醫(yī)學(xué)專題-人和動(dòng)物體內(nèi)三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝

第一章基因工程(jīyīngōngchéng)第一節(jié)工具(gōngjù)酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生第一頁，共五十一頁?；蚬こ?jīyīngōngchéng)背景(bèijǐng)：家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用。但繁殖慢，產(chǎn)量低。能否讓大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)也能吐蠶絲呢？問題：大腸桿菌繁殖很快，但不會(huì)產(chǎn)絲。第二頁，共五十一頁。用人工方法，把甲生物的某個(gè)基因提取出來，在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，然后將其導(dǎo)入乙生物的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量復(fù)制，并進(jìn)行表達(dá)，從而定向地改變(gǎibiàn)乙生物的遺傳性狀，或獲得人類所需要的基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)、多肽、酶）。剪切拼接(pīnjiē)導(dǎo)入甲生物(shēngwù)取出所需基因生物新類型表達(dá)新的生物產(chǎn)品乙生物基因工程第三頁，共五十一頁?；虻拇笮∫约{米計(jì)算，要對(duì)它進(jìn)行剪切、拼接(pīnjiē)等操作，沒有非常精細(xì)的工具是不行的。進(jìn)行基因操作最少需要以下三種工具：１、基因(jīyīn)的手術(shù)刀２、基因(jīyīn)的針線3、基因的運(yùn)輸工具㈠基因操作的工具第四頁，共五十一頁。主要(zhǔyào)在原核生物中。特異性。即一種限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點(diǎn)上將DNA分子(fēnzǐ)切斷（使連接脫氧核苷酸的磷酸二酯鍵斷裂）。已發(fā)現(xiàn)(fāxiàn)數(shù)千種種類:來源:特點(diǎn):１、基因的剪刀──限制性核酸內(nèi)切酶第五頁，共五十一頁。

例如(lìrú)：大腸桿菌的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制(xiànzhì)酶第六頁，共五十一頁。GAATTCCTTAAG5′5′3′3′粘性(zhānxìnɡ)末端粘性(zhānxìnɡ)末端限制性內(nèi)切酶CTTAAG5′3′AATTCG3′5′

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們兩個(gè)之間正好反向互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫粘性(zhānxìnɡ)末端。

被同一種限制酶切斷的幾個(gè)DNA就具有相同的粘性末端，能夠通過互補(bǔ)進(jìn)行配對(duì)。第七頁，共五十一頁。TGCAACGT5′3′3′5′不同的限制(xiànzhì)酶所形成的粘性末端不同ACGT5′3′GCAT3′5′另一種限制酶第八頁，共五十一頁。２、基因(jīyīn)的針線作用(zuòyòng)：將粘性末端堿基互補(bǔ)的兩個(gè)(liǎnɡɡè)DNA片段連接起來，使之成為一個(gè)完整的DNA分子（使兩個(gè)DNA片段通過磷酸二酯鍵連接成一個(gè)DNA分子）

。──DNA連接酶第九頁，共五十一頁。CTTAAGAATTCG連接酶第十頁，共五十一頁。3、基因(jīyīn)的運(yùn)輸工具基因載體(zàitǐ)的條件：能夠在宿主細(xì)胞(xìbāo)中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)（每種限制酶切點(diǎn)只有一個(gè)），以便與外源基因連接。具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。──載體要把甲生物取出的基因送到乙生物的細(xì)胞中去，需要運(yùn)輸基因的載體。第十一頁，共五十一頁。最常用的基因(jīyīn)載體是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒（核區(qū)）質(zhì)粒（細(xì)胞質(zhì)DNA）大腸桿菌質(zhì)粒能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，存在于細(xì)菌核區(qū)以外(yǐwài)，帶有少量基因，其中常含有抗生素抗性基因（如四環(huán)素的抗性基因），使細(xì)菌有抗藥性，一個(gè)細(xì)菌中有多個(gè)質(zhì)粒。第十二頁，共五十一頁。最常用的基因(jīyīn)載體是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒（核區(qū)）質(zhì)粒（細(xì)胞質(zhì)DNA）大腸桿菌質(zhì)粒與宿主細(xì)胞的關(guān)系：1、質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無影響(yǐngxiǎng)。2、質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。第十三頁，共五十一頁?？股乜剐曰颍?biāo)記基因）（細(xì)胞質(zhì)DNA）（核區(qū)）質(zhì)粒(細(xì)胞質(zhì)DNA)大腸桿菌控制質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移的基因第十四頁，共五十一頁。4、篩選含有(hányǒu)目的基因的受體細(xì)胞1、獲得目的(mùdì)基因2、形成重組(zhònɡzǔ)DNA分子3、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞5、目的基因的表達(dá)第二節(jié)基因工程的原理和技術(shù)基因工程的基本操作步驟第十五頁，共五十一頁。①逆轉(zhuǎn)錄法：信使(xìnshǐ)RNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA單鏈合成DNA雙鏈(基因(jīyīn))②直接(zhíjiē)合成法：組成蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測信使RNA核苷酸序列推測基因單核苷酸序列合成基因雙鏈１、獲得目的基因（1）化學(xué)合成法（目的基因的序列巳知）第十六頁，共五十一頁。人工合成(rénɡōnɡhéchénɡ)(基因(jīyīn)比較小)DNA合成(héchéng)儀第十七頁，共五十一頁。（2）用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(liànshìfǎnyìng)(PCR)擴(kuò)增目的基因第十八頁，共五十一頁。1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)(fǎnyìng)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)(chóngfù)1~3步25~30輪目的DNA片段(piànduàn)擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第十九頁，共五十一頁。第二十頁，共五十一頁。（3）從基因文庫中分離(fēnlí)：

目的基因(jīyīn)的脫氧核苷酸序列是未知的，可以從基因文庫中找到目的基因（酶切）。（2）用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(liànshìfǎnyìng)(PCR)擴(kuò)增目的基因第二十一頁，共五十一頁?；蚪M文庫(wénkù)的構(gòu)建模式圖通過對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存(chǔcún)基因第二十二頁，共五十一頁。2、形成重組(zhònɡzǔ)DNA分子用相同的限制性核酸(hésuān)內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體；

目的(mùdì)基因與載體的結(jié)合過程－－基因重組用DNA連接酶將目的基因和載體連接在一起，形成重組DNA分子（或重組質(zhì)粒）。第二十三頁，共五十一頁。3、將重組(zhònɡzǔ)DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入擴(kuò)增將重組(zhònɡzǔ)DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞并使之?dāng)U增。a、為使重組的質(zhì)粒更容易(róngyì)進(jìn)入大腸桿菌，用氯化鈣處理大腸桿菌，增加大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性。a.如要獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物，通常以大腸桿菌等無害易得的細(xì)菌為受體。b.如要改良某種生物的性狀時(shí)，要以改良的生物細(xì)胞為受體。問題：誰是受體？第二十四頁，共五十一頁。3、將重組(zhònɡzǔ)DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞將重組(zhònɡzǔ)DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞并使之?dāng)U增。1、受體為植物細(xì)胞：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因(jīyīn)槍法花粉管道法b.如要改良某種生物的性狀時(shí)，要以改良的生物細(xì)胞為受體。2、受體為動(dòng)物細(xì)胞：基因槍法顯微注射法第二十五頁，共五十一頁。1.將目的基因?qū)胫参?zhíwù)細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)法基因槍法花粉管通道法第二十六頁，共五十一頁。（1）農(nóng)桿菌(gǎnjūn)轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：易感染(gǎnrǎn)雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染(gǎnrǎn)能力②原理：

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。第二十七頁，共五十一頁。③轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)過程:Ti質(zhì)粒目的(mùdì)基因構(gòu)建(ɡòujiàn)表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第二十八頁，共五十一頁?；驑尫?qiāngfǎ)又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因(jīyīn)槍法適用(shìyòng)于單子葉植物第二十九頁，共五十一頁。（3）花粉(huāfěn)通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱(huāzhù)直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。適用(shìyòng)于被子植物第三十頁，共五十一頁。胚珠(pēizhū)花藥(huāyào)花絲(huāsī)柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第三十一頁，共五十一頁。2.將目的(mùdì)基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法(fāngfǎ)：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考(sīkǎo)：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？第三十二頁，共五十一頁。（2）操作程序:提純含目的(mùdì)基因表達(dá)載體取受精卵顯微(xiǎnwēi)注射移植(yízhí)到子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物第三十三頁，共五十一頁。4、篩選含有(hányǒu)目的基因的受體細(xì)胞

盡管使用了大量的受體細(xì)胞，但真正導(dǎo)入了重組DNA分子的受體細(xì)胞很少，因此必須(bìxū)將它從中檢測出來。篩選的方法主要依賴于質(zhì)粒中的抗性基因所表達(dá)(biǎodá)的產(chǎn)物進(jìn)行篩選。第三十四頁，共五十一頁。四環(huán)素抗性基因（標(biāo)記基因）四環(huán)素培養(yǎng)基生長(shēngzhǎng)被抑制供體DNA質(zhì)粒重組DNA目的基因正常(zhèngcháng)生活四環(huán)素培養(yǎng)基受體細(xì)胞受體細(xì)胞第三十五頁，共五十一頁。問題1：在受體細(xì)胞中檢測到含有目的基因(jīyīn)，能說明轉(zhuǎn)基因成功嗎？不能。還要看最后該目的基因是否(shìfǒu)在受體細(xì)胞表達(dá)。5、目的(mùdì)基因的表達(dá)問題2：如何檢測？檢測的方法主要看導(dǎo)入的目的基因是否表達(dá)出產(chǎn)物，或要看受體生物是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀。基因工程是否獲得成功，最重要的是要看目的基因是否在受體細(xì)胞中得到表達(dá)。第三十六頁，共五十一頁。產(chǎn)物(chǎnwù)的檢測無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物細(xì)菌的檢測，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落(jūnluò)，檢測菌落(jūnluò)中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落(jūnluò)，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。第三十七頁，共五十一頁。

如用棉葉飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未導(dǎo)入目的基因或?qū)氲哪康幕蛭幢磉_(dá)(biǎodá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明導(dǎo)入了抗蟲基因并得到表達(dá)(biǎodá)。性狀(xìngzhuàng)的檢測第三十八頁，共五十一頁。如轉(zhuǎn)入了人胰島素原基因的大腸桿菌，可以(kěyǐ)合成人胰島素原。經(jīng)進(jìn)一步加工后可獲得具有生物活性的胰島素。如轉(zhuǎn)入了人胰島素原基因的酵母菌，是否(shìfǒu)需要進(jìn)一步加工？第三十九頁，共五十一頁。1.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)

C、具有(jùyǒu)標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)(liànxí)第四十頁，共五十一頁。2.有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來

B、限制性核酸(hésuān)內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、一種限制酶只能識(shí)別一種特定的脫氧苷酸序列A第四十一頁，共五十一頁。3.有關(guān)基因工程的敘述(xùshù)正確的是

A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供

資料D第四十二頁，共五十一頁。4.基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合(jiéhé)

C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

D、目的基因的檢測和表達(dá)C第四十三頁，共五十一頁。1．（全國卷）采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列(xiàliè)導(dǎo)入目的基因的作法正確的是（）①將毒素蛋白注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)④將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵

A①②B②③C③④D④①C第四十四頁，共五十一頁。2．（2009年浙江卷）下列關(guān)于基因工程的敘述，錯(cuò)誤的是(

)A．目的基因和受體細(xì)胞均可來自動(dòng)、植物或微生物

B．限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶

C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素原無生物活性

D．載體(zàitǐ)上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá)D第四十五頁，共五十一頁。3．(2010浙江卷)在用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗除草劑的轉(zhuǎn)基因煙草過程中，下列操作錯(cuò)誤的是(

)A．用限制性核酸內(nèi)切酶切割煙草花葉病毒的核酸B．用DNA連接酶連接經(jīng)切割的抗除草劑基因(jīyīn)和載體C．將重組DNA分子導(dǎo)入煙草原生質(zhì)體D．用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞A第四十六頁，共五十一頁。4．（2011浙江卷）將ada(腺苷酸脫氨酶基因）通過質(zhì)粒pET28b導(dǎo)入大腸桿菌并成功表達(dá)腺苷酸脫氨酶。下列敘述錯(cuò)誤(cuòwù)的是（）

A.每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞至少含一個(gè)重組質(zhì)粒

B.每個(gè)重組質(zhì)粒至少含一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)

C.每個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少插入一個(gè)adaD.每個(gè)的ada至少表達(dá)一個(gè)腺苷酸脫氨酶分子C第四十七頁，共五十一頁。6．(2012浙江卷）天然的玫瑰沒有藍(lán)色花，這是由于缺少控制藍(lán)色色素合成的基因B，而開藍(lán)色花的矮牽牛中存在序列已知的基因B?，F(xiàn)用基因工程技術(shù)培