氧化應(yīng)激損傷的生物化學(xué)診斷

氧化應(yīng)激損傷的生物化學(xué)診斷第一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日教學(xué)目標(biāo)與要求

掌握：自由基、活性氧、氧化應(yīng)激、歧化反應(yīng)的概念及脂質(zhì)過氧化作用。氧化應(yīng)激指標(biāo)的種類。

熟悉：氧化應(yīng)激的損傷效應(yīng)；主要活性氧、過氧化脂質(zhì)、抗氧化酶、NO與NOS以及常用抗氧化劑的常用檢測方法的原理及方法學(xué)評價(jià)。

了解：心肌缺血再灌注、衰老的概念；氧化應(yīng)激的原因，抗氧化損傷的防御系統(tǒng)組成與作用。2第二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日目錄

氧化應(yīng)激的生物化學(xué)基礎(chǔ)

1氧化應(yīng)激的生物學(xué)效應(yīng)

2抗氧化應(yīng)激損傷的防御系統(tǒng)3氧化應(yīng)激與臨床疾病的關(guān)系4氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測方法及評價(jià)5小結(jié)與展望6返回總目錄3第三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第一節(jié)氧化應(yīng)激的生物化學(xué)基礎(chǔ)一、氧化應(yīng)激的概念氧化應(yīng)激（oxidativestress,OS）是指多種原因致使體內(nèi)的活性氧(ROS)

、活性氮(RNS)等相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷。4第四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)如：超氧陰離子(O2)、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）、氫過氧化物（ROOH）

氧自由基（oxygenradical）活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)如：一氧化氮（NO）、過氧亞硝酸根（ONOO－）5第五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(一)外源性因素1．電離輻射及大氣污染γ和X射線等；2．藥物解熱鎮(zhèn)痛藥、抗結(jié)核藥；3．其他環(huán)境污染的鎘、水銀、鉛等重金屬離子。二、氧化應(yīng)激產(chǎn)生的原因6第六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(二)內(nèi)源性因素1．O2的產(chǎn)生·2．·OH的產(chǎn)生3．吞噬細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生4．脂質(zhì)過氧化作用7第七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.O2的產(chǎn)生·SQ·+O2Q+O2·通過線粒體的輔酶Q·半醌、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上細(xì)胞色素P450和Hb、肌紅蛋白、腎上腺素等自氧化作用均可產(chǎn)生O2

·

8第八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日黃嘌呤氧化酶黃嘌呤＋2O2＋H2O尿酸＋2O2＋2H+·

酶促氧化過程中均可產(chǎn)生O2·

胞液中的黃嘌呤氧化酶與醛氧化酶

線粒體中的黃素蛋白酶

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶

質(zhì)膜上的NADPH氧化酶等9第九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2．·OH的產(chǎn)生O2+O2+2H+H2O2+O2(歧化反應(yīng))··過渡金屬離子O2＋H2O2O2＋·OH＋OH－(Fenton反應(yīng))·主要是通過Fenton反應(yīng)由O2直接衍生形成：·

歧化反應(yīng)是指反應(yīng)中的某種底物既能作為還原劑供應(yīng)電子，又可作為氧化劑接受電子。上述反應(yīng)中的O2就承擔(dān)這種角色，故屬于歧化反應(yīng)?！?0第十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日過氧化物酶體中多種需氧脫氫酶催化生成的H2O2，如不迅速被分解，在Fe2+的催化下也可生·OH。H2O2＋Fe2++H+

·OH＋H2O＋Fe3+11第十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日

3．吞噬細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生

H2O2除可生成·OH外，在Cl－存在時(shí)，經(jīng)髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的作用，生成活性很強(qiáng)的次氯酸(HOCl)和1O2，1O2是一個(gè)強(qiáng)的親電子性的氧化劑。MPOH2O2＋Cl－H2O＋OCl－OCl－＋H2O2H2O＋1O2＋Cl－MPO12第十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日4．脂質(zhì)過氧化作用(lipidperoxidation)在過氧化條件下，脂過氧化物

LOOH是不穩(wěn)定的，能分解成一系列復(fù)雜產(chǎn)物。通常以小分子降解產(chǎn)物的數(shù)量來表示脂質(zhì)過氧化的程度。定義：機(jī)體產(chǎn)生的活性氧，攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUFA)引發(fā)一種自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，鏈?zhǔn)降禺a(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，這種作用就稱～。返回章目錄13第十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日一、氧化應(yīng)激對機(jī)體的生理作用第二節(jié)氧化應(yīng)激的生物學(xué)效應(yīng)

(一)吞噬細(xì)胞殺滅外來病原微生物吞噬作用所產(chǎn)生的活性氧如H2O2、O2、·OH、1O2和HOCl等可用來殺滅外來病原微生物?！?4第十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日合成凝血酶原時(shí)，凝血酶原前體的羧化過程需要O2和CO2反應(yīng)形成的“活性碳”?！?二)參與合成某些重要的生物活性物質(zhì)合成前列腺素時(shí)需要H2O2和O2的參與?！⑴c第二信使cAMP和cGMP的激活等過程。15第十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日氨基酸的氧化脫氨作用需自由基的參與；核糖核苷的還原過程需自由基的參與。(三)參與許多酶促反應(yīng)羥脯氨酸、羥賴氨酸的酶促羥化作用需要O2，·OH，H2O2或1O2的參與；·(四)參與解毒作用外來物質(zhì)通過細(xì)胞色素P450的羥化作用達(dá)到解毒作用，O2

參與了羥化作用?！?6第十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日自由基參與一系列的連鎖反應(yīng)，能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞損傷。其機(jī)制比較復(fù)雜，主要有三方面：膜脂改變導(dǎo)致膜功能的障礙和膜酶的損傷；脂質(zhì)過氧化過程中生成的活性氧對酶和其他成分的損傷；LOOH的分解產(chǎn)物特別是醛類產(chǎn)物對細(xì)胞及其成分的毒性作用。二、氧化應(yīng)激對機(jī)體的損害效應(yīng)17第十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(一)氧化應(yīng)激對脂類和細(xì)胞膜的破壞膜內(nèi)不飽和脂肪酸減少；膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，使其流動(dòng)性、通透性、離子轉(zhuǎn)運(yùn)及屏障功能受損；溶酶體酶釋放，線粒粒膨脹、酶失活等損傷；紅細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致溶血；LOOH進(jìn)一步分解產(chǎn)生醛類，尤其是丙二醛(MDA)可作為交聯(lián)劑導(dǎo)致分子間的交聯(lián)聚合。胞膜的損害則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝、功能和結(jié)構(gòu)的改變，后者是許多疾病的病理基礎(chǔ)，從而可引起許多病變。18第十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(二)氧化應(yīng)激對蛋白質(zhì)和酶的損害直接作用于蛋白質(zhì)（Pr），與最鄰近的氨基酸（AA）發(fā)生Pr過氧化；通過LOOH間接作用于Pr，使多肽鏈斷裂或與個(gè)別AA發(fā)生氧化或使Pr交聯(lián)，從而使Pr的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂。

19第十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日脂質(zhì)過氧化、電離輻射、其他產(chǎn)生的自由基的反應(yīng)可通過多種途徑影響酶活性:通過自由基鏈反應(yīng)，使酶分子發(fā)生聚合；通過LOOH中的MDA使酶分子發(fā)生交聯(lián)；通過破壞酶分子中AA以及與酶分子中的金屬離子反應(yīng)。20第二十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日使DNA鏈斷裂或堿基破壞、缺失，使核酸分子的完整性和構(gòu)型受到破壞，造成遺傳信息改變；(三)氧化應(yīng)激對核酸和染色體的損害自由基對DNA的破壞可導(dǎo)致染色體變異；電離輻射和化學(xué)物質(zhì)使受損細(xì)胞的染色體斷裂。輻射作用于核酸環(huán)境中的水分子，使其電解產(chǎn)生·OH和O2，輻射可使DNA主鏈斷裂、堿基降解和氫鍵破壞；·21第二十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(四)氧化應(yīng)激對糖分子的損害使核糖、脫氧核糖形成脫氫自由基，從而造成DNA主鏈斷裂或堿基破壞；使細(xì)胞膜中的糖分子羥基化，破壞細(xì)胞膜上的多糖結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞功能的發(fā)揮；通過氧化降解使多糖破壞，影響組織功能。

脂類、蛋白質(zhì)、核酸、糖類一旦受損，生命活動(dòng)將受到威脅，導(dǎo)致細(xì)胞受損，機(jī)體患病，如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤、胃腸道功能失調(diào)、感染、免疫失調(diào)等。返回章目錄22第二十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日一、抗氧化酶類第三節(jié)抗氧化應(yīng)激損傷的防御系統(tǒng)超氧化物歧化酶（SOD）過氧化氫酶（CAT）硒谷胱甘肽過氧化物酶（SeGSHPx）谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）與抗氧化作用相關(guān)的其他酶（如醛酮還原酶）23第二十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)SOD是金屬酶，包括三種同工酶CuZn-SOD在真核細(xì)胞胞液中，以Cu2+-Zn2+為輔基Mn-SOD在原核和真核細(xì)胞的線粒體中，以Mn2+為輔基Fe-SOD在原核細(xì)胞中，以Fe3+為輔基SOD2O2+2H+H2O2+O2（歧化反應(yīng)）·24第二十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.過氧化氫酶(catalase,CAT)CAT2H2O2H2O+O2可清除O2的歧化產(chǎn)物H2O2

·25第二十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.硒谷胱甘肽過氧化物酶(seleniumdependent

glutathioneperoxidase,SeGSHPx)還發(fā)現(xiàn)一新的硒酶：PHGSHPx，稱磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶，能清除生物膜上的磷脂氫過氧化物，防止生物膜的脂質(zhì)過氧化PHGSHPx是單體酶SeGSHPx是由4個(gè)相同亞基構(gòu)成的寡聚酶LOOH(H2O2)＋2GSH

LOH(H2O)+H2O＋GSSGSeGSHPx可清除LOOH或H2O2，抑制自由基的生成26第二十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日如醛酮還原酶，可催化脂肪醛和脂肪醛-谷胱甘肽加成物的還原，以清除脂質(zhì)過氧化作用的毒性產(chǎn)物。4．谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase,GST)屬不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶，只清除LOOH，而不能清除H2O2。LOOH＋2GSHLOH＋H2O＋GSSGGST5．與抗氧化作用相關(guān)的其他酶27第二十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日脂溶性抗氧化劑水溶性小分子抗氧化劑蛋白性抗氧化劑二、抗氧化劑28第二十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.維生素E

清除O2、·OH、脂過氧基

LOO·及1O2，防止脂質(zhì)過氧化?！?.β-胡蘿卜素清除1O2、LOO·、O2、及·OH，防止脂質(zhì)過氧化。·3.輔酶Q既參與自由基的生成也具有抗氧化作用，CoQH2較氧化型的抗氧化作用強(qiáng)。4.固醇類激素雌激素可能與結(jié)構(gòu)中的酚基相關(guān)，但大劑量可生成O2，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生?！?一)脂溶性抗氧化劑29第二十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日VC還可與維生素E自由基(VE·)反應(yīng)，使其恢復(fù)為還原型維生素E，而本身變成VC·，后者可由依賴于NADH的氧化還原酶系統(tǒng)還原成VC。VC與VE兩者有協(xié)同作用。因此VC的總效果與其濃度有關(guān)。VC的不利作用：將Fe3+還原成Fe2+，H2O2存在時(shí)，可通過Fenton反應(yīng)形成·OH；但它又可清除·OH。維生素C(又稱抗壞血酸)

能直接與·OH、O2和1O2作用，是機(jī)體重要的活性氧清除劑?！?二)水溶性小分子抗氧化劑30第三十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日

H2O2＋2GSH──→GSSG＋2H2O

LOOH＋GSH──→GSSG＋LOH＋H2O

·OH＋GSH──→H2O＋GS·2GS·──→GSSG4.色氨酸代謝產(chǎn)物

3-羥犬尿酸，黃尿酸和3-羥鄰氨基苯甲酸等均含有酚羥基，抑制脂質(zhì)過氧化作用。2.谷胱甘肽(GSH)

為H2O2、LOOH、·OH和1O2重要清除劑。3.尿酸

清除1O2和·OH，抑制脂質(zhì)過氧化。31第三十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.銅藍(lán)蛋白具有亞鐵氧化酶活性，能催化Fe2+氧化成Fe3+，抑制由Fe2+催化H2O2生成·OH的反應(yīng)，從而防止·OH引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用。銅藍(lán)蛋白還是吞噬細(xì)胞呼吸爆炸生成的氧代謝產(chǎn)物O2和OCl－的主要清除劑?！?三)蛋白性抗氧化劑32第三十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.清蛋白結(jié)合的膽紅素有效地清除1O2、O2和LOO·。保護(hù)與清蛋白結(jié)合的不飽和脂肪酸和清蛋白本身免受活性氧損傷。腸道的抗氧化劑，保護(hù)維生素A和不飽和脂肪酸免受氧化破壞。膽紅素在mol/L濃度時(shí)即能保護(hù)血漿蛋白免受過氧亞硝酸致的氧化修飾，或通過清除自由基減輕血漿蛋白損傷。33第三十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.其他血漿蛋白清蛋白可結(jié)合銅離子抑制·OH形成和有效清除OCl－

。結(jié)合珠蛋白和血液結(jié)合素(hemopexin)能與Hb結(jié)合，促使Hb由受損組織和炎癥局部排出，以減輕Hb對組織的損傷作用。轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白，對鐵催化的脂質(zhì)過氧化作用是強(qiáng)氧化劑。轉(zhuǎn)鐵蛋白還能清除OCl－

。上述抗氧化酶與抗氧化劑均屬于機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)34第三十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.二甲亞砜及甘露醇兩者均有清除·OH的作用。二甲亞砜近來已用于抗腦水腫。1.

別嘌呤醇黃嘌呤氧化酶的抑制劑，能降低O2的生成，是心肌缺血再灌注氧自由基抑制劑，但只有在灌注前用藥，才能收到明顯效果。(四)近年來發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑35第三十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日4.白細(xì)胞功能抑制劑前列環(huán)素(PGI2)是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的花生四烯酸主要代謝物，能抑制血小板聚集，保護(hù)冠狀動(dòng)脈。它還能抑制中性粒細(xì)胞激活，減少自由基生成。(四)近年來發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑3.鈣拮抗劑尼可地平、硝苯啶、維拉帕米和硫氮卓銅等有保護(hù)細(xì)胞和升高GSH的作用。36第三十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日5.N-乙酰半胱氨酸它本身是抗氧化劑，而且還是胞內(nèi)合成GSH的原料。6.普羅布可(Probucol)是一種很強(qiáng)的脂溶性抗氧化劑或自由基清除劑,該藥有延緩泡沫細(xì)胞發(fā)生的的能力，可用于AS的輔助治療。(四)近年來發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑返回章目錄37第三十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日一、氧化應(yīng)激與心血管疾病第四節(jié)氧化應(yīng)激與臨床疾病的關(guān)系動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)AS的發(fā)病機(jī)制尚未明了。脂肪浸潤、血小板聚集、血栓形成和克隆等多種學(xué)說從不同角度闡明了其發(fā)病機(jī)制。近年來自由基與LOOH在AS發(fā)病機(jī)制中的作用受到普遍關(guān)注。高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙等易患因素均可增加細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷，促進(jìn)AS形成。(一)氧化應(yīng)激與動(dòng)脈粥樣硬化38第三十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日自由基和LOOH可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)腫脹和破損，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化發(fā)生。LDL受到自由基作用，形成過氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)，大量沉積于EC，最終形成AS。Ox-LDL可導(dǎo)致血小板聚集，促使自由基大量產(chǎn)生，從而加速AS發(fā)展。氧化應(yīng)激與LOOH在AS發(fā)病機(jī)制中的作用：39第三十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日近年研究進(jìn)展：

AS的發(fā)生與·OH和次氯酸致的蛋白氧化修飾存在相關(guān)性

AS病灶中EC、平滑肌細(xì)胞(SMC)及單核細(xì)胞的SiS基因表達(dá)↑↑氧化應(yīng)激刺激血管SMC的增殖，參與了原癌基因的激活及異常表達(dá)從基因水平揭示:氧化應(yīng)激與AS之間的密切關(guān)系40第四十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日

(二)氧化應(yīng)激與心肌缺血再灌注損傷缺血再灌注損傷

在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官的損傷反而加重的現(xiàn)象。目前心肌缺血再灌注損傷的確切機(jī)制仍不明了,與自由基作用有關(guān)的機(jī)制有:

脂質(zhì)過氧化↑細(xì)胞內(nèi)鈣超載細(xì)胞成分間的交聯(lián)PGI2/TXA2失調(diào),微循環(huán)障礙TXA2：血栓素A2（thromboxaneA2）41第四十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日氧化應(yīng)激致癌與促癌機(jī)制：

1.氧化應(yīng)激對DNA的作用2.氧化應(yīng)激對蛋白質(zhì)的作用3.氧化應(yīng)激對脂質(zhì)的作用4.基因損傷與致癌、促癌的關(guān)系

42第四十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.氧化應(yīng)激對DNA的作用電離輻射可直接作用于DNA，產(chǎn)生自由基；電離輻射也可間接產(chǎn)生羥基DNA自由基；在有氧條件下DNA自由基與氧作用成為過氧由基；這些自由基是造成DNA鏈斷裂的原因。43第四十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日主要是修飾氨基酸殘基，引起結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的改變，造成肽鍵斷裂，聚合和交聯(lián)，造成細(xì)胞選擇性生長和改變基因表達(dá)。2.氧化應(yīng)激對蛋白質(zhì)的作用44第四十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日

3.氧化應(yīng)激對脂質(zhì)的作用氧化應(yīng)激不但可通過生物膜中的PUFA的過氧化引起細(xì)胞損傷，而且還可通過LOOH的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞的損傷。45第四十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日4.基因損傷與致癌、促癌的關(guān)系致癌物和促癌物均可造成基因損傷?；驌p傷主要為DNA單鏈或雙鏈的斷裂，重排或堿基修飾?；瘜W(xué)致癌物的最終致癌形成包括某些自由基可選擇性作用于DNA的核苷酸而激活原癌基因。46第四十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日它是生物體隨著增齡而發(fā)生的退行性變化的總和，表現(xiàn)為機(jī)體功能活動(dòng)的進(jìn)行性下降，機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境恒定和對環(huán)境的適應(yīng)能力逐漸降低。人的生命周期中有一個(gè)隨時(shí)間進(jìn)展而表現(xiàn)出不斷惡化，直到死亡的過程，老年醫(yī)學(xué)將該過程稱為衰老(aging或senscence)。三氧化應(yīng)激與衰老47第四十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1956年Harman的衰老的自由基學(xué)說：機(jī)制：隨著年齡增長，體內(nèi)有大量過剩的自由基積累。過多的自由基引發(fā)胞膜脂質(zhì)氧化，其產(chǎn)物MDA造成細(xì)胞內(nèi)核酸變性及功能障礙。脂褐素(lipofuscin)是衰老的基本特征脂褐素的形成涉及脂質(zhì)過氧化體內(nèi)過量的自由基及其所誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)長期使細(xì)胞受到損害，導(dǎo)致人體衰老和死亡。48第四十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1978年Zs-Nagy提出的衰老膜學(xué)說

(themembranehypothesisofaging,MHA)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)交聯(lián)以及質(zhì)膜上所產(chǎn)生的殘熱可引起胞膜物理-化學(xué)特性的改變，且這種改變是通過隨著年齡的增長而變化，從而使整個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生退行性變化。49第四十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1972年Harman又提出線粒體衰老概念20世紀(jì)80年代Miquel和Fleming提出了“衰老的氧自由基－線粒體損傷”的二階段學(xué)說1990年Bandy等闡明線粒體DNA突變可增加線粒體內(nèi)氧應(yīng)激水平由此引發(fā)衰老的出現(xiàn)1992年Wallace等提出氧化磷酸水平下降與衰老和退行性病變，如阿爾茨海默氏病(AD,亦稱早老性癡呆)與帕金森病等有關(guān)。返回章目錄50第五十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第五節(jié)氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測方法及評價(jià)一、主要活性氧的檢測二、一氧化氮與一氧化氮合酶的測定三、抗氧化酶活性的檢測四、常用抗氧化劑的測定五、氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物檢測51第五十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(二)·OH檢測(三)H2O2的檢測(一)O2的檢測·一、主要活性氧的檢測52第五十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日NBT還原法高鐵細(xì)胞色素C還原法羥胺氧化法較為常用1.物理檢測方法(一)O2的檢測·電子自旋共振(ESR)波譜分析法——直接法電子順磁共振(EPR)波譜分析法——間接法優(yōu)點(diǎn)：操作均較簡單缺點(diǎn)：需昂貴的儀器，應(yīng)用均受到限制2.化學(xué)檢測方法——間接法53第五十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日一種較靈敏檢測O2的方法，其檢測限量可達(dá)1μg/L?！ぞ哂性O(shè)備簡單，試劑便宜易購，操作簡便，專一性好，結(jié)果較為準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適合于一般實(shí)驗(yàn)室的檢測。羥胺氧化法

O2能與羥胺溶液反應(yīng)生成NO2－，NO2－與對氨基苯磺酸和α-萘胺顯色，在波長530nm處有專一吸收峰，其顏色深淺與產(chǎn)生的O2呈量效關(guān)系?！ぁぁ痉椒▽W(xué)評價(jià)】【注意事項(xiàng)】嚴(yán)格控制反應(yīng)系統(tǒng)pH＜8.0，盡可能降低反應(yīng)中的溶解氧及鐵含量，這樣測出的O2產(chǎn)生速率才更接近實(shí)際水平?！?4第五十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(二)·OH檢測

原理是無熒光的對苯二甲酸與·OH反應(yīng)形成強(qiáng)熒光的羥-對苯二甲酸加成物，315nm激發(fā)，可發(fā)射425nm熒光，可檢測受物理因素及化學(xué)因素處理后水溶液中產(chǎn)生的·OH。自旋捕捉法氣相色譜法(GC)高效液相色譜(HPLC)優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確度較高

缺點(diǎn)：操作繁瑣，儀器昂貴，不便推廣優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，測定快速，靈敏度較高，穩(wěn)定性較好。缺點(diǎn)：特異性不太高，需化學(xué)發(fā)光儀分光光度法熒光分析法——方法簡便，易為一般實(shí)驗(yàn)室采用

化學(xué)發(fā)光法55第五十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日

【原理】利用H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH，使鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失，根據(jù)反應(yīng)前后A536下降值進(jìn)行計(jì)算。分光光度法溴鄰苯三酚紅光度法【原理】利用H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH與溴鄰苯三酚紅形成有560nm處吸收峰的有色化合物，根據(jù)反應(yīng)前后A560的升高值進(jìn)行計(jì)算。鄰二氮菲-Fe2+氧化法細(xì)胞色素C氧化法水楊酸比色法這兩種方法穩(wěn)定性好、操作簡便、測定快速。56第五十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(三)H2O2的檢測碘滴定法分光光度法化學(xué)發(fā)光法熒光法通過測定CAT和過氧化物酶的活性也可估測H2O2的水平H2O2是最穩(wěn)定的活性氧檢測方法:57第五十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.分光光度法過氧化物酶-氧化酶法Fe2+-鄰二氮菲分光光法碘化鉀比色法58第五十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日碘化鉀比色法快速、簡便、重復(fù)性好，適合于溶液中μmol/L水平的日常測定?！驹怼縃2O2+KII2鉬酸銨藍(lán)色化合物淀粉【方法學(xué)評價(jià)】59第五十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日過氧化物酶-氧化酶法經(jīng)典的比色法，整個(gè)反應(yīng)過程約20min，是一種操作簡便、靈敏度較高(可達(dá)10-9μmol/L水平)的方法?！驹怼吭谌跛嵝原h(huán)境下，過氧化物酶-氧化酶反應(yīng)中的NADH往往被完全消耗。而在較高pH值環(huán)境下，NADH至少在反應(yīng)的開始階段并不完全被消耗，測定A340下降值,計(jì)算NADH被消耗量?！痉椒▽W(xué)評價(jià)】60第六十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.NADPH氧化法

兩方法靈敏度均較高。

前者無需制作H2O2的校正曲線，操作簡便，適用于大批量樣品的同時(shí)測定。

后者適用于生物反應(yīng)體系中微量H2O2測定?！驹怼繙y定體系中NADPH的氧化與H2O2的含量成正比GSH-NADPH氧化法Scopoletin-NADPH氧化法【方法學(xué)評價(jià)】61第六十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日二、一氧化氮與一氧化氮合酶的測定(一)一氧化氮(NO)測定NO含量少，且極不穩(wěn)定,較難直接測定其含量。常用測定NO含量的方法多利用NO的化學(xué)性質(zhì)，測定其終末產(chǎn)物NO3－和(或)NO2－的含量來反映組織細(xì)胞NO的含量。物理方法有微電極法和EPR法，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可實(shí)時(shí)檢測，但需昂貴儀器限制了應(yīng)用?；瘜W(xué)方法有Griess試劑法、硝酸鹽還原酶法、熒光分光光度法、催化光度法、化學(xué)發(fā)光法，其中以Griess試劑法最為常用。62第六十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.Griess試劑法：A550與NO2－或NO的產(chǎn)量成正比，據(jù)此測定NO2－+對氨基苯磺酸重氮化合物pH7.5～8.1重氮化合物+N-(1-萘基)-乙二胺紫紅色產(chǎn)物偶聯(lián)550nm本法稍加修改即可用于測定樣品中的總硝酸鹽含量(NO3－與NO2－濃度之和)。(一)一氧化氮(NO)測定63第六十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日加合物+N-(1-萘基)-乙二胺Griess反應(yīng)NO3－NO2－銅離子活化鎘NO2－+對氨基苯磺酸加合產(chǎn)物H+測A550nm，即可求出[NO2－]測NO3－時(shí)可將其先還原成NO2－，再測。因血清中[NO3－]>>[NO2－]，[NO2－]很低，因而測定結(jié)果主要反映血清中NO3－的含量。64第六十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日無需特殊的設(shè)備和昂貴試劑，操作簡便迅速，在一般實(shí)驗(yàn)室、均可開展，是目前使用最普遍的方法，適用于大批量樣品測定。本法測的是NO2－含量,屬于間接測定NO量，其特異性較差。NO的還原可采用銅離子活化鎘還原法或硝酸鹽還原酶法?！痉椒▽W(xué)評價(jià)】

65第六十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日測定光子量，可代表組織細(xì)胞NO的含量?？捎肗O氣體制作校正曲線，直接測定樣品中的NO。2.化學(xué)發(fā)光法通過酸化或/和加入還原劑，使樣品中的亞硝酸鹽釋放NONO+O3激發(fā)態(tài)NO2*發(fā)光返回基態(tài)

樣品用量較少，靈敏度較高，測定范圍50～250pmolNaNO2易受樣品中其他因素的干擾，測定的NO含量并不完全代表組織細(xì)胞實(shí)際的NO量?！痉椒▽W(xué)評價(jià)】

66第六十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日一般的Griess法僅測定NO2－或NO3－的含量，且Pr的NO衍生物均被脫蛋白的步驟除去。本法基于所有NO相關(guān)復(fù)合物均可被熱裂解為硝酸鹽。血漿Pr可通過熱變性而除去，避免其干擾。3.全血NO代謝產(chǎn)物的測定血液中NO代謝產(chǎn)物除NO3－/NO2－外，還包括S-亞硝基血紅蛋白，亞硝酰血紅蛋白等S-亞硝基/亞硝酰化合物，其總稱為NO代謝產(chǎn)物。67第六十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長426nm條件下測熒光強(qiáng)度NO2－+

2，3-二氨基萘1-(H)-萘三唑H+測定血中NO代謝產(chǎn)物總量，待測樣品可為溶血或全血標(biāo)本，測定結(jié)果可較全面反映NO代謝情況。其他方法因易受Hb或其他Pr影響，不宜用全血標(biāo)本測定?！痉椒▽W(xué)評價(jià)】68第六十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(二)NOS測定1.化學(xué)發(fā)光法2.血紅蛋白法3.NADP+檢測法69第六十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.化學(xué)發(fā)光法加入去鐵乙胺可消除Hb對測定的干擾NO+L-瓜氨酸NOSO2·L-精氨酸+NO+

H2O2ONOO－化學(xué)發(fā)光

OH－魯米諾加入SOD可消除O2對測定結(jié)果的影響·70第七十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.血紅蛋白法HbO2和MHb光譜特性有pH依賴性，pH7.7時(shí)：HbO2于401nm有最大光吸收MHb與HbO2混合液在411nm有等位光吸收峰測定A401和A411的變化可監(jiān)測NO產(chǎn)量的變化，反映NOS活性NO+HbO2MHbNO+L-瓜氨酸NOSL-精氨酸+O2·71第七十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.NADP+檢測法測定NADP+在370nm激發(fā)波長下產(chǎn)生465nm發(fā)射波長的熒光強(qiáng)度，可反映樣品中NOS活性。NADP+的量可依靠酶催化循環(huán)擴(kuò)增，可明顯提高對NADP+檢測靈敏度。SQ·+O2+NADPH+H+Q+O2+NADP+·優(yōu)勢是可用于檢測含有內(nèi)源性Arg的粗制品缺點(diǎn)是NADP+的生成缺乏特異性【方法學(xué)評價(jià)】NO+L-瓜氨酸NOSL-精氨酸+O2·72第七十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日三、抗氧化酶活性的檢測(一)超氧化物歧化酶(SOD)測定(二)谷胱甘肽過氧化物酶測定(三)過氧化氫酶(CAT)測定73第七十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日直接法一般化學(xué)法化學(xué)發(fā)光法

(一)SOD測定測酶活性免疫學(xué)方法測酶質(zhì)量電泳法74第七十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日特異性強(qiáng)，所需樣本量少(僅50μl)，操作快速簡單，重復(fù)性好，靈敏度高，試劑簡單。1.一般化學(xué)法:鄰苯三酚自氧化法(改良Marklund法)在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化成紅桔酚，用紫外-可見光譜跟蹤波長為325nm、420nm或650nm(經(jīng)典為420nm)同時(shí)產(chǎn)生O2，SOD催化O2發(fā)生歧化反應(yīng)從而抑制鄰苯三酚的自氧化，樣品對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映樣品中的SOD含量?！ぁぁ痉椒▽W(xué)評價(jià)】75第七十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日屬間接法中的經(jīng)典方法，但本法靈敏度較低。1.一般化學(xué)法:細(xì)胞色素C還原法(McCord法)

【方法學(xué)評價(jià)】黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中產(chǎn)生的O2使細(xì)胞色素C氧化型還原為還原型，后者在550nm有最大光吸收。·將抑制反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)與SOD濃度作圖可得到抑制曲線，由此計(jì)算樣品中SOD活性。在SOD存在時(shí)，一部分O2被SOD催化而歧化，O2還原細(xì)胞色素C的反應(yīng)速度則相應(yīng)減少?！ぁ?6第七十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.化學(xué)發(fā)光法可應(yīng)用于SOD的微量測定靈敏度高，簡便易行特異性準(zhǔn)確性與細(xì)胞色素C還原法類似黃嘌呤或次黃嘌呤尿酸+O2黃嘌呤氧化酶[O]·O2+魯米諾化學(xué)發(fā)光·SOD能清除O2從而抑制魯米諾的化學(xué)發(fā)光·【方法學(xué)評價(jià)】77第七十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日4.免疫學(xué)方法測定SOD質(zhì)量，特異性較好，是較理想的方法。只能測定Ab相應(yīng)的Ag，對于檢測不同種類的SOD，則須制備相應(yīng)的特異性Ab，手續(xù)繁瑣。放射免疫法化學(xué)發(fā)光免疫分析法ELISA法【方法學(xué)評價(jià)】78第七十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(二)谷胱甘肽過氧化物酶測定兩者的區(qū)別在于其活性結(jié)構(gòu)中是否含硒non-SeGSHPx只能催化除H2O2外的過氧化物還原SeGSHPx則可催化H2O2及其他過氧化物還原谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)有兩種硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx)非硒谷胱甘肽過氧化物酶(non-SeGSHPx)79第七十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.DTNB直接顯色法2.酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測法3.熒光測定法SeGSHPx的測定80第八十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.DTNB直接顯色法

測定該離子的濃度即可計(jì)算出GSH減少量，以此求得SeGSHPx活性。LOOH(H2O2)＋2GSHLOH(H2O)+H2O＋GSSGSeGSHPx

GSH＋5，5'-二硫代雙，2-硝基苯甲酸黃色(DTNB)[5-硫代，2-硝基苯甲酸]－殘留的81第八十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測法LOOH(H2O2)＋2GSHLOH(H2O)＋H2O＋GSSGSeGSHPxGSSG+NADPH+H+2GSH+NADP+GSH還原酶特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用酶含量不高的樣品GSH還原酶的成本高是本法缺點(diǎn)

【方法學(xué)評價(jià)】340nm

82第八十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日源自GSH的熒光分析法2GSH+H2O2GSSG+2H2OGSH+OPA熒光復(fù)合物3.熒光測定法隨著反應(yīng)的進(jìn)行，GSH不斷被消耗，經(jīng)一定時(shí)間的酶反應(yīng)后，中止反應(yīng)。剩余的GSH與鄰苯二甲醛(OPA)在一定pH條件下生成較特異性的熒光復(fù)合物。通過測定其熒光強(qiáng)度即可測定SeGSHPx活性。83第八十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(三)過氧化氫酶(CAT)測定1.鉬酸銨比色法2.快速簡便法3.改良比色法4.化學(xué)發(fā)光法84第八十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.鉬酸銨比色法反應(yīng)迅速達(dá)到平衡，至少穩(wěn)定60min，生成的黃色化合物的A405取決于H2O2和鉬酸銨的濃度。CAT2H2O2H2O+O2+鉬酸銨黃色化合物405nm殘留的H2O2測定波長為360nm，測定溫度為25℃。2.快速簡便法85第八十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.改良比色法在波長570～610nm進(jìn)行比色測定鉻酸醋酸鉀的生成量，可反映H2O2的含量。CAT簡便、快速、顯色穩(wěn)定、重復(fù)性好，不需特殊試劑及儀器設(shè)備，適用于一般實(shí)驗(yàn)室使用。2H2O2H2O+O2(加醋酸重鉻酸鉀迅速中止)570～610nm剩余的H2O2+醋酸重鉻酸鉀鉻酸醋酸鉀△【方法學(xué)評價(jià)】86第八十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日4.化學(xué)發(fā)光法

CAT可引起化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度減弱，由此計(jì)算總CAT活性。

CAT2H2O2H2O+O2H2O2+魯米諾+Co2+發(fā)出強(qiáng)烈藍(lán)光87第八十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日四、常用抗氧化劑的測定(三)維生素C測定(一)還原型谷胱甘肽(GSH)測定1．改良比色法2．熒光測定法3．HPLC法(二)維生素E測定1．熒光法2．HPLC-分光光度法3．HPLC-熒光分析法1．DNPH比色法2．熒光分析法3．氧化酶法4．HPLC法88第八十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日測A412，即可測定巰基1.改良比色法本法適用于血紅細(xì)胞GSH含量的測定，采血量及試劑用量較少，更適用于兒童。DTNB+2GSH[2-硝基-5-巰基苯甲酸]－+GSSG黃色【方法學(xué)評價(jià)】DTNB：5，5'-二硫代雙，2-硝基苯甲酸(一)還原型谷胱甘肽(GSH)測定89第八十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.熒光測定法靈敏度大大高于分光光度法本法適用于測定血小板中GSH鄰苯二醛(OPT)+GSHGSH-OPT【方法學(xué)評價(jià)】在激發(fā)波長345nm及發(fā)射波長425nm條件下測熒光，對GSH定量90第九十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.HPLC法本法樣品用量少，測定結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高GSH最低檢出限為3ng。

缺點(diǎn)：需HPLC儀，在一般實(shí)驗(yàn)室較難完成。鄰苯二醛(OPT)+GSHGSH-OPT【方法學(xué)評價(jià)】HPLC可有效地用于分離樣品液中的GSH根據(jù)OPT熒光法檢測GSH的原理，通過分離的GSH峰測定樣品GSH。熒光檢測激發(fā)波長338nm，發(fā)射波長425nm。91第九十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日(二)維生素E測定維生素E是一族維生素的總稱，目前已知有7種常見的有α、β、γ和δ4種本法靈敏度較高，是測定維生素E的經(jīng)典方法?！痉椒▽W(xué)評價(jià)】維生素E同系物的分子結(jié)構(gòu)中存在相同的共軛雙鍵體系，檢測在激發(fā)波長296nm，發(fā)射波長340nm條件下的熒光，可對維生素E定量。1.熒光法92第九十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日α-生育酚于292nm有特異性光吸收胡蘿卜素于450nm有較大光吸收2.HPLC-分光光度法生物樣品中α-生育酚及胡蘿卜素可經(jīng)過HPLC法較好地分離開來，通過檢測不同波長下的光吸收值可測定樣品中的它們的含量。93第九十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日HPLC分離樣品中維生素E維生素E在激發(fā)波長296nm下可發(fā)射340nm的熒光根據(jù)測試對樣品純度要求選擇不同的樣品處理方法3.HPLC-熒光分析法HPLC法大大提高了分析的準(zhǔn)確度，且能同時(shí)分離和測定各種維生素E同系物。

缺點(diǎn)是儀器設(shè)備較昂貴，分析成本高,不適應(yīng)于常規(guī)檢測的要求。

【方法學(xué)評價(jià)】94第九十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法抗壞血酸脫氫抗壞血酸脫氫抗壞血酸+DNPH2，4-二硝基苯腙硫脲及硫酸銅H+520nm本法測的是樣品中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸總量如省去氧化步驟，樣品穩(wěn)定，則可測脫氫抗壞血酸含量是分光光度法較為理想的方法之一特異性不高，其他碳?xì)浠衔锟筛蓴_，加入硫脲可增加DNPH反應(yīng)的特異性。【方法學(xué)評價(jià)】(三)維生素C的測定95第九十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.熒光分析法抗壞血酸脫氫抗壞血酸脫氫抗壞血酸+鄰苯二胺脫氫抗壞血酸對-氮雜萘測定在激發(fā)波長350nm，發(fā)射波長430nm的熒光本法測定的是抗壞血酸與脫氫抗壞血酸的總量96第九十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.氧化酶法抗壞血酸脫氫抗壞血酸抗壞血酸氧化酶脫氫抗壞血酸+Fe3++2，4，6-三(2-吡啶基)-S-三嗪生色物593nm優(yōu)點(diǎn)是不必對生物樣品進(jìn)行過多的純化處理，甚至不用脫蛋白樣品中的脫氫抗壞血酸須用其他方法測定【方法學(xué)評價(jià)】97第九十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日4.HPLC法最好的方法，先層析法將樣品中的成分分離，再用柱后檢測器檢測。HPLC-紫外分光光度法(2)HPLC-電化學(xué)檢測法是此類方法中最為簡單的一種

最為理想的測定生物樣品中抗壞血酸含量的方法返回章目錄98第九十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日（一）脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物檢測（丙二醛、脂氫過氧化物）（二）蛋白質(zhì)氧化損傷指標(biāo)檢測（三）DNA/RNA損傷檢測五、氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物檢測