食用蛋白質(zhì)水解度的改良測(cè)定方法

食用蛋白質(zhì)水解度的改良測(cè)定方法摘要：當(dāng)制備水解蛋白的時(shí)候，測(cè)定水解度（DH）是至關(guān)重要的。已建立的三硝基苯磺酸（TNBS）發(fā)被認(rèn)為是測(cè)定酶水解度的常用方法。然為，三硝基苯磺酸法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能連續(xù)的測(cè)定水解反應(yīng)程度，并且需要使用有危險(xiǎn)不安全的化學(xué)試劑。本文闡述了一種基于基本氨基酸與鄰苯二甲醛（OPA）反應(yīng)的水解度測(cè)定方法。結(jié)論是使用OPA法測(cè)定蛋白質(zhì)的水解度更準(zhǔn)確，方便，迅速，有更為廣泛的使用范圍，并且較之TNBS方法更環(huán)保。關(guān)鍵詞：水解度，食用蛋白，水解，蛋白質(zhì)水解，測(cè)定介紹在蛋白質(zhì)水解物當(dāng)中，檢測(cè)反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)就是水解度（DH）ODH值唄定義為斷開(kāi)的肽鍵的百分比：DH=h/h*100%tot試中htot是每蛋白質(zhì)當(dāng)量中肽鍵總數(shù)，h是被水解的肽鍵數(shù)。Htot是取決于原料的氨基酸組成。在各種文獻(xiàn)中，人們已經(jīng)建立了幾種測(cè)定蛋白質(zhì)水解物DH值的方法，例如pH-stat法,滲壓法，可溶性氮法以及三硝基苯磺酸（TNBS）法。pH-stat法（Jacobsen等，1957）測(cè)定DH值是基于一種基準(zhǔn)物（或是由于水解物pH值變化產(chǎn)生的酸）來(lái)保持水解過(guò)程中的pH值?；鶞?zhǔn)物質(zhì)的使用量與DH值是成比例的。在實(shí)際的蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)中，Ph-stat法的使用僅限于pH略高于7的條件下（Adler-Nissen,1986）。當(dāng)水解反應(yīng)的DH值達(dá)到約30%時(shí)，采用Ph-stat法來(lái)測(cè)定水解度并不經(jīng)濟(jì)可行，在pH>7的單一酶反應(yīng)系統(tǒng)中使用該方法是不可取的。這將使最適pH值低于7的酶不適用Ph-stat法。另外，在水解反應(yīng)當(dāng)中添加基準(zhǔn)物可能會(huì)導(dǎo)致最終產(chǎn)物的使用不盡如人意。在水解反應(yīng)當(dāng)中，混合物冰點(diǎn)的降低值可以通過(guò)滲壓計(jì)（冰點(diǎn)測(cè)定器）來(lái)測(cè)得。這與DH值是相關(guān)的（Adler-Nissen,1984）.滲壓法是一種可以在多種反應(yīng)當(dāng)中使用的快速方法。這種方法的限制之處就在于它不能測(cè)定粘度大的溶液及溶質(zhì)溶解度高的溶液，例如在長(zhǎng)期反應(yīng)當(dāng)中作為防腐劑的鹽。底物中的被夾雜在蛋白酶制劑當(dāng)中的其他活性物質(zhì)（如淀粉酵素）水解的非蛋白組分會(huì)導(dǎo)致滲壓計(jì)讀數(shù)與蛋白質(zhì)的DH值之間的不相關(guān)。通過(guò)測(cè)定三氯乙酸（SN-TCA）水溶液中的溶解氮的總量來(lái)測(cè)定水解度的方法在由Margot等人提出（1994）。他們報(bào)道在了胰蛋白酶水解乳清蛋白這一反應(yīng)當(dāng)中使用pH-stat法測(cè)定水解度的底物消耗量與SN-TCA之間的良好相關(guān)性。使用SN-TCA法獲得良好試驗(yàn)結(jié)果的首要條件似乎是使用內(nèi)切肽酶。如果反應(yīng)酶系當(dāng)中主要是外切肽酶，則會(huì)使得試驗(yàn)結(jié)果中SN-TCA與通過(guò)底物消耗而測(cè)定的水解度的相關(guān)性降低。這一理論是建立在這樣一個(gè)事實(shí)之上的，即切斷相同數(shù)量的肽鍵時(shí)，使用外切肽酶所產(chǎn)生的溶解度的增量與使用內(nèi)切酶時(shí)是不同的。作為被切斷的肽鍵的百分比，水解度的測(cè)定在參考文獻(xiàn)當(dāng)中沒(méi)有做出規(guī)定。TNBS法是建立在游離氨基與三硝基苯磺酸（TNBS）試劑的反應(yīng)的基礎(chǔ)上的（Adler-Nissen,1979）。然而該方法也有它的缺點(diǎn)。此法較為費(fèi)力，不易在水解反應(yīng)當(dāng)中快速獲得結(jié)果以準(zhǔn)確反映水解程度。另外，TNBS試劑不穩(wěn)定，有毒，并且由于有爆炸危險(xiǎn)，必須謹(jǐn)慎操作。因此，需要一種無(wú)上述缺點(diǎn)的改進(jìn)方法。為了給完善中的適當(dāng)方法提供基礎(chǔ)，我們選擇了氨基與鄰苯二甲醛（OPA）在有0-巰基乙醇存在條件生成可用分光光度計(jì)在340nm波長(zhǎng)檢測(cè)的有色化合物之間的反應(yīng)（圖1）。Church等人曾在1983仔細(xì)描述過(guò)OPA法，他們?cè)诿咳湛茖W(xué)調(diào)查當(dāng)中建議用此法測(cè)定牛乳蛋白水解。在我們采用OPA法的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，采用與實(shí)驗(yàn)條件更相符的二硫蘇糖醇（DTT）代替0-巰基乙醇。

在此方法中的另一個(gè)改變之處就是采用絲氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，因?yàn)榉磻?yīng)表明，絲氨酸更接近于平均氨基酸。表1當(dāng)中列出了OPA與氨基酸和短肽反應(yīng)在340nm處測(cè)定的吸光值。該表通過(guò)省略與總體平均值相差多于15%的數(shù)據(jù)來(lái)提高準(zhǔn)確性。表1OPA與氨基酸和短肽反應(yīng)在340nm出吸光值OD/mmol/100ml%平均值甘氨酸5835*82丙氨酸7156101亮氨酸7310103苯丙氨酸7107100絲氨酸7075100半胱氨酸2311*33蛋氨酸7067100色氨酸677696酪氨酸7147101天冬氨酸7297103天冬酰胺7808110谷氨酸7646108賴(lài)氨酸5814*82精氨酸7451105組氨酸673295N-甘氨酰-甘氨酸686997N-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸609986N亮氨酰-蛋氨酸7240102N賴(lài)氨酸-苯丙氨酸7280103N-甘氨酰-亮氨酰-酪氨酸643291平均值7088s*計(jì)算平均值時(shí)不包括表中包括了半胱氨酸，甘氨酸和賴(lài)氨酸。半胱氨酸已在之前提過(guò)，它不予OPA試劑反應(yīng)（Church等，1983年）。他們也報(bào)道了甘氨酸的吸光值相對(duì)較低,但我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)的更低。報(bào)道中，OPA試劑與賴(lài)氨酸的游離氨基酸反應(yīng)的吸光值與有理氨基相同。然而，我們發(fā)現(xiàn)除了半胱氨酸之外，賴(lài)氨酸的吸光值較之其他的氨基酸均低。在試驗(yàn)當(dāng)中，對(duì)OPA法與廣泛使用的TNBS法的相關(guān)性進(jìn)行了研究，特別是在一大豆蛋白和酪朊酸鈉為底物，蛋白質(zhì)水解度達(dá)到65%以上時(shí)。為了從分光光度計(jì)上絲氨酸表品和樣品的吸光值讀數(shù)計(jì)算DH值，要使用類(lèi)似于Adler-Nissen在1986年報(bào)道的TNBS法中的公式。要計(jì)算出DH值，需要知道h和htot（見(jiàn)上）的值。OPA法當(dāng)值的計(jì)算表達(dá)式為：h=（serine-NH2-0）/amegv/g蛋白在此引用了19791年由Adler-Nissen報(bào)道的a、0值。對(duì)于大多數(shù)的蛋白質(zhì)而言，氨基酸的平均分子量大約是125g/mol,htot的值約為8g當(dāng)量每千克蛋白。下文將引用更為精確的由Adler-Nissen給出在1986年所給出的a、P及htot的值。使用DH值達(dá)到65%的蛋白質(zhì)水解物，分別用OPA法與TNBS法測(cè)定，比較分析兩種方法所得結(jié)果，以確定O