動物細胞工程北京中學內(nèi)部演示文稿

動物細胞工程北京中學內(nèi)部演示文稿當前1頁，總共62頁。優(yōu)選動物細胞工程北京中學內(nèi)部當前2頁，總共62頁。動物細胞工程常用技術手段

動物細胞培養(yǎng)：動物細胞工程的技術基礎

動物細胞核移植動物細胞融合生產(chǎn)單克隆抗體當前3頁，總共62頁。一、動物細胞培養(yǎng)概念：從動物機體中取出相關的組織，將它們分散成單個細胞，然后放在適宜的環(huán)境中，讓這些細胞生長和增殖。理論基礎：動物細胞可以在體外增殖當前4頁，總共62頁。（一）動物細胞培養(yǎng)的過程原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)當前5頁，總共62頁。動物細胞培養(yǎng)過程1.取胚胎或幼齡動物活組織或器官，如孵育13d或16d的雞蛋。2.胰蛋白酶使組織分散成單個細胞，配成懸浮液在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，這個過程叫原代培養(yǎng)。3.原代培養(yǎng)的細胞分瓶培養(yǎng)叫傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)10代后大部分死亡，少數(shù)能傳到40~50代。其中大部分細胞又不再分裂而衰老死亡，但少數(shù)細胞遺傳物質改變，并帶有癌變特點，能在培養(yǎng)條件下無限增殖。當前6頁，總共62頁。動物細胞培養(yǎng)過程的兩個現(xiàn)象細胞貼壁：懸液中分散的細胞貼附在瓶壁上生長。接觸性抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖。當前7頁，總共62頁。細胞貼壁過程當前8頁，總共62頁。細胞在貼壁生長過程中,隨著細胞分裂,數(shù)量不斷增加,最后形成一個單層,此時細胞間相互接觸,細胞分裂和生長停止。接觸抑制當前9頁，總共62頁。（二）動物細胞培養(yǎng)條件1、無菌、無毒的環(huán)境原因：1)離體的動物細胞失去了機體免疫系統(tǒng)的保護，非常容易被微生物感染；2)細胞在代謝過程中積累的產(chǎn)物不能及時排出，容易對自身造成毒害。措施：1)對培養(yǎng)液、操作工具、培養(yǎng)環(huán)境做無菌處理，在培養(yǎng)液中加適量抗生素；2）定期更換培養(yǎng)液。當前10頁，總共62頁。2、適宜的營養(yǎng)物——培養(yǎng)液培養(yǎng)液的成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、促生長因子、維生素、微量元素、動物血清等。當前11頁，總共62頁。適用于培養(yǎng)哺乳動物的典型培養(yǎng)基成分氨基酸精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸維生素生物素、膽堿、葉酸、煙酰胺、泛酸、硫胺素、維生素B6、核黃素鹽類NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2其它葡萄糖、青霉素、鏈霉素、酚紅、全血清當前12頁，總共62頁。3、溫度和pH：溫度：36.5℃

+/-0.5℃

pH值：。4、氣體環(huán)境：氧氣（細胞代謝必需）二氧化碳（維持pH），95%空氣加5%CO2混合氣體的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。當前13頁，總共62頁。動物細胞培養(yǎng)的有關問題培養(yǎng)的細胞為什么要取自動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織？動物細胞培養(yǎng)是否體現(xiàn)了細胞的全能性？為什么？組織細胞分散用胰蛋白酶，說明細胞間的連接物質的化學本質是什么？為什么要用胰蛋白酶，能用胃蛋白酶嗎？胰蛋白酶的處理時間能否隨機？為什么？動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基與植物組織培養(yǎng)基有什么不同？動物細胞培養(yǎng)基為什么要加動物血清？需要加什么動物血清？為什么？當前14頁，總共62頁。胰蛋白酶會消化細胞嗎？胰蛋白酶除了可以消化細胞間的蛋白質為，長時間作用也會消化細胞膜蛋白，對細胞有損傷作用；作用時間太短，細胞不容易脫落，因此必須控制好作用時間。實際應用中的處理：做預實驗，摸清效果最好時的胰蛋白酶的用量和作用時間。傳代代數(shù)與細胞的世代是一個概念嗎？不是一個概念。在細胞培養(yǎng)時，所說的“第10代細胞”僅指該細胞已經(jīng)傳代10次；細胞傳一代后，一般能倍增3-6次，經(jīng)過三個階段，即潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期。當細胞達到平臺期時，需要進行傳代培養(yǎng)，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至死亡。CO2培養(yǎng)箱的作用時什么？細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)箱一般稱為CO2培養(yǎng)箱，氣體環(huán)境95%空氣和5%CO2。作用是維持培養(yǎng)液的Ph。培養(yǎng)時，培養(yǎng)液中加入NaHCO3，來調(diào)節(jié)PH，NaHCO3有釋放CO2的傾向，培養(yǎng)箱中的CO2可以抑制反應，所以培養(yǎng)箱中的CO2濃度與培養(yǎng)液中NaHCO3濃度相平衡。如果將CO2改為O2是不行的，氧氣是氧化劑，濃度高會損傷細胞，培養(yǎng)時還常常加入一些抗氧化劑等。當前15頁，總共62頁。（三）動物細胞培養(yǎng)技術的應用生產(chǎn)蛋白質生物制品，如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體。培養(yǎng)基因工程中使用的受體細胞。培養(yǎng)細胞用于體外檢測有毒物質，判斷物質的毒性。如檢測致畸、致癌物質。培養(yǎng)各種正常的或病變的細胞，用于生理、病例、藥理等方面研究，為治療和預防疾病提供理論依據(jù)。如為皮膚大面積燒傷病人培養(yǎng)皮膚細胞進行皮膚移植。當前16頁，總共62頁。ESC典型的不對稱分裂,具慢周期性和高增殖性.ESC的標記蛋白是角蛋白K19.

組織工程皮膚是一個極熱門的話題.如體外培養(yǎng)表皮和真皮,用以修補皮膚損傷.

表皮干細胞.ESC當前17頁，總共62頁。人耳小白鼠當前18頁，總共62頁。組織工程鼻軟骨當前19頁，總共62頁。組織工程耳軟骨當前20頁，總共62頁。熒光標記的小鼠細胞和人細胞融合實驗原理：細胞膜的流動性當前21頁，總共62頁。二、動物細胞融合與單克隆抗體（一）動物細胞融合概念：是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程，也叫動物細胞雜交。融合后形成的具有兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞。當前22頁，總共62頁。1、動物細胞融合的過程具有不同DNA的兩個細胞滅活病毒誘導細胞融合（先質后核）融合后的雜交細胞進行有絲分裂當前23頁，總共62頁。問題為什么滅活的病毒可作為誘導動物細胞融合的誘導劑？不滅活的病毒能作為誘導劑嗎？

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。不滅活的病毒會感染細胞，不能誘導細胞融合。當前24頁，總共62頁。仙臺病毒用作融合劑的病毒必須先用紫外線或β-丙內(nèi)酯滅活，以使其感染活性散失，同時保留融合活性。用滅活的仙臺病毒誘導融合的效率高，對各種動物細胞都適用，并且能在雞胚中大量培養(yǎng)。但是仙臺病毒不穩(wěn)定，保存中融合活性易降低，且制備麻煩，所以實際常用聚乙二醇誘導融合或電場誘導融合。當前25頁，總共62頁。

細胞融合過程中兩個細胞膜的變化當前26頁，總共62頁。顯微鏡下的細胞融合過程

當前27頁，總共62頁。物理方法：離心、振動、電激化學方法：PEG生物方法：滅活的病毒（如仙臺病毒）誘導動物細胞融合的常用方法當前28頁，總共62頁。形成雜交細胞獲得雜種植株結果物理、化學方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學（聚乙二醇）誘導方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性、植物細胞全能性原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目植物體細胞雜交與動物細胞融合的比較融合前處理用纖維素酶、果膠酶去壁用胰蛋白酶使細胞分散當前29頁，總共62頁。2、動物細胞融合的意義和應用

意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。

應用：用于研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等，特別是利用雜交瘤技術制造單克隆抗體。當前30頁，總共62頁。（二）單克隆抗體技術抗體是怎樣產(chǎn)生的？問題

每一個B淋巴細胞只合成和分泌一種特異性抗體。當前31頁，總共62頁。產(chǎn)量低、純度低，特異性差、靈敏度低?？贵w的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的不足：思考：如何大量獲取某一種特定抗體？當前32頁，總共62頁。科勒GeorgesJ.F.K?hler德國巴塞爾免疫研究所

1946年--1995年米爾斯坦CésarMilstein英國英國醫(yī)學研究委員會

分子生物實驗室1927年--榮獲1984年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎1975年發(fā)明單克隆抗體技術當前33頁，總共62頁。

設計方案：一個B淋巴細胞－－只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細胞－－能無限增殖單克隆抗體既能分泌特異性抗體，又能無限增殖的雜交瘤細胞當前34頁，總共62頁。單克隆抗體制備過程當前35頁，總共62頁。雜交瘤細胞1雜交瘤細胞2雜交瘤細胞3Mab1Mab2Mab3抗原當前36頁，總共62頁。單克隆抗體制備提取單克隆抗體B淋巴細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)分泌特異性抗體大量增殖滅活仙臺病毒或PEG當前37頁，總共62頁。BBBB瘤瘤瘤瘤１、細胞融合后培養(yǎng)液中有幾種細胞？篩選雜種細胞思考：雜交瘤細胞２、制備過程中應用哪些細胞工程技術手段？細胞融合技術、細胞培養(yǎng)技術當前38頁，總共62頁。第一次篩選得到雜交瘤細胞細胞合成DNA有兩條途徑：一為主要途徑，利用糖和氨基酸合成核苷酸，氨基碟呤可阻斷該途徑；二為補救途徑，通過磷酸核糖轉化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷合成核苷酸。骨髓瘤細胞缺乏HGPRT和TK，只能通過一途徑合成核苷酸而增殖。淋巴細胞具備兩條途徑，但不能無限增殖。使用選擇培養(yǎng)基---HAT培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（Hypoxathine）、胸腺嘧啶核苷(Thymidine)、氨基喋呤（Aminopterin）。在HAT培養(yǎng)基中，小鼠瘤細胞因不能合成核苷酸而死亡，B淋巴細胞壽命有限也自然死亡，只有雜交瘤細胞從B細胞獲得HGPRT或TK基因,表達得到HGPRT或TK，利用二途徑合成核苷酸而無限增殖，能在HAT培養(yǎng)基上生長繁殖。所以最后存活下來的一定是雜交瘤細胞。當前39頁，總共62頁。第二次篩選出一個只產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤細胞。陽性克隆篩選：用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢驗特異性抗體單克隆抗體的擴大生產(chǎn)：（1）腹腔積液型（2）細胞生物反應器當前40頁，總共62頁。單克隆抗體的概念單:

單個細胞克隆:

無性繁殖抗體:

化學性質單一、特異性強單克隆抗體的概念：是指單個雜交瘤細胞無性繁殖（克隆）形成的細胞系產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體的優(yōu)點特異性強、靈敏度高、能大量制備當前41頁，總共62頁。①診斷疾?。ㄗR別作用，如同位素標記單克隆抗體，可診斷腫瘤、心血管畸形等）

單克隆抗體的應用優(yōu)點：準確、高效、簡易、快速②用于治療疾病和運載藥物（主要用于癌癥治療，也可運載藥物，如“生物導彈”）（導向作用，作為載體，生物導彈=單克隆抗體+藥物，治療腫瘤）（位置準確、療效高、副作用?。┊斍?2頁，總共62頁。人的單克隆抗體生產(chǎn)存在許多問題：①致敏問題人們努力尋求的抗體往往是針對有毒抗原的，無法直接用這樣的抗原去刺激某人體，并試圖獲得相應的B淋巴細胞。②雜交瘤細胞不穩(wěn)定目前世界上已建立一些人骨髓瘤細胞株，它們和人的淋巴細胞融合后也能產(chǎn)生抗體，然而未能獲得像小鼠骨髓瘤系那樣理想的株系。產(chǎn)生的雜交瘤細胞存在也不夠穩(wěn)定，抗體效價也不夠理想。③抗體的生產(chǎn)問題已建株的細胞在體外培養(yǎng)較困難，若能在體內(nèi)培養(yǎng)則較容易，這對于動物可以，然而用人的腹腔液培養(yǎng)就不可能。④轉化細胞不穩(wěn)定用病毒轉化B淋巴細胞細胞也可建立細胞株系，但傳代后只有小部分細胞分泌特異抗體，且細胞隨傳代遞減，很難建立起長期穩(wěn)定的細胞株。人—鼠細胞雜交也可以，但隨著細胞的分裂，人的染色體會大量丟失。當前43頁，總共62頁。問題我們能否利用類似植物組織培養(yǎng)獲得完整植物體的方法培養(yǎng)動物細胞，使其發(fā)育成一個完整的個體？

不能，高度分化的植物細胞仍保持著全能性，而動物細胞的全能性會隨細胞分化程度的提高逐漸受到限制，分化潛能逐漸變?nèi)?。所以目前還不能利用類似植物組織培養(yǎng)的方法獲得完整的動物體。當前44頁，總共62頁。多莉與威爾莫特當前45頁，總共62頁。三、動物體細胞核移植和克隆動物概念：將動物的一個細胞(供體細胞)的細胞核，移入另一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞(受體細胞)中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體。理論基礎：動物細胞(核)的全能性克隆動物：用核移植方法培育的動物。當前46頁，總共62頁。（一）哺乳動物核移植的類型

胚胎細胞核移植體細胞核移植容易困難當前47頁，總共62頁。（二）體細胞核移植的過程（以高產(chǎn)奶牛為例）體細胞培養(yǎng)取出核甲牛乙牛MⅡ卵母細胞去除核去核卵母細胞重組卵細胞核植入卵裂早期胚胎代孕母牛丙移植體細胞群克隆牛細胞核移植胚胎移植物理或化學方法激活當前48頁，總共62頁。顯微操作儀當前49頁，總共62頁。細胞核的吸取當前50頁，總共62頁。1切開卵母細胞透明帶2擠出卵母細胞細胞核3注入供體細胞核4電融合儀融合培養(yǎng)12345當前51頁，總共62頁。

受體細胞為減數(shù)分裂第二次分裂中期（MⅡ）的卵母細胞。重組細胞需通過物理或化學方法激活，從而完成細胞分裂和發(fā)育進程。體細胞核移植的技術操作過程主要包括核供體細胞和核受體細胞的處理和制備、核移植、構建重組胚胎、胚胎移植等步驟。當前52頁，總共62頁。問題用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞，這是為什么？

培養(yǎng)的動物細胞一般當傳代至10～50代左右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞遺傳物質也可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細胞核移植中，為了保證供體細胞正常的遺傳基礎，通常采用傳代10代以內(nèi)的細胞。當前53頁，總共62頁。問題利用體細胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復制嗎？為什么？

克隆動物DNA主要來自于供體細胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵母細胞。所以用體細胞核移植方法克隆的動物并不是供核動物完全相同的復制。當前54頁，總共62頁。當前55頁，總共62頁?？寺〖夹g的設想是由德國胚胎學家于1938年首次提出的，1952年，科學家首先用青蛙開展克隆實驗，之后不斷有人利用各種動物進行克隆技術研究。

自從1996年世界第一只體細胞克隆動物小羊“多利”誕生后，各種克隆動物如雨后春筍般地紛紛問世。

蛙：青蛙是第一種被用于克隆實驗的動物。1952年，科學家首次通過從發(fā)育到后期的胚胎中提取細胞核進行克隆實驗，但失敗了。1970年，英國生物學家用同樣方法嘗試克隆，結果青蛙卵發(fā)育成了蝌蚪，但它在開始進食以后就死亡。

鼠：第一只體細胞克隆鼠名叫“卡繆麗娜”，1997年10月3日出生。目前日本、英國、美國和意大利等國的科學家已經(jīng)獲得了“克隆的克隆”的第二及第三代克隆鼠。世界克隆動物誕生記當前56頁，總共62頁。牛：能都和加賀是最早的兩頭體細胞克隆牛，1998年7月5日出生在日本。盡管這兩頭牛早產(chǎn)近40天，但發(fā)育正常。

猴：在目前所有克隆動物中，猴子在基因上與人類最接近。2000年1月，美國科學家宣稱第一次成功地克隆出靈長類動物———一只名為“泰特拉”的克隆猴。

豬：體細胞克隆羊與克隆鼠誕生后，科學家就計劃克隆豬。首批體細胞克隆豬共5只，出生于2000年3月5日。

貓：2002年初，世界上第一只體細胞克隆貓誕生了，名為CC。CC的皮毛顏色