肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell)的分離步驟

肺泡上皮細胞(alveolarepithelialcell)的分離步驟一、取得完全無血液殘留的肺臟：實驗前j將大鼠全身血液放凈，取得完全無血液殘留的肺臟二、消化肺組織：常用于細胞消化的酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分離上皮細胞的酶，現(xiàn)在一般用損傷性小的彈性蛋白酶來替代胰蛋白酶。但這種酶卻有活性不穩(wěn)定，有效作用時間短暫，容易自我降解等問題。DobbsLG等認為彈性蛋白酶能更有選擇性的消化分離上皮細胞［9］。胰蛋白酶消化沒有選擇性，會帶來像內(nèi)皮細胞和間質(zhì)細胞等一些不能在后面的分離步驟中去除的雜質(zhì)細胞，因此彈性蛋白酶更有助于提高上皮細胞的純度和產(chǎn)量。與此相反，CunninghamAC等發(fā)現(xiàn)，與彈性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以獲得更大產(chǎn)量的II型上皮細胞［10］。膠原酶可以用來輔助消化細胞間質(zhì)。用幾種酶混合的方法比單一酶消化效果更好，但目前還沒有文獻定量描述最優(yōu)化的酶消化方法。FinkelsteinJN等發(fā)現(xiàn)可以通過支氣管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺組織剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的實驗中也證實了通過支氣管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。三、分離純化細胞：上皮細胞的分離純化技術經(jīng)過二三十年的發(fā)展日漸成熟，呈現(xiàn)多樣化的特點。目前對細胞的分離純化主要有以下幾種方法。1、密度梯度離心：密度梯度離心分離細胞的原理是不同細胞的沉降系數(shù)不同，在密度梯度離心中細胞所處的位置也相應不同。這是最早用于分離II型上皮細胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不連續(xù)梯度離心，豬肺泡II型細胞最終純度可以達^U70%?85%左右［11-12］。沉降系數(shù)與細胞的直徑和天然密度有關。由于II型細胞與其他細胞存在密度和大小的交叉（如巨噬細胞），僅僅通過離心并不能有效去除雜細胞。Kikkawa（1974）讓巨噬細胞吞噬一些重顆粒（如硫酸鋇），改變其密度，可以幫助區(qū)分巨噬細胞和上皮細胞。離心后的純度達到94%,但產(chǎn)量明顯減少［8］。上皮細胞的大小和密度變化范圍較大，用密度梯度離心要丟掉和其他細胞重疊的細胞層，這必然會造成某些密度大的II型細胞損失，產(chǎn)量大大降低。2、濾膜分離：濾膜分離的原理是根據(jù)細胞的大小不同來進行分離。II型上皮細胞約10um，比巨噬細胞（約25um）和1型細胞（50umT00um）小，用150卩m孔徑的濾膜初濾除去大的組織碎片，30um-40um孔徑的濾膜除去全部II型細胞和部分巨噬細胞［13］，采用15um的濾膜精濾。用濾膜分離操作簡單，它和其他分離方法聯(lián)合使用可以提高純度。3、流式細胞技術：流式細胞技術分離的原理是根據(jù)不同細胞之間的熒光差異。根據(jù)不同種細胞的特征識別，用熒光物質(zhì)標記篩選。上皮細胞內(nèi)含有豐富的脂類物質(zhì)，用親脂性熒光素標記，可以得到純度很高的細胞。FunkhouserJD等用抗II型上皮細胞的單抗進行免疫熒光標記，再用流式細胞儀進行篩選，得到96%的II型上皮細胞［14］。但熒光素對被標記細胞有害。RochatTR等發(fā)現(xiàn)自然熒光和直角光散射可以區(qū)分巨噬細胞和單核細胞，這給不經(jīng)熒光標記分離上皮細胞提供了可能［15］。流式技術分離細胞的產(chǎn)量很低，但純度極高。這種技術經(jīng)過完善在將來會更有吸引力。4、免疫黏附：免疫黏附的原理是各種細胞的膜表面有不同的免疫活性物質(zhì)。巨噬細胞和其他大多數(shù)非II型細胞表面都有IgG上的Fc片段的受體。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把細胞懸液置于板上，巨噬細胞和其他大多數(shù)非II型細胞因為含有Fc片段的受體而與IgG結合，吸附到板上，不黏附的II型細胞被沖洗下來［16］。經(jīng)過多年的摸索，這種方法近幾年已開始應用，簡便易行，可除去絕大多數(shù)的巨噬細胞，有效的提高上皮細胞的純度。5、