細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法

關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法第1頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

凝膠法方法分類 濁度法光度法顯色基質(zhì)法重現(xiàn)性好方法特性能定量能控制藥物的增強/抑制干擾操作簡便。節(jié)省時間第2頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五原理：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān).第3頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五第4頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)菌內(nèi)毒素檢測之凝膠法實驗程序1、試驗準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具2、內(nèi)毒素限值的確定3、確定最大有效稀釋倍數(shù)4、凝膠限度試驗5、結(jié)果判定第5頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五要求1、以最終產(chǎn)品為檢測必要（濃度超過0.5mg/ml）2、檢測樣品PH應(yīng)在6~8之間，不符應(yīng)調(diào)整第6頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五1、試驗準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具

儀器與器具電熱恒溫水浴鍋、定時鐘、去熱源槍頭和小玻璃瓶、移液槍、試管架、剪刀、錫箔紙。試劑細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、鱟試劑。第7頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五2、內(nèi)毒素限值的確定

L=K/M式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U表示；K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表示；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示。一般由供試品提供者直接提供內(nèi)毒素限值如1000EU。第8頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五3、確定最大有效稀釋倍數(shù)

（MVD）：MVD=cL/λ

式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；c為供試品溶液的濃度；λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml)。第9頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五3、鱟試劑靈敏度復(fù)核

按下表制備溶液A、B、C，使用稀釋倍數(shù)為MVD的供試品溶液來制備溶液A，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。

BCAA鱟試劑200ul100ul100ul100ul標(biāo)準(zhǔn)品100ul供試品100ul100ul第10頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五6、結(jié)果判定

將制備好的試劑用錫箔紙包裹好后放入電熱恒溫水浴鍋中，37℃恒溫水浴60min后觀察結(jié)果（保證玻璃瓶中溶液處于水面以下，并防止水進(jìn)入瓶中）。若陰性對照溶液B為陰性，陽性對照溶液C為陽性，試驗有效。若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定；若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試，復(fù)試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定；否則判定供試品不符合規(guī)定

第11頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五操作注意事項試驗前準(zhǔn)備：1、玻璃器具應(yīng)規(guī)范化，便于除熱原、計量準(zhǔn)確、清洗操作方便。2、用于內(nèi)毒素檢測的稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且保證無內(nèi)毒素。實驗環(huán)境：最好在潔凈室或潔凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，保證環(huán)境溫度、濕度及通風(fēng)穩(wěn)定。實驗人員：戴干凈手套和口罩。第12頁，共14頁，2023年，2月20日，星期五實驗過程：1、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)嚴(yán)格按要求低溫保存；工作標(biāo)準(zhǔn)品開封后盡快使用且應(yīng)一次性用完，不再保存。2、每一步稀釋液所用的移液器不能反復(fù)、交叉使用。3、鱟試劑復(fù)溶時應(yīng)將檢查用水順著瓶壁加入，避免產(chǎn)生氣泡。4