生化第四章酶

生化第四章酶第一頁，共七十八頁，2022年，8月28日學(xué)習(xí)目的與要求：1.酶的概念及發(fā)展分類及命名5.酶作用的機(jī)制2.酶催化作用的特點(diǎn)6.酶促反應(yīng)的速度及其影響因素3.酶的化學(xué)本質(zhì)及組成7.酶的分離純化與酶活力測(cè)定4.酶結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系8.酶的多樣性重點(diǎn)：1.酶的化學(xué)本質(zhì)及組成4..酶促反應(yīng)的速度及其影響因素2.酶結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系5.酶的分離純化與酶活力測(cè)定3.酶作用的機(jī)制難點(diǎn)：1.酶作用的機(jī)制3.抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響2.底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響4.酶活力測(cè)定第二頁，共七十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)、酶的概念，分類及命名一.酶的概念及發(fā)展酶是一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用和高度專一性的特殊蛋白質(zhì)。簡單說，酶是一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的生物催化劑。酶的概念第三頁，共七十八頁，2022年，8月28日發(fā)展史(1)酶是蛋白質(zhì):1926年,JamesSummer由刀豆制出脲酶結(jié)晶確立酶是蛋白質(zhì)的觀念，其具有蛋白質(zhì)的一切性質(zhì)。(2)核酶的發(fā)現(xiàn)：1981～1982年，ThomasR.Cech實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有催化活性的天然RNA—Ribozyme。L19RNA和核糖核酸酶P的RNA組分具有酶活性是兩個(gè)最著名的例子。1995年，發(fā)現(xiàn)DNA的催化活性。(3)抗體酶（abzyme）：1986年，RichardLerrur和PeterSchaltz運(yùn)用單克隆抗體技術(shù)制備了具有酶活性的抗體（catalyticantibody）。第四頁，共七十八頁，2022年，8月28日二.酶的分類氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。主要包括脫氫酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1.氧化-還原酶Oxidoreductase第五頁，共七十八頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。

例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2.轉(zhuǎn)移酶Transferase第六頁，共七十八頁，2022年，8月28日水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)3.水解酶Hydrolase第七頁，共七十八頁，2022年，8月28日裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。4.裂解酶Lyase第八頁，共七十八頁，2022年，8月28日異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。5.異構(gòu)酶Isomerase第九頁，共七十八頁，2022年，8月28日合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)丙酮酸+CO2

草酰乙酸6.合成酶LigaseorSynthetase第十頁，共七十八頁，2022年，8月28日三.酶的命名（1）根據(jù)其催化底物來命名；（2）根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；（3）結(jié)合上述兩個(gè)原則來命名；（4）有時(shí)在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點(diǎn)。1.習(xí)慣命名法2.國際系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì),2個(gè)底物，底物之間“：”，水解酶水解2字可省略，最后加一個(gè)酶字。例如：(習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶)系統(tǒng)名稱:L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶酶催化的反應(yīng):

谷氨酸+丙酮酸

-酮戊二酸+丙氨酸第十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日四.酶的編號(hào)例如：RNaseT1-------EC3148

EC------酶3------水解酶1------脂鍵4------磷酸二酯鍵8------編號(hào)（第8個(gè)）第十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)、酶催化作用的特點(diǎn)一.酶和一般催化劑的共性及酶催化作用特性1.酶和一般催化劑的共性：加快反應(yīng)速度；不改變平衡常數(shù)；自身不參與反應(yīng)。2.酶催化作用特性：條件溫和：常溫、常壓、pH=7；高效率：反應(yīng)速度與不加催化劑相比可提高108～1020，與加普通催化劑相比可提高107～1013；專一性：即酶只能對(duì)特定的一種或一類底物起作用。易變敏感性：易受各種因素的影響。酶的活性調(diào)節(jié)控制：受在活細(xì)胞內(nèi)受到精密嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制。酶分子代謝更新：第十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日二.專一性1.絕對(duì)專一性有些酶只作用于一種底物，催化一個(gè)反應(yīng)，而不作用于任何其它物質(zhì)。2.相對(duì)專一性這類酶對(duì)結(jié)構(gòu)相近的一類底物都有作用。3.立體異構(gòu)專一性簇（基團(tuán)）專一性鍵專一性旋光異構(gòu)專一性。幾何異構(gòu)專一性第十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)、酶的化學(xué)本質(zhì)及組成一.酶的化學(xué)本質(zhì)1.由基本組成單位氨基酸2.具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)-兩性離解性質(zhì)等3.具有雙縮脲反應(yīng)二.酶的組成全酶(holoenzyme）=酶蛋白+輔因子單成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。（簡單蛋白質(zhì)）雙成份酶（結(jié)合蛋白質(zhì)）酶酶蛋白（apoenzyme）輔因子（cofacter)輔酶（coenzyme)輔基(prostheticgroup)第十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日第十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日三.酶的輔因子酶的輔因子是酶的對(duì)熱穩(wěn)定的非蛋白小分子物質(zhì)部分，其主要作用是作為電子、原子或某些基團(tuán)的載體參與反應(yīng)并促進(jìn)整個(gè)催化過程。(1)傳遞電子體：如卟啉鐵、鐵硫簇；(2)傳遞氫（遞氫體）：如FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；(3)傳遞酰基體：如C0A、TPP、硫辛酸；(4)傳遞一碳基團(tuán)：如四氫葉酸；(5)傳遞磷酸基：如ATP，GTP；(6)其它作用：

轉(zhuǎn)氨基，如VB6；傳遞CO2，如生物素。第十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四節(jié)酶分子結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系一.酶分子結(jié)構(gòu)根據(jù)結(jié)構(gòu)不同酶可分為單體酶：只有單一的三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成。寡聚酶：由多個(gè)（兩個(gè)以上）具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的亞基聚合而成。多酶復(fù)合體：由幾個(gè)功能相關(guān)的酶嵌合而成的復(fù)合體。第十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日二.活性中心活性中心：酶分子中直接和底物結(jié)合并起催化反應(yīng)的空間局限（部位）。

結(jié)合部位(Bindingsite)：酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。第十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日第二十頁，共七十八頁，2022年，8月28日催化部位(Catalyticsite):酶分子中促使底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化部位。通常將酶的結(jié)合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。結(jié)合部位決定酶的專一性，催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。第二十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日調(diào)控部位(Regulatorysite):酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合的部位，從而引起酶分子空間構(gòu)象的變化，對(duì)酶起激活或抑制作用第二十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日三.必須基團(tuán)酶表現(xiàn)催化活性不可缺少的基團(tuán)。親核性基團(tuán)：絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。酸堿性基團(tuán)：門冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等。親核性基團(tuán)酸堿性基團(tuán)第二十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日第五節(jié)、酶作用的機(jī)制一.酶催化作用與反應(yīng)活化能自由能反應(yīng)進(jìn)程產(chǎn)物反應(yīng)物IIIIIII：酶催化反應(yīng)活化能II：化學(xué)催化劑反應(yīng)活化能III：無催化反應(yīng)活化能第二十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日二.酶催化作用的中間產(chǎn)（絡(luò)合）物學(xué)說在酶催化的反應(yīng)中，第一步是酶與底物形成酶－底物中間復(fù)合物。當(dāng)?shù)孜锓肿釉诿缸饔孟掳l(fā)生化學(xué)變化,中間復(fù)合物再分解成產(chǎn)物和酶。E+S====E-SP+E許多實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明了E－S復(fù)合物的存在。E－S復(fù)合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)有關(guān)。第二十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日三.使酶具有高效性的機(jī)制1.臨近定向效應(yīng)在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應(yīng)速度；另一方面，由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn).2.“張力”和“形變”底物與酶結(jié)合誘導(dǎo)酶的分子構(gòu)象變化，變化的酶分子又使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力”甚至“形變”，從而促使酶－底物中間產(chǎn)物進(jìn)入過渡態(tài)。第二十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日3.酸堿催化酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸－堿催化方式。廣義酸－堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子,或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過程。酶活性部位上的某些基團(tuán)可以作為良好的質(zhì)子供體或受體對(duì)底物進(jìn)行酸堿催化。His殘基的咪唑基是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個(gè)催化功能團(tuán)。廣義酸基團(tuán)（質(zhì)子供體）廣義堿基團(tuán)（質(zhì)子受體）第二十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日4.共價(jià)催化催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價(jià)催化。酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括His的咪唑基，Cys的巰基，Asp的羧基，Ser的羥基等。某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價(jià)催化作用。第二十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日四.酶專一性的機(jī)制認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣1.鎖鑰假說(lockandkeyhypothesis)第二十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀.2.誘導(dǎo)契合假說（induced–fithypothesis)第三十頁，共七十八頁，2022年，8月28日第六節(jié)、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)一.底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響在酶濃度，pH，溫度等條件不變的情況下研究底物濃度和反應(yīng)速度的關(guān)系。如右圖所示：在低底物濃度時(shí),反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值時(shí)，底物濃度增加，反應(yīng)速度增加，表現(xiàn)為混合級(jí)反應(yīng)特征當(dāng)?shù)孜餄舛龋瑤缀跛械拿付寂c底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。第三十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日二.米氏方程1913年，德國化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說對(duì)酶促反映的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。Km—

米氏常數(shù)Vmax—

最大反應(yīng)速度第三十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日三.米氏方程的推導(dǎo)根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行:第三十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。四.米氏常數(shù)Km的意義1.米氏常數(shù)的含義由米氏方程可知，當(dāng)反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半時(shí),即V=1/2Vmax,Km=[S]

上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。2.酶的特征物理常數(shù)不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的，不同條件下具有不同的Km值。3.表示酶與底物之間的親和程度第三十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日4.判斷酶的最適底物Km最小的底物5.計(jì)算一定速度下的底物濃度V=80%Vmax時(shí)，(S)=？由：0.8Km+0.2(S)=(S),0.8Km=0.2(S)(S)=4Km又:V=99%Vmax,(S)=99Km6.了解酶的底物在體內(nèi)的濃度水平Km≈(S)7.判斷反應(yīng)的方向Km最小的反應(yīng)8.判斷抑制作用的類型第三十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日1.雙倒數(shù)作圖法

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：五.米氏常數(shù)Km的測(cè)定測(cè)定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法—

雙倒數(shù)作圖法。1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km第三十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日V/(S)VmaxVVmax/Km斜率=-Km2.Eadie-Hofstee方程由：方程兩邊乘以Km+（S）/（S）V(Km+（S）/（S）)V=-Km(V/（S）)+VmaxVV/(S)作圖第三十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日最適溫度第七節(jié)影響酶促反應(yīng)速度的因素一.溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。另一方面,溫度升高,酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。因此大多數(shù)酶都有一個(gè)最適溫度。在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。第三十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日二.pH對(duì)酶反應(yīng)的影響在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常稱此pH為最適pH。第四十頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日速度酶濃度三.酶濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響在底物足夠過量而其它條件固定的情況下，并且反應(yīng)系統(tǒng)中不含有抑制酶活性的物質(zhì)及其他不利于酶發(fā)揮作用的因素時(shí)，酶促反應(yīng)的速度和酶濃度成正比第四十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日四.激活劑對(duì)酶反應(yīng)的影響1.概念：凡是能提高酶活力的物質(zhì)(簡單化合物)都稱為酶的激活劑。

（activator)。2.成分：其中大部分是一些無機(jī)離子和小分子簡單有機(jī)物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-、GSH、VitC

等；3.功能：1）.這些離子可與酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合，可能是酶活性部位的組成部分，2）.也可能作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分起作用；4.特點(diǎn)：1）.一般情況下，一種激活劑對(duì)某種酶是激活劑，而對(duì)另一種酶則不一定是激活劑，可能發(fā)生抑制作用；2）.對(duì)于同一種酶，不同激活劑濃度會(huì)產(chǎn)生不同的作用。第四十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日

五.抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響（一）.酶的抑制作用的概念有些物質(zhì)能與酶分子上某些必須基團(tuán)結(jié)合（作用),使酶的活性中心的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活力下降或喪失，這種現(xiàn)象稱為酶的抑制作用。抑制劑：能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑（inhibitor)。抑制作用的特點(diǎn)：酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。b.能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。第四十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日（二）.抑制作用的類型1.不可逆抑制作用抑制劑與酶反應(yīng)中心的活性基團(tuán)以共價(jià)形式結(jié)合，引起酶的永久性失活。如有機(jī)磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。第四十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日2.可逆抑制作用：抑制劑與酶蛋白以非共價(jià)方式結(jié)合，引起酶活性暫時(shí)性喪失。抑劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性根椐抑制劑與酶結(jié)合的情況，又可以分為三類：（1）競爭性抑制：概念：某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。特點(diǎn)：竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。第四十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日競爭性抑制可用下式表示：第四十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日競爭性抑制作用的速度方程：有競爭性抑制劑存在時(shí)，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值隨[I]的增高而增大；在[E]固定時(shí)，當(dāng)[S]﹥﹥Km(1+[I]/Ki),Km(1+[I]/Ki)項(xiàng)可忽略不計(jì)，則v=Vmax，即最大反應(yīng)速度不變。第五十頁，共七十八頁，2022年，8月28日競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：第五十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日（2）非競爭性抑制：概念：酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競爭與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競爭性抑制劑。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競爭性抑制。特點(diǎn)：非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^增大底物濃度的方法來消除。第五十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日非競爭性抑制可用下式表示：第五十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日第五十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日非競爭性抑制作用的速度方程：有非競爭性抑制劑存在時(shí)，V值減小(1+[I]/Ki)倍，且V值隨[I]的增高而降低；Km值不變。第五十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日非競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：第五十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日（3）反競爭性抑制：概念：酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，引起酶活性下降。反競爭性抑制可用下式表示：特點(diǎn)：非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^增大底物濃度的方法來消除。第五十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日有反競爭性抑制劑存在時(shí)，Km和V值均減小(1+[I]/Ki)倍，且都隨[I]的增高而降低。反競爭性抑制作用的速度方程：第五十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日反競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：第五十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日第八節(jié)、酶的分離純化與酶活力測(cè)定一.酶的分離純化1.基本原則提取過程中避免酶變性而失去活性防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌等要求在低溫下操作加入的化學(xué)試劑不使酶變性操作中加入緩沖溶液第六十頁，共七十八頁，2022年，8月28日2.基本操作程序選材：微生物（微生物發(fā)酵物:胞內(nèi)酶，胞外酶），動(dòng)物（動(dòng)物器臟：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶等）。抽提：加入提取液提取。胞內(nèi)酶先要進(jìn)行細(xì)胞破碎（機(jī)械研磨，超聲波破碎，反復(fù)凍融或自溶等），分離：先進(jìn)行凈化處理（過濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，超離心等）。純化：可采用離子交換層析，凝膠過濾，液相色譜，親和色譜和超濾等方法。第六十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日3.酶的制劑形式固體：干燥（冰凍升華，噴霧干燥，真空干燥）液體：溶液4.保存低溫下短期保存0-4℃（固體）-20?-70℃（液體）第六十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日二.酶活力的測(cè)定1.酶活力概念酶活力：又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力，通常以在一定條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度來表示。酶活力可用單位時(shí)間內(nèi)單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量表示，單位為mol/min等。2.酶活力的表示方法-酶活力單位酶活力單位的基本定義為：規(guī)定條件（最適條件）下一定時(shí)間內(nèi)催化完成一定化學(xué)反應(yīng)量所需的酶量。據(jù)不同情況有幾種酶活力單位（activityunit）或又稱酶單位（enzymeunit）第六十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日國際單位U（Unit）：是以最佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成1μmol產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位?！癒atal”單位：是指在一定條件下1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。Kat和U的換算關(guān)系：1Kat=6×107U，1U=16.67nKat以上的酶單位定義中，如果底物（S）有一個(gè)以上可被作用的化學(xué)鍵，則一個(gè)酶單位表示1分鐘使1μmol有關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)化的酶量。如果是兩個(gè)相同的分子參加反應(yīng)，則每分鐘催化2μmol底物轉(zhuǎn)化的酶量稱為一個(gè)酶單位。在“U”和“kat”酶活力單位的定義和應(yīng)用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無法計(jì)算。第六十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日習(xí)慣單位在實(shí)際使用中，不同酶有各自的規(guī)定，如：α-淀粉酶活力單位：每小時(shí)分解1g可溶性淀粉的酶量為一個(gè)酶單位。（QB546-80），也有規(guī)定每小時(shí)分解1mL2%可溶性淀粉溶液為無色糊精的酶量為一個(gè)酶單位。顯然后者比前一個(gè)單位小。②糖化酶活力單位：在規(guī)定條件下，每小時(shí)轉(zhuǎn)化可溶性淀粉產(chǎn)生1mg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶單位。③蛋白酶：規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量。④DNA限制性內(nèi)切酶：推薦反應(yīng)條件下，一小時(shí)內(nèi)可完全消化1μg純化的DNA所需的酶量。第六十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日3.酶的比活力比活力:指每mg酶蛋白質(zhì)/蛋白氮所含的酶活力單位數(shù)。比活力=U或Kat/mg酶蛋白或蛋白氮(U或Kat/ml酶液,或U或Kat/mg酶制劑）比活力表示酶制劑的純度的一個(gè)指標(biāo)。4.酶活力中心轉(zhuǎn)換數(shù)酶活力中心轉(zhuǎn)換數(shù):表示酶的催化中心的活性,單位時(shí)間內(nèi)(sec.)每一催化中心的活性或活性中心所轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，或每mol酶活性中心單位時(shí)間轉(zhuǎn)換底物的mol數(shù).轉(zhuǎn)換數(shù)=k3=Vmax/(E0)第六十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日5.酶活力測(cè)定酶活力測(cè)定就是測(cè)定一定量的酶，在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物(P)的生成（增加）量或底物（S）的消耗（減少）量。即測(cè)定時(shí)確定三種量：①加入一定量的酶；②一定時(shí)間間隔；③物質(zhì)的增減量。1）.測(cè)定酶活力常有以下幾種方法反應(yīng)計(jì)時(shí)法：反應(yīng)計(jì)時(shí)必須準(zhǔn)確。反應(yīng)體系必須預(yù)熱至規(guī)定溫度后，加入酶液并立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)到時(shí)，要立即滅酶活性，終止反應(yīng)，并記錄終了時(shí)間。終止酶反應(yīng)。常使酶立刻變性最常用的方法：是加入三氯乙酸或過氯酸使酶蛋白沉淀。也可用SDS使酶變性，或迅速加熱使酶變性。有些酶可用非變性法來停止反應(yīng)或用破壞其輔因子來停止反應(yīng)。第六十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日反應(yīng)量的測(cè)定法：測(cè)底物減少量或產(chǎn)物生成量均可。在反應(yīng)過程中產(chǎn)物是從無到有，變化量明顯，極利于測(cè)定，所以大都測(cè)定產(chǎn)物的生成量2).酶活力測(cè)定的分析方法具體物質(zhì)量的測(cè)定，據(jù)被測(cè)定物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)通過定量分析法測(cè)定。常用的方法有：光譜分析法：酶將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄖ苯踊蜷g接）一個(gè)可用分光光度法或熒光光度法測(cè)出的化合物?；瘜W(xué)法：利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物變成一個(gè)可用某種物理方法測(cè)出的化合物，然后再反過來算出酶的活性。放射性化學(xué)法：用同位素標(biāo)記的底物，經(jīng)酶作用后生成含放射性的產(chǎn)物，在一定時(shí)間內(nèi)，生成的放射性產(chǎn)物量與酶活性成正比。

第六十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日第九節(jié)酶的多樣性一.多酶復(fù)合體由幾個(gè)功能相關(guān)的酶嵌合而成的復(fù)合體。二.同工酶催化同一化學(xué)反應(yīng)，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同的一類酶如：人乳酸脫氫酶LDH1H47324314100431227.1LDH2H3M2444434250444934.7LDH3H2M23111235405123320.9LDH4HM302715