抗體工程技術(shù)

關(guān)于抗體工程技術(shù)第1頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四2、抗體類型1、多克隆抗體(polyclonalantibody)

早期人工制備抗體的主要方法，以相應(yīng)抗原免疫動(dòng)物，由此產(chǎn)生的抗體是針對(duì)多種抗原決定簇（表位）的混合抗體，故稱之為多克隆抗體。

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第一節(jié)抗體制備第2頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四3優(yōu)點(diǎn)：來源廣泛、制備容易缺點(diǎn)：特異性不高、易發(fā)生交叉反應(yīng)第3頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四4多克隆抗體1890年Behring和Kitasato發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立免疫療法，開創(chuàng)了抗體制藥之先河。白喉外毒素→免疫動(dòng)物→抗毒素→治白喉Behring(德,1854～1917）第4頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四5目前治療性抗體產(chǎn)品：精制破傷風(fēng)毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。

綠膿免疫血漿抗體制劑第5頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四6多克隆抗體的制備根據(jù)不同的免疫原，選擇不同的免疫方案。免疫方案免疫途徑免疫程序動(dòng)物選擇第6頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四7

細(xì)胞融合，又稱體細(xì)胞雜交是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過程。在適當(dāng)?shù)臈l件下，細(xì)胞融合在一起，產(chǎn)生具有原來兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybridcell）。2、細(xì)胞融合技術(shù)和單克隆抗體第7頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四8顯微鏡下細(xì)胞融合過程第8頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四9Muller于1838年觀察到脊椎動(dòng)的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。細(xì)胞融合研究進(jìn)展第9頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四101975年，Kohler和Milstein應(yīng)用小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊細(xì)胞致敏的小鼠脾細(xì)胞融合，得到的一部分融合雜交細(xì)胞既能繼續(xù)生長，又能分泌抗羊紅細(xì)胞抗體，將這種雜交細(xì)胞系統(tǒng)稱為雜交瘤細(xì)胞，應(yīng)用這種方法可制備單一抗原決定簇的單克隆抗體。第10頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四11一、何謂單克隆抗體？第11頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四12

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由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體，稱單克隆抗體第12頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四13第13頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四14第14頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四15第15頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四16單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology

）。第16頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四17NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

第17頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四18雜交瘤技術(shù)的基本原理第18頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四19

3、基因工程抗體基因工程抗體即將抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工、改造和重新裝配，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的抗體分子。

第19頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四20基因工程抗體與單克隆抗體相比的優(yōu)點(diǎn)：

通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)?；蚬こ炭贵w的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；根據(jù)治療的需要，制備新型抗體?？梢圆捎迷思?xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)方式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。第20頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四21整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)

基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)

噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)技術(shù)第21頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四22

經(jīng)過免疫的哺乳類動(dòng)物單一的B淋巴細(xì)胞，可以合成分泌單一性的抗體，我們稱這種具有特異性的、同質(zhì)性的抗體為單克隆抗體。二、McAb技術(shù)基本原理第22頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四23改變B淋巴細(xì)胞遺傳特性建立永久生長和能分泌McAb細(xì)胞系的途徑

病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞雜交第23頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四24骨髓瘤細(xì)胞選擇骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第24頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四25*融合細(xì)胞的選擇原理

1964年Litterlefield首先發(fā)明HAT選擇性培養(yǎng)基。

H：Hypoanthine次黃嘌呤

A：Aminopterin氨基喋呤

T：Thymidine胸腺嘧啶脫氧核苷原理：正常細(xì)胞不但具有利用培養(yǎng)液中的谷酰胺和尿核苷單磷酸合成DNA的能力,且當(dāng)這條主要途徑被氨基喋呤（A）阻斷時(shí)，還具有利用培養(yǎng)液中現(xiàn)成的次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶脫氧核苷（T）在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的作用下，借此替代通路來合成DNA的能力。第25頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四26三、McAb技術(shù)的特點(diǎn)1、高度特異性2、高度穩(wěn)定性

3、高抗體活性

4、不可知性5、過于單一性第26頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四27★四、McA制備的基本方法

（一）抗原提純與動(dòng)物免疫第27頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四28（二）骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備對(duì)數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0(HGPRT缺陷株)的準(zhǔn)備脾細(xì)胞的準(zhǔn)備第28頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四29融合前骨髓瘤細(xì)胞:細(xì)胞狀態(tài)渾圓透亮、大小均一、邊緣清晰、排列整齊、呈半致密分布第29頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四30（三）細(xì)胞融合融合過程須注意問題1、細(xì)胞比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞比例為1：42、反應(yīng)時(shí)間：混合細(xì)胞的離心管中30s內(nèi)加入1ml37℃預(yù)溫的50％PEG，邊加邊輕輕搖動(dòng)離心管，作用90s，然后加入預(yù)溫的37℃的DMEM不完全培養(yǎng)液終止PEG作用，800r/min離心6min，棄上清。3、培養(yǎng)液成分第30頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四31（四）篩選和克隆有限稀釋法(稀釋至0.8個(gè)細(xì)胞/孔)（五）單克隆抗體的制備和凍存（六）單克隆抗體的純化（制備方法：體內(nèi)培養(yǎng)、體外培養(yǎng)）（鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、

親和層析、酸沉淀）第31頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四32★四、McA制備的基本方法

第32頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四33★五、單克隆抗體的應(yīng)用1、作為親合層析的配體2、作為生物治療的導(dǎo)向武器3、作為免疫抑制劑

通過親和層析可從復(fù)雜的混合物中分離、純化某一特定成分McAb所帶藥物只作用于靶組織器官抗人的T淋巴細(xì)胞單抗用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)第33頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四344、作為研究工作中的探針5、增強(qiáng)抗原的免疫原性6、作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)試劑（1）診斷各類病原體（2）腫瘤特異性抗原和相關(guān)抗原檢測（3）檢測淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志（4）機(jī)體微量成分的測定第34頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四35CJPEB1重組蛋白的表達(dá)及

單克隆/多克隆抗體的制備鑒定第35頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四36課題的思路及目的誘導(dǎo)培養(yǎng)基因工程菌E.coliBL21(DE3)高效表達(dá)CJPEB1重組蛋白鎳瓊脂糖層析柱純化表達(dá)后的重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備單抗免疫新西蘭兔制備多抗為建立血清學(xué)方法檢測CJ創(chuàng)造條件

第36頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四37一、SDS鑒定純化后的PEB1蛋白123456M78910圖1.SDS–PAGE鑒定純化后的PEB1蛋白

表達(dá)的蛋白通過鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化后，經(jīng)SDS鑒定，蛋白質(zhì)分子量大小與預(yù)計(jì)的理論值相符，和本室前期的研究結(jié)果一致，PEB1重組蛋白純度高。1～2：咪唑濃度為50mmol/L時(shí)洗脫的蛋白3～4：咪唑濃度為100mmol/L時(shí)洗脫的蛋白5～6：咪唑濃度為200mmol/L時(shí)洗脫的蛋白M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量7～8:咪唑濃度為300mmol/L時(shí)洗脫的蛋白9～10:咪唑濃度為400mmol/L時(shí)洗脫的蛋白97.4kd66.2kd42.7kd31kd14.4kd第37頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四38PEB1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定常規(guī)免疫BALB/C小鼠制備單克隆抗體第38頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四39-a-b-c-d

-a

-b

-c

-d抗原決定簇BALB/Cabbcd

脾臟產(chǎn)生各種

B細(xì)胞與佐劑乳化免疫采血收集血清作為篩選時(shí)陽性對(duì)照無菌取脾臟收集B細(xì)胞抗原通常有多個(gè)抗原決定簇免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射四次PEB1蛋白第39頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四40-d-a-b-c-dPEB1蛋白ELISAHATPEG細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞（亞克?。?/p>

(確定只有單個(gè)細(xì)胞)-d-c-b-a-dSP2/0骨髓瘤細(xì)胞Bcell脾細(xì)胞培養(yǎng)篩選只識(shí)別一個(gè)抗原決定簇

abbcd合混胞細(xì)選篩抗單第40頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四41單克隆抗體的獲得及鑒定細(xì)胞克隆的形成和雜交瘤細(xì)胞的篩選

圖2.融合后第二天骨髓瘤細(xì)胞對(duì)照孔圖3.融合后第二天細(xì)胞融合孔第41頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四42圖4.融合后第三天細(xì)胞融合孔圖5.融合后第八天細(xì)胞融合孔第42頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四43

圖6.間接ELISA篩選抗體陽性孔

第43頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四44

通過有限稀釋法和ELISA法進(jìn)行連續(xù)克隆篩選后獲得兩株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1D7A5株和5G2B3株。第44頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四45

圖8.1D7A5株分泌抗體的亞型圖9.5G2B3株分泌抗體的亞型第45頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四46

1D7A5株和5G2B3株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)間接ELISA法檢測，腹水中的抗體效價(jià)分別為1:8×104和1:5×104。

兩株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測，腹水中的抗體效價(jià)均為1:8。第46頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四47運(yùn)用小鼠單抗分型試劑盒確定雜交瘤細(xì)胞所分泌的單抗的亞型。將建株的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔誘生腹水。應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測的腹水中單抗的效價(jià)。通過Western-blot和玻片凝集試驗(yàn)檢測單抗的特異性。第47頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四48免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示：2株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗，可以與PEB1蛋白特異性結(jié)合。通過DAB顯色出現(xiàn)特異性條帶并且無雜帶出現(xiàn)。1234M

1～2：未經(jīng)純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合3～

4：純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量圖10.western-blot檢測單抗特異性97.4kd66.2kd43kd31kd20kd14.4kd第48頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四49細(xì)菌名稱雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水SP2/0細(xì)胞誘生的腹水空腸彎曲菌++－大腸桿菌－－痢疾桿菌－－傷寒桿菌－－產(chǎn)氣莢膜桿菌－－變形桿菌－－葡萄球菌－－表1.玻片凝集試驗(yàn)檢測單抗的特異性結(jié)果第49頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四50三、PEB1蛋白多克隆抗體的制備及鑒定免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。第50頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四51123412431234PEB1蛋白與佐劑完全乳化待血凝完全離心收集血清鹽析法粗提兔IgG抗體第51頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四52應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測多克隆抗體抗體的效價(jià)。通過Western-blot和玻片凝集試驗(yàn)檢測多克隆抗體的特異性。第52頁，共57頁，2023年，2月20日，星期四53

多克隆抗體的效價(jià)檢測及鑒定動(dòng)物編號(hào)0W2W4W6W7W8W兔101:101:102

1:6×1031:8×1031:1.5×104兔201:101:5×102

1:8×1031:1×1041:2×104兔301:101:5×1021:8×1031:1.2×104