實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取和鑒定

實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的提取和鑒定第一頁，共三十九頁，2022年，8月28日分子生物學(xué)從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質(zhì)基礎(chǔ)的學(xué)科。研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)的性質(zhì)和變化以及這些性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象的關(guān)系，如遺傳信息的傳遞，基因的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物的生理功能，以及細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。第二頁，共三十九頁，2022年，8月28日基因工程第三頁，共三十九頁，2022年，8月28日移液器和EP管第四頁，共三十九頁，2022年，8月28日質(zhì)粒質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，獨(dú)立于染色體之外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸物質(zhì)。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質(zhì)粒。

能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。現(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術(shù)中重要的工具。第五頁，共三十九頁，2022年，8月28日分類：單拷貝質(zhì)粒；多拷貝質(zhì)粒；緊密控制型；松弛控制型；第六頁，共三十九頁，2022年，8月28日第七頁，共三十九頁，2022年，8月28日質(zhì)粒DNA的提取方法堿裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法；概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理。第八頁，共三十九頁，2022年，8月28日基本思路培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需)電泳檢測；第九頁，共三十九頁，2022年，8月28日堿裂解法的基本原理十二烷基磺酸鈉(SDS)可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)SDS處理后，細(xì)菌染色體DNA會纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開。當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。第十頁，共三十九頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟1、將含有質(zhì)粒DNA的細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。取1.5mlLB培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中（需劇烈振蕩）。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物（千萬不要振蕩），冰浴2分鐘。5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，顛倒混勻，冰浴中5分鐘，4℃下12000g離心10分鐘。6、上清液（450uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積的飽和酚（1:1），充分顛倒混勻，4℃下12000g離心10分鐘。第十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日7、將水相（400uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積酚/氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心10min。8、將水相（350uL）移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。9、棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入0.5ml

70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g離心5-10分鐘。10、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。11、將沉淀溶于10μlTE緩沖液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，儲于-20℃冰箱中。第十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日LB液體培養(yǎng)基（Luria-Bertani）稱取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。第十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/L

EDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲存于4℃冰箱溶液I：重懸細(xì)菌；葡萄糖：比重大，使細(xì)菌不易沉淀；Tris－HCl：緩沖體系；EDTA：螯合金屬離子；第十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日溶液Ⅱ0.2mol/L

NaOH（臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋），1％SDS溶液II——破膜，變性基因組DNA和蛋白質(zhì)；SDS——破膜作用，變性蛋白質(zhì)；NaOH——破膜，變性基因組DNA；第十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日溶液Ⅲ5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。溶液III——中和溶液，復(fù)性質(zhì)粒DNA；第十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日酚/氯仿（1:1）酚——變性蛋白質(zhì)；氯仿——萃取溶液中的酚；分為兩層，上層為水層，下層為酚氯仿混合液。吸取時不要震蕩。第十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日乙醇無水乙醇（2倍體積）——沉淀質(zhì)粒DNA；70%乙醇——洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，除去沉淀中的鹽分；第十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日第十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日核酸的定量260nm， 1OD值相當(dāng)于：

雙鏈DNA濃度為50g/ml

單鏈DNA濃度為40g/ml A260/A280=1.8（DNA） A260/A280=2.0（RNA）第二十頁，共三十九頁，2022年，8月28日電泳

Electrophoresis

第二十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日

一、定義

電泳—帶電粒子在直流電場中向著電性相反電極移動的現(xiàn)象。電泳分析技術(shù)—利用電泳現(xiàn)象進(jìn)行物質(zhì)分離的技術(shù)。第二十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日二、電泳分析技術(shù)發(fā)展概況1809年發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象1937年Tiselius自由界面電泳1948年Wieland濾紙電泳1980年

毛細(xì)管電泳

(capiliaryelectrophoresis)第二十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日三、電泳分析技術(shù)的分類1.根據(jù)被分離樣品的量多少分析電泳制備電泳2.根據(jù)電泳電壓的高低常壓電泳0～500V

高壓電泳500～3000V3.根據(jù)電泳中是否使用支持物自由電泳—不使用支持物，在溶液中進(jìn)行。區(qū)帶電泳—使用支持物第二十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日4.按支持物的物理性狀不同濾紙及其他纖維薄膜電泳，如醋酸纖維素、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳粉末電泳，纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳絲狀電泳，如尼龍絲、人造絲電泳第二十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日5.按支持物的裝置形式不同平板式電泳垂直板式電泳垂直柱式電泳第二十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日6.根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)連續(xù)pH電泳—指電泳過程中pH保持不變；不連續(xù)pH電泳—指電極緩沖液和電泳支持物的不同區(qū)段也有不同的pH；第二十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日電泳技術(shù)的特點(diǎn):凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分離,并可進(jìn)行定性或定量分析;樣品用量極少;設(shè)備簡單;可在常溫進(jìn)行;操作簡便省時;分辨率高.第二十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日四、電泳的基本原理一個分子，如能解離或能吸附帶電質(zhì)點(diǎn)，在電場中便會向正極或負(fù)極移動。

第二十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日移動速度——以蛋白質(zhì)分子為例:F=EQ（Q：有效電荷;E：電位梯度）F’=6rv（F’：摩擦阻力;v：在介質(zhì)粘度η中半徑為r的顆粒的移動速度）F=F’EQ=6rv

EQv=————6r

第三十頁，共三十九頁，2022年，8月28日

遷移率（Mobility)——帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下的泳動速度。

VQM==E6r

第三十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日五、影響電泳速度的因素1.電場強(qiáng)度（E）E↑→電流↑→熱效應(yīng)→支持介質(zhì)上的水分蒸發(fā)→樣品的熱變性

E↓→電泳速度慢→延長電泳時間→樣品擴(kuò)散→區(qū)帶模糊不清→分辨率下降2.帶點(diǎn)顆粒的半徑

r↑→阻力↑→電泳速度變慢3.支持物介質(zhì)——吸附作用；電滲作用；分子篩作用緩沖液

離子強(qiáng)度（I）：I↑→緩沖能力越大→緩沖液所載的分電流增加，而樣品所載的電流相應(yīng)減少→電泳速度減慢

pH：pH值決定了化合物解離的程度，也決定了質(zhì)點(diǎn)所帶的凈電荷。第三十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日電泳在一定電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型(相對分子質(zhì)量不同的DNA片段泳動速度不一樣)，且DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。第三十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠從瓊脂中除去帶電荷的瓊脂膠后，剩下的不含磺酸基團(tuán)、羧酸基團(tuán)等帶電荷基團(tuán)的中性部分，結(jié)構(gòu)是鏈狀的聚半乳糖，易溶于沸水，冷卻后可依靠糖基間的氫鍵引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠的網(wǎng)孔大小和凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于瓊脂糖濃度。因此瓊脂糖凝膠可作為分子篩，常用于凝膠層析和電泳。

第三十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日電泳鑒定其中超螺旋結(jié)構(gòu)泳動最快；其次為線性結(jié)構(gòu)；最慢的可能是復(fù)制中間體（沒有復(fù)制完的兩個質(zhì)粒連在一起）；第三十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日染料——E