實驗基本技術(shù)

實驗基本技術(shù)第一頁，共八十頁，2022年，8月28日細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)第二頁，共八十頁，2022年，8月28日無菌操作技術(shù)消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)滅菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐劑抑菌(bacteriostasis)和抑菌劑(bacteriostatic)無菌(asepsis)無菌技術(shù)/無菌操作(antiseptictechnique)第三頁，共八十頁，2022年，8月28日【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會。

【操作野消毒】無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩鳌U液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。

第四頁，共八十頁，2022年，8月28日【洗手和著裝】原則上和外科手術(shù)相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽?！净鹧嫦尽吭跓o菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行?！静僮鳌窟M(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。第五頁，共八十頁，2022年，8月28日培養(yǎng)細(xì)胞的觀察１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)第六頁，共八十頁，2022年，8月28日第七頁，共八十頁，2022年，8月28日細(xì)胞計數(shù)1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

第八頁，共八十頁，2022年，8月28日第九頁，共八十頁，2022年，8月28日根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種：1．懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2．半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3．貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細(xì)胞傳代方法第十頁，共八十頁，2022年，8月28日貼壁生長細(xì)胞傳代方法1吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。3吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5離心，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液制成懸液。5吸取1/10—1/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。6加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。7將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第十一頁，共八十頁，2022年，8月28日任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。培養(yǎng)細(xì)胞活力測定第十二頁，共八十頁，2022年，8月28日1．臺盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色；用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力；方法：

1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中；

2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘；

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片；

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計細(xì)胞活力；

死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細(xì)胞計數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。

第十三頁，共八十頁，2022年，8月28日2．四唑鹽（MTT）比色法

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；MTT比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值；MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。第十四頁，共八十頁，2022年，8月28日操作步驟：

（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）；（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時；（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解；（4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長570納米）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。第十五頁，共八十頁，2022年，8月28日第十六頁，共八十頁，2022年，8月28日細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。第十七頁，共八十頁，2022年，8月28日凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶很大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。第十八頁，共八十頁，2022年，8月28日慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：

當(dāng)溫度在-25℃以上時，1～2℃/min當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，5～10℃/min當(dāng)溫度達(dá)-100℃時，可迅速放入液氮中簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投入液氮中。第十九頁，共八十頁，2022年，8月28日低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。第二十頁，共八十頁，2022年，8月28日細(xì)胞凍存方法1．預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；2．取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)；3．加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。第二十一頁，共八十頁，2022年，8月28日細(xì)胞復(fù)蘇方法

（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。第二十二頁，共八十頁，2022年，8月28日免疫組化基本技術(shù)第二十三頁，共八十頁，2022年，8月28日

1、標(biāo)本的取材

2、組織的固定

3、脫水、透明和包埋

4、切片 一、組織與細(xì)胞材料的制備第二十四頁，共八十頁，2022年，8月28日手術(shù)切除標(biāo)本，各種活檢穿刺標(biāo)本、尸體解剖標(biāo)本和動物組織標(biāo)本。原則上，應(yīng)盡快取材，但比較大的手術(shù)標(biāo)本如胃、肺、腸等器官，最好先固定后取材。細(xì)胞大量培養(yǎng)后，經(jīng)消化將細(xì)胞制成懸液（106）涂在涂有切片粘合劑的載玻片上，涼干后固定。1、標(biāo)本的取材第二十五頁，共八十頁，2022年，8月28日防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。

常用固定液有：甲醛、4％多聚甲醛、BouinS液等。固定時間要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時間成正比，固定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。組織固定后必須徹底沖洗。2、組織標(biāo)本的固定第二十六頁，共八十頁，2022年，8月28日脫水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ乙醇，無水乙醇

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ

浸蠟：石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ

石蠟包埋：修蠟塊，標(biāo)號

3、組織脫水、浸蠟及包埋

第二十七頁，共八十頁，2022年，8月28日切片可分石蠟切片、冰凍切片、火棉膠切片，IHC切片要求不同與常規(guī)切片，需連續(xù)有序，防止脫片等特殊要求。4、組織切片第二十八頁，共八十頁，2022年，8月28日

1、石蠟切片的脫蠟至水

2、內(nèi)源性酶的消除方法

3、熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)

4、顯示系統(tǒng)的選擇和配制

5、襯染劑的選擇和配制

二、IHC的一些基本技術(shù)第二十九頁，共八十頁，2022年，8月28日冰凍切片從-80℃取出，涼干或電吹風(fēng)吹干后可直接進(jìn)行免疫組化標(biāo)記。石蠟切片需經(jīng)如下脫蠟才能做IHC。

二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯10minⅢ，無水乙醇2min，95％乙醇2min，85％乙醇2min，75％乙醇2min，流水沖洗。

1、石蠟切片脫蠟至水第三十頁，共八十頁，2022年，8月28日1.內(nèi)源性過氧化物酶的消除方法：0.3%～3%H2O2甲醇液20min；1％H2O220min；3％苯肼溶液37℃1h；0.075%鹽酸甲醇液30min等。

2.內(nèi)源性堿性磷酸酶的消除方法：10％醋酸10min；0.5mol/L碳酸氫鈉（pH9.0）20min；1mol/L左旋咪唑20min。

3.內(nèi)源性生物素的消除方法：2-甲基-D苷露糖飽和生物素；先用25μg/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素飽和液中處理15min，PBS洗15min。2、內(nèi)源性酶的消除方法第三十一頁，共八十頁，2022年，8月28日1.抗原修復(fù)(AntigenRetrieval;AR)是以高溫、高壓對常規(guī)固定的石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)或復(fù)原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術(shù)手段。

2.修復(fù)方式：①微波96℃±10min×2；②直接加溫100℃，15min；③水浴鍋100℃，15min；④高壓鍋/消毒鍋120℃，5min；⑤真空加熱10min；⑥直接烤片法。3、熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)第三十二頁，共八十頁，2022年，8月28日

3.修復(fù)介質(zhì)：①0.01MpH6.0檸檬酸緩沖液(CB)；②0.05mTris-HCL(pH1-12系列);③0.01MpH7.0PBS;④2%硫酸鋁；⑤2％硝酸鋁；⑥生理鹽水；⑦蒸餾水。認(rèn)為修復(fù)介質(zhì)種類和溶液的摩爾濃度對修復(fù)效果影響較小，而pH值則影響較大。緩沖液以CB和Tris-HCL較常見。

4.溫度與修復(fù)時間的關(guān)系：許多的實驗結(jié)果表明，溫度高修復(fù)時間短，呈正相關(guān)。例如，Ki-67、P-gp的檢測，利用同一切片，達(dá)到相同的染色結(jié)果如下步驟：①100℃20min；②90℃40min；③80℃60min；④70℃20h。3、熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)第三十三頁，共八十頁，2022年，8月28日

目前用于IHC的標(biāo)記酶主要有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AKP）。HRP顯示系統(tǒng)為：3、3’-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3、3’-diaminbezidine;DAB)、3-氨基-9-乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC)、四甲基聯(lián)苯胺、鹽酸對苯二胺、4-氯-1-萘酚、高香草酸、α–萘酚派若寧HRP顯示系統(tǒng)為：BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)＋NBT(硝基四氮唑藍(lán))、α–萘酚AS-BI磷酸鹽＋快紅或快藍(lán)。4、顯示系統(tǒng)的選擇第三十四頁，共八十頁，2022年，8月28日5、襯染劑的選擇和配制1.Mayer氏蘇木素：取1gMayer氏蘇木素加溫溶于100ml蒸餾水中，再加入50g碘酸鈉和50g鉀明礬，溶解后加入枸櫞酸和水合氯醛，溶解后過濾。

2.Harris氏蘇木素：取2.5gHarris氏蘇木素溶于25ml無水乙醇中，另將鉀明礬加溫溶于500ml蒸餾水中，待鉀明礬全部溶解，再將二液混合在一起，加入氧化汞，溶解30min，冷卻后過濾，使用時加醋酸4ml，可增加染色強(qiáng)度。第三十五頁，共八十頁，2022年，8月28日3.甲基綠：取2％甲基綠水溶液20ml傾入潔凈的分液漏斗，加入三氯甲烷充分搖蕩混合，使甲基綠中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞，移去紫紅色的三氯甲烷，如此反復(fù)更換氯仿，直到氯仿為無色。

4.核固紅：取0.1g核固紅溶于100ml15％硫酸鋁水溶液，加熱溶解，冷卻后過濾。5、襯染劑的選擇和配制第三十六頁，共八十頁，2022年，8月28日第三十七頁，共八十頁，2022年，8月28日第三十八頁，共八十頁，2022年，8月28日第三十九頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十一頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十二頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十三頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十四頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十五頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十六頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十七頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十八頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十九頁，共八十頁，2022年，8月28日第五十頁，共八十頁，2022年，8月28日第五十一頁，共八十頁，2022年，8月28日RT-PCR基本技術(shù)第五十二頁，共八十頁，2022年，8月28日Trizol提取RNA原理Trizol法提取細(xì)胞總RNA是目前常用的提取方法。細(xì)胞內(nèi)大部分的RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白形式存在。Trizol內(nèi)含異硫氰酸胍和苯酚等物質(zhì)。異硫氫酸胍(GuSCN)是一種強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑，不僅能使細(xì)胞裂解，同時還能有效地抑制細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶的活性。通過有機(jī)溶劑的分步抽提，最終可獲得純度較高的細(xì)胞總RNA。第五十三頁，共八十頁，2022年，8月28日RNA提取注意事項

Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮膚接觸Trizol，請立即用大量水沖洗。RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意隨時勤換手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)；盡量不要對著RNA樣品呼氣或說話。用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低最后得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細(xì)胞中。在清洗和裂解細(xì)胞時最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。

第五十四頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄(ReverseTranscription)逆轉(zhuǎn)錄指遺傳信息從RNA流向DNA，是RNA指導(dǎo)下的DNA合成過程，即以RNA為模板，四種dNTP為原料，合成與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，稱為互補(bǔ)DNA(complementaryDNA, cDNA)RNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶第五十五頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄原理cDNA合成有兩個關(guān)鍵因素，一是病毒RNA的質(zhì)量，二是逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它能在一定的條件下，以單鏈RNA為模板合成第一條cDNA鏈。通過RNaseH活性水解RNA-DNA雜合分子中的RNA鏈。第五十六頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄酶催化逆轉(zhuǎn)錄過程的酶稱逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA病毒中都含有此酶。具有三種酶活性：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶

RNA水解酶活性

DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶第五十七頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄體系RNA模板——

3’UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA5’引物——

5’ATCCGGAC逆轉(zhuǎn)錄酶dATPdGTPdCTPdTTPMn2+酶活性依賴金屬離子底物第五十八頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄過程中cDNA的合成依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNA的DNA聚合酶第五十九頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇Oligo(dT)(12-18個核苷酸組成），只有mRNA被逆轉(zhuǎn)錄隨機(jī)六聚寡核苷酸，所有RNA均被逆轉(zhuǎn)錄基因特異性引物，僅產(chǎn)生需要的DNA第六十頁，共八十頁，2022年，8月28日以DNA為模板，利用DNA聚合酶的特性體外擴(kuò)增特定的基因片斷，這種方法被稱為DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。PCR

基因放大連瑣反應(yīng)PCR反應(yīng)第六十一頁，共八十頁，2022年，8月28日PCR基本原理利用高溫可使DNA變性和低溫可使DNA復(fù)性的特性，根據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中DNA半保留復(fù)制機(jī)理，以特異性寡核苷酸為引物，DNA分子為模板，在DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸存在的條件下體外合成新DNA分子的過程。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。第六十二頁，共八十頁，2022年，8月28日第六十三頁，共八十頁，2022年，8月28日PCR基本成分templateprimersTaqpolymerase10×PCRbufferdNTPsMg++第六十四頁，共八十頁，2022年，8月28日PCRPrimers第六十五頁，共八十頁，2022年，8月28日PCRPrimers序列發(fā)現(xiàn)的時間和發(fā)現(xiàn)者序列的生物體來源序列的組織來源第六十六頁，共八十頁，2022年，8月28日第六十七頁，共八十頁，2022年，8月28日引物設(shè)計引物長度（length）:20～30bp引物中四種堿基的分布應(yīng)該是隨機(jī)的兩引物間不能有互補(bǔ)序列，尤其是3‘端引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域由同源性引物的3’末端堿基一定要與模板DNA配對可以在5’末端加上限制性內(nèi)切酶位點或起始密碼解鏈溫度(Tm)：兩引物間相差不大于5℃引物內(nèi)部不能有大于3bp的反向重復(fù)序列或自身互補(bǔ)序列存在第六十八頁，共八十頁，2022年，8月28日PCR基本程序預(yù)變性（Pre-denaturation)變性(Denaturation)退火(Annealing)延伸(Elongation)25-30cycles第六十九頁，共八十頁，2022年，8月28日PCR反應(yīng)取無菌02mlPCR管一支，加入：10PCR緩沖液5μl氯化鎂4μl4種ｄNTP混合液(10mmol/L)05μl3端引物(10μmol/L)1μl5端引物(10μmol/L)1μlTaqDNA多聚酶(5u/μl)025μl三蒸水3325μl模板cDNA5μl蓋緊蓋子，離心數(shù)秒后置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR循環(huán)為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性30s、55℃復(fù)性30s、72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72C延伸7min。第七十頁，共