2023學年完整公開課版ELISA技術

ELISA技術免疫檢測的基礎知識1ELISA基本知識2目錄頁CONTENTSPAGE1免疫檢測的基礎知識一、免疫檢測基礎知識1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應1抗原

抗原是能在機體中引起特異性免疫應答的物質?？乖M入機體后，可刺激機體引起細胞免疫和產生抗體。能在機體中引起抗體產生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質，例如完整的病毒粒子、細菌等。小分子化合物在與大分子蛋白質結合后能引起機體產生特異性抗體的，稱為半抗原。例如某些激素、藥物等。抗原的反應性取決于抗原決定簇，或稱為表位。一個抗原分子可帶有不同的決定簇，例如細菌的莢膜多糖、類脂中可帶有多個抗原決定簇。1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應2抗體抗體的結構抗體是能與抗原特異性結合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成。Ig的輕鏈是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）兩種型別。

五類Ig的重鏈結構不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈。一、免疫檢測基礎知識一、免疫檢測基礎知識1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應一、免疫檢測基礎知識1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示。兩者構成抗體的抗原結合部位，只與相應的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結合（見圖），是抗體專一性結合抗原的結構基礎。機體被微生物感染后，先產生IgM抗體，然后產生IgG抗體。經過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。一、免疫檢測基礎知識1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應

抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應式為：Ag+Ab→Ag·Ab

可逆性

抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab],Ag·Ab的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性。一、免疫檢測基礎知識1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應特異性

抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間?；瘜W結構和空間構型互補關系，具有高度的特異性。

測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。

一、免疫檢測基礎知識1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應最適比例

一、免疫檢測基礎知識1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應敏感性

化學比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應測定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/ml水平例如：用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定口蹄疫抗體，其敏感度可達0.1ng/ml。2ELISA基本知識酶聯(lián)免疫吸附試驗

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶標記抗原或抗體檢測液體（血液、細胞液）中未知抗體或抗原的方法。1.定義2.分類間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標記二抗檢測液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標記一抗檢測液相中的可溶性抗原競爭法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體二、ELISA基本知識3.ELISA的原理

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。二、ELISA基本知識4.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液二、ELISA基本知識ELISA的試劑準備A

固相載體聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。二、ELISA基本知識

ELISA的試劑準備B

結合物

即酶標記的抗體（或抗原）是ELISA中關鍵的試劑

1酶的催化活性

2抗體（或抗原）的免疫活性

3結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。二、ELISA基本知識試劑準備

C酶的底物二、ELISA基本知識5對照設定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。 陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質。 加入的量應與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質的量。二、ELISA基本知識基本操作注意事項試劑的準備按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。

二、ELISA基本知識

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。加樣:二、ELISA基本知識保溫抗原抗體完成反應的保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育？溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。二、ELISA基本知識保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。二、ELISA基本知識洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA洗滌：達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質，以及非特異性地吸附的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：二、ELISA基本知識顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產物的溫育反應。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。TMB受光照的影響。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。二、ELISA基本知識拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。結果以光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)