發(fā)酵條件優(yōu)化實驗

發(fā)酵條件優(yōu)化實驗第1頁/共21頁二、基本原理發(fā)酵條件中培養(yǎng)基的配置可參照前人的經(jīng)驗配方，再結(jié)合菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶等小發(fā)酵設(shè)備對碳、氮、無機因子等單因子逐個試驗，觀察這些因子對菌體生長和產(chǎn)物合成的影響，再綜合考慮各因素的影響。第2頁/共21頁

一個培養(yǎng)基設(shè)計的過程大約經(jīng)過以下幾個步驟：①根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分確定實驗時一些必須考慮的因素，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；③當(dāng)培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數(shù)可考慮用“正交試驗設(shè)計”等方法確定培養(yǎng)基的組分和濃度。第3頁/共21頁正交試驗法定義：用正交表安排多因素試驗與分析試驗結(jié)果的辦法，簡稱正交試驗。因素：影響試驗指標(biāo)的條件水平：因素所處的狀態(tài)第4頁/共21頁簡化試驗次數(shù)諸因素中哪些因素對指標(biāo)的影響較大，哪些因素較小。所考察的因素各取什么水平能使實驗指標(biāo)較好指標(biāo)在不同水平時的變化規(guī)律等正交試驗意義第5頁/共21頁

正交實驗設(shè)計是安排多因子的一種常用方法，通過合理的實驗設(shè)計，可用少量的具有代表性的試驗來代替全面試驗，較快地取得實驗結(jié)果。具體可以分為下面四步：①根據(jù)問題的要求和客觀的條件確定因子和水平，列出因子水平表；②根據(jù)因子和水平數(shù)選用合適的正交表，設(shè)計正交表頭，并安排實驗；③根據(jù)正交表給出的實驗方案，進行實驗；④對實驗結(jié)果進行分析，選出較優(yōu)的“試驗”條件以及對結(jié)果有顯著影響的因子。第6頁/共21頁

常用的正交表例如：

L4（23），L16（44），L27（313）正交表格式：Ln（tq）

L代表正交表，n代表實驗次數(shù)，

t代表因素水平數(shù)，q代表因素數(shù)。

常用的正交表可查閱有關(guān)統(tǒng)計學(xué)書籍直接套用。第7頁/共21頁正交表選擇依據(jù)：在能容納所研究的因素數(shù)和因素水平數(shù)的前提下選用試驗次數(shù)最少的正交表來安排試驗正交表安排試驗注意事項：盡可能使各因素的水平數(shù)相等，試驗的重復(fù)次數(shù)相當(dāng)。第8頁/共21頁例如考察細菌發(fā)酵產(chǎn)酸生產(chǎn)中最大糖酸轉(zhuǎn)化率，探索發(fā)酵最佳工藝，準備對葡萄糖、尿素、玉米漿和KH2PO4濃度進行優(yōu)化。（四因素）第9頁/共21頁正交設(shè)計表表頭設(shè)計

考察指標(biāo)：糖酸轉(zhuǎn)化率（％）第10頁/共21頁

L16(44)正交實驗

第11頁/共21頁正交實驗結(jié)果直觀分析第12頁/共21頁實驗結(jié)果分析各因素對產(chǎn)酸影響的大小順序為：葡萄糖>KH2PO4>尿素>玉米漿，各因素的水平為：A2，B3，C2，D3

由此最終確立了菌株的優(yōu)化配方：葡萄糖4％；尿素1.5％；玉米漿1％；KH2PO40.5％。第13頁/共21頁直觀分析優(yōu)點：簡便、計算工作量小直觀分析缺點：判斷因素效應(yīng)的精度不夠，也不能給出誤差的大小。第14頁/共21頁

三、實驗路線正交實驗配方設(shè)計配置液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)離心取沉淀（胞內(nèi)產(chǎn)物）細胞破碎溶解包涵體干擾素重組蛋白檢測第15頁/共21頁四、實驗材料一）菌種：重組大腸桿菌；二）培養(yǎng)基及試劑：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、溶菌酶、裂解緩沖液：50mMTris-HClpH7.5，50mMNaCl、2M尿素；三）其它材料：試管、接種環(huán)、高壓蒸汽滅菌鍋、光學(xué)顯微鏡、酒精燈、水浴搖床、離心機、冰箱等。第16頁/共21頁五、

實驗步驟１、將重組大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，做為液體種子備用；（老師已準備好）２、根據(jù)文獻和初步研究結(jié)果，確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉，其基礎(chǔ)濃度為１%、0.5%、1%；３、采用三因素、三水平正交實驗設(shè)計，配制9組不同培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，每組3個重復(fù)；（5ml/支）4、配PBS、裂解液、2M尿素第17頁/共21頁5、培養(yǎng)基、PBS121℃、20min高壓蒸氣滅菌，待冷卻后，按5%接種量接種，放入37℃液體搖床250rpm，3.5h后加入IPTG誘導(dǎo)后繼續(xù)震蕩培養(yǎng)5h；6、收集每管重組大腸桿菌菌液，3000rpm離心10min,棄上清，留沉淀，－20℃與室溫下反復(fù)凍融沉淀3次；7、細菌的裂解：將菌體沉淀混勻在9×體積PBS中，4℃孵育5min。3000rpm離心10min后，稱取菌體的濕重，每克濕重的菌體加入10ml裂解緩沖液，1mg溶菌酶重懸，充分混勻，37℃0.5h。

第18頁/共21頁8、洗滌與純化：12000rpm(擬為4000)離心10min,獲取沉淀，用2M尿素洗滌2次(擬刪)，得到包涵體的粗提物；9、稱取包涵體的重量，以此初步判斷每組培養(yǎng)條件下重組大腸桿菌的蛋白表達量；10、采用正交實驗直觀分析法進行實驗結(jié)果分析，確定較優(yōu)的培養(yǎng)基濃度。第19頁/共2