評價生物素營養(yǎng)的主要技術(shù)綜述,營養(yǎng)學(xué)論文

評價生物素營養(yǎng)的主要技術(shù)綜述,營養(yǎng)學(xué)論文生物素〔biotin〕又稱維生素H、維生素B7,是一種水溶性維生素，廣泛分布于動植物組織。生物素作為哺乳動物體內(nèi)5種羧化酶的輔酶，介入糖原異生、脂肪酸合成、氨基酸分解和能量的代謝[1-2].生物素能夠通過介入組蛋白的生物素化，來介入染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)及組蛋白修飾的下游事件[3-4],影響胰島素分泌，導(dǎo)致糖尿病、免疫性疾病[5]的發(fā)生。哺乳動物腸道細菌能夠產(chǎn)生生物素[6],人體一般不需從食物中額外補充，故生物素漸漸成為被遺忘的維生素。服用抗驚厥藥物[7]、不當(dāng)飲食習(xí)慣〔長期食用生雞蛋清、吸煙、飲酒等〕致腸道菌群正常活動受損，或者先天性生物素相關(guān)酶的缺乏〔如羧化酶全酶合成酶，HCS〕可致生物素缺乏，主要表現(xiàn)為皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)異常感覺和狀態(tài)，患者表現(xiàn)為不同程度的體重減輕、脫發(fā)、脂溢性皮炎、結(jié)膜炎等。多種動物實驗結(jié)果表示清楚生物素缺乏還有致畸[8-9]、致死作用。直到21世紀(jì)初美國MOCK等[10-12]通過測定孕期婦女血清生物素和尿中3-羥基異戊酸〔3-hydroxyisovalericacid,3HIA〕含量，指出盡管膳食攝入正常含量生物素，仍有近1/2的孕婦出現(xiàn)生物素缺乏的現(xiàn)象。生物素再次引起人們的關(guān)注，并使得有關(guān)生物素生理狀況的評價技術(shù)成為研究的熱門。部分學(xué)者使用血尿中?；鈮A含量[13]的變化來判定生物素營養(yǎng)狀況。然而關(guān)于生物素營養(yǎng)狀況指標(biāo)測定方式方法較多，各方式方法之間的關(guān)聯(lián)性、評價技術(shù)的敏感性和特異性以及各種指標(biāo)正常范圍值尚未有統(tǒng)一結(jié)論，因而本文對生物素營養(yǎng)狀況評價技術(shù)的相關(guān)研究進展做一綜述。1生物素在體內(nèi)的代謝途徑生物素通過與體內(nèi)羧化酶上賴氨酸殘基的ε-氨基基團共價結(jié)合構(gòu)成羧化酶的輔酶，即丙酰輔酶A羧化酶〔PCC〕、乙酰輔酶A羧化酶〔ACC〕、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶〔MCC〕和丙酮酸羧化酶〔PC〕,介入體內(nèi)氨基酸代謝、脂肪酸合成和糖代謝[1-2]經(jīng)過。哺乳動物體內(nèi)生物素通過介入羧化酶的正常代謝，轉(zhuǎn)化為雙降生物素、生物素硫氧化物以及生物素砜等[3].當(dāng)羧化酶的活性下降時，生物素的代謝通路發(fā)生變化。ACC活性下降，丙二酰輔酶A活性改變，生成較多乙酰肉堿和丙酰肉堿。實驗證明3HIA和3HIA-肉堿是亮氨酸代謝的產(chǎn)物，當(dāng)3-甲基巴豆酰輔酶A活性下降時，MCC代謝途徑變化，生成較多的3HIA和3HIA-肉堿。而3-甲基巴豆酰輔酶A的活性與生物素的水平密切相關(guān)，因而MOCK建議使用尿液中有機酸的含量來表示生物素的營養(yǎng)狀況。2生物標(biāo)志物的選擇血清和尿液中生物素的濃度及其代謝產(chǎn)物可作為生物素營養(yǎng)狀況的潛在標(biāo)志物。研究表示清楚，外周血淋巴細胞生物素依靠羧化酶活性能夠較早反響人體生物素邊緣性缺乏。同時最新研究表示清楚羧化酶MCC活性下降可導(dǎo)致機體血漿和尿液中3HIA、3HIA-肉堿等有機酸含量增加，可作為評價早期生物素營養(yǎng)缺乏的敏感指標(biāo)。3生物素營養(yǎng)狀況評價方式方法3.1微生物法微生物法一直是生物素分析的傳統(tǒng)方式方法，其原理是在一定生長條件下，利用特殊細菌生長與生物素含量之間的線性關(guān)系測定血漿和尿液中總的生物素含量。微生物法靈敏性強，能夠測定具有生物活性的生物素，但是無法區(qū)分生物素的衍生物及代謝形式，無法了解生物素代謝經(jīng)過中的變化，容易低估生物素的生物利用率，且測定經(jīng)過比擬繁瑣，測試周期長，結(jié)果重復(fù)性差，因而同次實驗內(nèi)結(jié)果比擬尚可，但是不同實驗間的橫向比擬結(jié)果差異較大，推廣應(yīng)用受限。3.2酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗〔ELISA〕,利用生物素與鏈霉親和素的強親和力，通過特異性辨別來檢測生物素的含量，是一種通用的測定方法。MISHRA等[14]采用生物素與鏈霉素親和素標(biāo)記的過氧化物酶的競爭反響，測定鏈霉素親和素過氧化物酶的含量來間接測定生物素的含量。結(jié)果顯示健康成年男性和女性尿中生物素含量分別為〔9.05.4〕及〔7.02.1〕mol/mol肌酐，該方式方法在100~1000pmol/L的回收率分別為108%及112.5%,對實驗結(jié)果存在高估現(xiàn)象。ELISA法專一性強，快速且靈敏，能夠自動化；但是試劑盒價格昂貴，結(jié)果受操作因素影響較大，結(jié)果不穩(wěn)定。3.3H14CO3-incorporationassayH14CO3-incorporationassay利用PCC將14C-碳酸鹽整合到甲基丙二酰輔酶A上，通過測定甲基丙二酰輔酶A活性來間接判定生物素的水平。STRATTON等[12]測定8個健康成年人在服用足量生雞蛋蛋白后PCC活性的變化：在第14天時所有受試者PCC活性均將至第0天正常水平的下限。驗證了生物素水平與PCC活性之間的線性關(guān)系。PCC活性不依靠于腎功能，對于腎功能下降或特殊生理狀況人群〔如孕婦〕的測定結(jié)果不受影響。但其測定技術(shù)要求比擬高。在樣品處理經(jīng)過要保持PCC活性；〔1〕分離經(jīng)過中，要避免溶血；〔2〕樣品處理時間要短，避免PCC活性絕對值下降；〔3〕避免血液中PCC活性隨著樣品處理經(jīng)過發(fā)生變化；〔4〕不適于人體長期的生物素營養(yǎng)狀況的檢測工作。3.4蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法將電泳分離后的羧化酶從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測特定抗原的技術(shù)。日本學(xué)者ENG等[15]使用WesternBlots法測定血清羧化酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：〔1〕儀器檢測到的holo-PC的信號太弱；ACC未檢測到；〔2〕生物素缺乏組MCC、PCC的豐度為4.1、4.1;生物素足量組為8.2、9.1,添加生物素組為15.7、17.0.鏈霉素親和素-HRP檢測，避免放射性標(biāo)記經(jīng)過，特異度較高，可利用條帶光密度定量分析。但是該方式方法在制膠、跑膠方面要求比擬高，且無法檢測ACC活性，有待改良。3.5色譜測定技術(shù)3.5.1HPLC-Avidinbindingassay高效液相色譜法在生物素測定方面遭到一定的限制。傳統(tǒng)的色譜柱無法將生物素與其他干擾物質(zhì)有效分離開來。1990年美國學(xué)者MOCK利用生雞蛋蛋白〔含抗生物素蛋白〕與生物素特異性結(jié)合作用，采用色譜技術(shù)將生物素與其它物質(zhì)分開的原理，建立了HPLC-Avidinbindingassay測定生物素含量。該方式方法不僅能夠測定血漿和尿中總的生物素含量，還能夠測定各種結(jié)合形式的生物素。MOCK等[16]測定健康成年人血清生物素含量，結(jié)果表示清楚血清價結(jié)合生物素占12%,可逆性結(jié)合生物素占7%;游離態(tài)生物素占81%.隨后MOCK等[17-18]使用該方式方法分離出血漿、尿中生物素的代謝產(chǎn)物，15個健康成年人血漿生物素含量為〔24461〕pmol/L,代謝產(chǎn)物雙降生物素含量為〔189135〕pmol/L、生物素硫氧化物含量為〔1533〕pmol/L.測定10個健康成年人尿中生物素的含量為〔4118〕nmol/24h肌酐，代謝產(chǎn)物雙降生物素含量為〔2610〕n