大于0.1%時(shí)，青霉素生物合成均下降。所以普通發(fā)酵液中前體濃度以一直維持在0.1%為宜。18青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第18頁發(fā)酵工藝控制3.溫度：

青霉素發(fā)酵最適溫度隨所用菌株不一樣可能稍有差異,但普通認(rèn)為應(yīng)在25°C左右。溫度過高將顯著降低發(fā)酵產(chǎn)率,同時(shí)增加葡萄糖維持消耗,降低葡萄糖至青霉素轉(zhuǎn)化率。對(duì)菌絲生長和青霉素合成來說,最適溫度不是一樣,普通前者略高于后者,故有發(fā)酵過程在菌絲生長階段采取較高溫度，以縮短生長時(shí)間,抵達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度,以利于青霉素合成。

19青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第19頁發(fā)酵工藝控制4.pH值、溶氧：

pH值：青霉素發(fā)酵最適pH值普通認(rèn)為在6.8～7.2左右,應(yīng)盡可能防止pH值超出7.0。因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定,輕易加速其水解。溶氧:對(duì)于好氧青霉素發(fā)酵來說,溶氧濃度是影響發(fā)酵過程一個(gè)主要原因。當(dāng)溶氧濃度降到30%飽和度以下時(shí),青霉素產(chǎn)率急劇下降,低于10%飽和度時(shí),則造成不可逆損害。溶氧濃度過高,說明菌絲生長不良或加糖率過低,造成呼吸強(qiáng)度下降,一樣影響生產(chǎn)能力發(fā)揮。在罐夾層或蛇管中需通冷卻水以維持一定罐溫。在整個(gè)發(fā)酵過程中，需不停通無菌空氣和攪拌，以維持一定罐壓或溶氧。20青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第20頁5.菌絲狀態(tài)：菌絲濃度：發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超出臨界菌體濃度,從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上到達(dá)平衡。菌絲生長速度：在葡萄糖限制生長條件下，當(dāng)比生長速率低于0.015h-1時(shí)，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比。所以,要在發(fā)酵過程中到達(dá)并維持最大比生產(chǎn)速率,必須使比生長速率不低0.015h-1。菌絲形態(tài)：青霉素產(chǎn)生菌分化主要呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。在絲狀菌發(fā)酵中,控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)分支和長度,并防止結(jié)球,是取得高產(chǎn)關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中,使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊,并盡可能降低游離菌絲含量,也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力關(guān)鍵素之一。21青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第21頁發(fā)酵工藝控制6.泡沫控制：

在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫,能夠用天然油脂,如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑“泡敵”來消泡。應(yīng)該控制其用量并要少許屢次加入,尤其在發(fā)酵前期不宜多用,不然會(huì)影響菌體呼吸代謝。

加消沫劑控制泡沫，必要時(shí)還加入酸、堿以調(diào)整發(fā)酵液pH。22青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第22頁染菌處理

染菌是發(fā)酵工業(yè)長久以來不能徹底處理問題，所以怎樣處理染菌問題就成了發(fā)酵工業(yè)工作重點(diǎn)之一。要處理染菌問題首要問題就是要能檢測(cè)出是否染菌。

染菌通常經(jīng)過三個(gè)路徑發(fā)覺：無菌試驗(yàn)，發(fā)酵液直接鏡檢，發(fā)酵液生化分析。其中無菌試驗(yàn)是判斷染菌主要依據(jù)。

23青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第23頁染菌處理染菌在發(fā)酵過程每個(gè)階段都可能發(fā)生，下面就各個(gè)不一樣階段染菌情況和處理方法一一說明。

⒈種子培養(yǎng)期染菌

⒉發(fā)酵前期染菌

⒊發(fā)酵中期染菌

⒋發(fā)酵后期染菌

24青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第24頁染菌處理⒈種子培養(yǎng)期染菌

種子培養(yǎng)主要是生長繁殖菌體。此時(shí)菌體濃度低，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，所以輕易染菌。種子培養(yǎng)期染菌，帶進(jìn)發(fā)酵罐中危害極大，應(yīng)嚴(yán)格控制種子污染。當(dāng)發(fā)覺種子受污染后均應(yīng)滅菌后棄去，并對(duì)種子罐、管道進(jìn)行檢驗(yàn)和徹底滅菌。返回25青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第25頁染菌處理⒉發(fā)酵前期染菌

發(fā)酵前朗主要是菌體生長繁殖，代謝產(chǎn)物生成極少，染菌后雜菌輕易繁殖，與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)成份和氧分，嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌生長繁殖和產(chǎn)物生成，所以要尤其注意發(fā)酵前期染菌。當(dāng)發(fā)酵前期染菌時(shí)，因?yàn)闋I養(yǎng)成份消耗不多，能耗也不大，從經(jīng)濟(jì)性角度考慮應(yīng)快速重新滅菌，補(bǔ)充必要營養(yǎng)成份，重新接種進(jìn)行發(fā)酵。返回26青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第26頁染菌處理⒊發(fā)酵中期染菌

發(fā)酵中期染菌將嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌代謝，影響產(chǎn)物生成。如產(chǎn)酸，產(chǎn)泡沫，使菌體自溶，使發(fā)酵液變臭等。發(fā)酵中期染菌，因?yàn)闋I養(yǎng)成份大量消耗，普通挽救處理困難，危害性大，發(fā)酵中期染菌應(yīng)做到早發(fā)覺，早處理，通常做法是“倒罐”，即用一罐沒有染菌發(fā)酵液與染菌發(fā)酵液混合，使有害菌濃度下降，生產(chǎn)菌濃度提升進(jìn)而重新成為優(yōu)勢(shì)生長菌群。顯然，倒罐必定造成物料消耗和操作費(fèi)用增加。

返回27青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第27頁染菌處理⒋發(fā)酵后期染菌

發(fā)酵后期產(chǎn)物積累較多，效價(jià)已經(jīng)很高，營養(yǎng)物質(zhì)靠近耗盡，此時(shí)如染菌量不多，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，如嚴(yán)重污染也可提前放罐，停頓發(fā)酵，這在經(jīng)濟(jì)上往往是合算。28青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第28頁下游操作過濾萃取脫色結(jié)晶29青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第29頁發(fā)酵液預(yù)處理青霉菌素發(fā)酵后，放罐，加少許絮凝劑沉淀蛋白，然后經(jīng)真空轉(zhuǎn)鼓過濾或板框過濾（青霉菌絲較粗，過濾較輕易），除掉菌絲體及部分蛋白，過濾收率普通在90%左右。青霉素易降解，發(fā)酵液及濾液應(yīng)冷卻至10℃低溫保留，備后續(xù)提取精制。通常發(fā)酵液中青霉素濃度很低，僅0.1%~4.5%左右，而雜質(zhì)濃度比青霉素高幾十倍甚至幾千倍。發(fā)酵液中常見雜質(zhì)有：菌絲、未用完培養(yǎng)基、易污染雜菌、產(chǎn)生菌代謝產(chǎn)物等。30青霉素生產(chǎn)工藝專家講座第30頁

提取溶媒萃取法

青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中，調(diào)整pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，重復(fù)幾次萃取