實(shí)驗(yàn)紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

關(guān)于實(shí)驗(yàn)紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量第1頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理；熟練掌握紫外分光光度計(jì)測(cè)定原理及使用方法。第2頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、實(shí)驗(yàn)原理：由于蛋白質(zhì)中存在著酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸殘基，它們的結(jié)構(gòu)中具有共軛雙鍵，對(duì)紫外光有吸收作用，其吸收高峰在280nm波長(zhǎng)處，且在此波長(zhǎng)內(nèi)吸收峰的光密度值OD280nm與其濃度（范圍是0.1~1.0mg/ml）成正比關(guān)系，280nm的吸光度故可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。第3頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第4頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三本法操作簡(jiǎn)便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定，在蛋白質(zhì)和酶的生化制備及其它研究中應(yīng)用廣泛，多用于純化之蛋白質(zhì)的微量測(cè)定，尤其是適合于柱層析分離中蛋白質(zhì)洗脫情況的檢測(cè)。核酸在280nm波長(zhǎng)下也有一定吸收能力，可能發(fā)生干擾?；煊泻怂釙r(shí)必須分別測(cè)定280nm和260nm兩處的OD值，然后根據(jù)兩種波長(zhǎng)的吸收度的比值，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實(shí)含量，再按公式推算蛋白質(zhì)含量。第5頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1．試驗(yàn)材料：待測(cè)的蛋白質(zhì)溶液。2．主要儀器：（1）紫外分光光度計(jì)（2）試管與試管架（3）移液管3．試劑：濃度為1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液第6頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作按表1分別向每支試管內(nèi)加入各種試劑，混勻。以光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。第7頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．樣品測(cè)定：

取待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1mL，加入蒸餾水9mL，混勻，按上述方法測(cè)定280nm的光密度，并從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出待測(cè)蛋白質(zhì)溶液的濃度。第8頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第9頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分光光度計(jì)的使用第10頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分光光度計(jì)的分類分光光度計(jì)的分類紅外分光光度計(jì):可見(jiàn)光分光光度計(jì):紫外分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于760nm的紅外光區(qū)

測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400~760nm的可見(jiàn)光區(qū)測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200～400nm的紫外光區(qū)第11頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)

無(wú)論哪一類分光光度計(jì)都包括：光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表。分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示:

5個(gè)基本部件第12頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三紫外分光光度計(jì)

1．光源：鎢燈或鹵鎢燈——可見(jiàn)光源400～760nm

氫燈或氘燈——紫外光源200～400nm2．單色器：把混合光波分解為單—波長(zhǎng)光的裝置

3．吸收池（比色皿）：

玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見(jiàn)光區(qū)

石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見(jiàn)光區(qū)4．檢測(cè)器：將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)的裝置

5．記錄裝置：訊號(hào)處理和顯示系統(tǒng)第13頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)使用方法（1）（1）測(cè)試準(zhǔn)備

①儀器預(yù)熱30min后方可進(jìn)行測(cè)試。

②將盛有“空白”或“對(duì)照”溶液的比色皿處于試樣室光路位置；③選擇波長(zhǎng)

④確定光源

（2）測(cè)試過(guò)程

①數(shù)字顯示透光度“100.0”(或吸光度“0.00”)2～3s后，將盛有標(biāo)準(zhǔn)溶液的比色皿移至光路②將盛有樣品溶液的比色皿移至光路，記錄該樣品的數(shù)據(jù)。待第一個(gè)樣品數(shù)據(jù)記錄完畢后，將第二個(gè)樣品置于試樣室光路………，若有多個(gè)樣品，操作以此類推。第14頁(yè)，共16頁(yè)，2023年，2月20日，星期三分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)

（1）預(yù)熱是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要步驟，不可忽略。（2）在波長(zhǎng)320nm以下的實(shí)驗(yàn)范圍一定要選用石英比色皿，絕不可以玻璃比色皿替代。（3）比色皿的清潔程度，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，特別要將比色皿清洗干凈。先用自來(lái)水將用過(guò)的比色皿反復(fù)沖洗，然后用蒸餾水淋洗，倒立于濾紙片上，待干后再收回比色皿盒中。必要時(shí)，還要對(duì)比色皿進(jìn)行更精細(xì)的處理，如用濃硝酸或鉻酸洗液浸