寬闊水自然保護區(qū)3種類型土壤的真菌多樣性

寬闊水自然保護區(qū)3種類型土壤的真菌多樣性摘要：利用稀釋平板法和基于ITSrDNA基因序列的分析方法對寬闊水自然保護區(qū)3種類型的土壤進行真菌的分離鑒定，共分離得到353株真菌，歸為34個不同的屬。對土壤真菌多樣性進行評估，結(jié)果表明：紫色土真菌優(yōu)勢屬為酵母菌屬(Saccharomyces)，黃棕壤真菌優(yōu)勢屬為酵母菌屬(Saccharomyces)和被抱霉屬(Mortierella)，黃壤真菌優(yōu)勢屬為青霉屬(Penicillium)和木霉屬(Trichoderma)。土壤真菌Margalef豐富度指數(shù)(R)最高的是黃壤，最低的是黃棕壤；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(*)最高的是紫色土；Pielou均勻度指數(shù)(J)黃棕壤最高；Jaccard相似性指數(shù)(Cj)為0444?0.536,表明3種類型土壤的真菌多樣性均具有一定差異。關(guān)鍵詞：寬闊水；土壤真菌；多樣性中圖分類號：S154.3文獻標志碼：A文章編號：1002-1302(2016)05-0458-03收稿日期：2015-11-22基金項目：國家科技基礎(chǔ)性工作專項(編號：2014FY120100)。作者簡介：黃依藍(1992—),女，碩士研究生，主要從事土壤真菌資源研究。E-mail：ylhuang77@163.com。通信作者：周禮紅，博士，副教授，主要從事微生物應(yīng)用方向的研究。E-mail：lhzhou33@126.com。寬闊水自然保護區(qū)位于貴州省遵義市綏陽縣境內(nèi)，總面積26231km2,海拔在650~1762m之間，地形切割強烈，除中南部以中低山谷地為主的侵蝕地貌外，保護區(qū)東、西部及北部多為典型的喀斯特地貌。寬闊水保護區(qū)的森林植被主體為亮葉水青岡林與常綠闊葉樹種構(gòu)成落葉常綠闊葉混交林，林下土壤發(fā)育良好，具有較豐富的腐殖質(zhì)積累［1］。由于特殊的氣候及地質(zhì)土壤條件，寬闊水自然保護區(qū)為森林野生動植物及微生物的生長繁育提供了有利的棲息場所，形成了復(fù)雜多樣的生境類型。與動植物的分布類似，微生物的分布是確定性（環(huán)境）和隨機性（擴散）的共同結(jié)果。由于微生物個體較小，可以通過抱子抵御長距離傳播中的不良環(huán)境，在適宜條件下以多種繁殖方式存活下來，這種巨大的分散潛力和對小環(huán)境的敏感性，是微生物群落結(jié)構(gòu)與大型生物群落結(jié)構(gòu)之間的區(qū)別。土壤真菌作為微生物群落結(jié)構(gòu)中的一個重要組成部分，其多樣性程度與土壤肥力和生態(tài)狀況密切相關(guān)，同時生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)及環(huán)境變化，也直接影響到真菌物種多樣性和空間分布情況［2-4］。本研究采用傳統(tǒng)分離方法對寬闊水自然保護區(qū)3種不同土壤的真菌多樣性進行調(diào)查，結(jié)合微生物多樣性的分析方法，對該地區(qū)真菌菌群的基本特征、空間分布狀況和物種多樣性進行調(diào)查，為進一步揭示微生物和環(huán)境之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。1材料與方法材料和試劑土樣采自寬闊水自然保護區(qū)。馬丁氏培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基均按標準方法配制，所用試劑為國產(chǎn)分析純。真菌基因組DNA提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。試驗方法土樣采集選取寬闊水自然保護區(qū)內(nèi)的紅沙地、花生地、太陽山、煤場灣、天鵝湖、琪桐溝和一線天7個區(qū)域，GPS記錄采集地的地理位置，采集地環(huán)境描述（表1）。采用對角線型路線多點采集腐殖質(zhì)層土壤樣品于滅菌袋中，進行編號，4℃保存。土壤真菌的分離及純化分離培養(yǎng)基為馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基、改良沙氏孟加拉紅培養(yǎng)基和馬鈴薯孟加拉紅培養(yǎng)基，均在使用前加入鏈霉素，使培養(yǎng)基中含鏈霉素30Mg/mL。用稀釋涂布法分離土壤真菌。稱取10g土壤于90mL含少量玻璃珠的無菌水中，充分振蕩混勻，按10倍稀釋法稀釋到1X10-3,取400ML菌懸液于培養(yǎng)基上，均勻涂布，28℃培養(yǎng)5d,進行菌落計數(shù)。1.2.3ITS序列分子鑒定真菌基因組DNA的提取基因組DNA提取按照試劑盒操作說明書進行。ITS序列的PCR擴增（1）引物序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC（2）PCR反應(yīng)體系：擴增反應(yīng)體系為25ML（表2）。配制完成后，充分混勻，稍加離心使體系在PCR管底部，再置于PCR儀上進行擴增。（3）PCR擴增條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃引物退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物的檢測反應(yīng)結(jié)束后，分別取3MLPCR產(chǎn)物和DNAmarker點于1%瓊脂糖凝膠的點樣孔中進行電泳，結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，若條帶單一且明亮清晰則表明擴增成功，樣品可用于進一步測序。1.2,4序列測定與分析方法測序PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用全自動DNA測序儀進行測序，獲得ITS序列。序列及真菌種群分布分析將已測定的序列在表1土壤采集地環(huán)境描述采集地緯度（N）經(jīng)度（E）海拔（m）土壤類型土壤pH值生境類型紅沙地28°13,10〃107°9,17〃1486?1510紫色土5.5灌木叢花生地28°13,26〃107°9,43〃1503?1517黃棕壤6.0竹林地太陽山28°14，9〃107°937〃1592?1722黃棕壤6.0方竹煤場灣28°13，56〃1079,42〃1555?1579黃壤6.5灌木叢天鵝湖28°13,45〃107°9,43〃1515?1524黃壤7.0灌木叢琪桐溝28°13,59〃107°10，1〃1582?1629黃壤6.5灌木叢一線天28°14，11〃107°11，12〃1411?1455黃壤6.5灌木叢表2PCR反應(yīng)體系組分反應(yīng)組分體積(〃L)引物ITS11引物ITS41模板22XPCRMasterMix12ddH2O9GenBank上使用Blast(basiclocalalignmentsearchtool,Blast2.2.31)進行序列比對分析、鑒定。1.2.5真菌多樣性分析方法采用物種個體數(shù)量(N)、物種數(shù)(S)、種群優(yōu)勢度(d)、Margalef豐富度指數(shù)(R)、Shannon-Wiener的多樣性指數(shù)(H，)、Pielou均勻度指數(shù)(J)和Jaccard相似性指數(shù)(Cj)對寬闊水保護區(qū)不同土壤真菌群落多樣性進行分析［5-7］。種群優(yōu)勢度：di=Ni/N；Margalef豐富度指數(shù)：R=(S-1)/lnN。Shannon-Wiener多樣性指數(shù)：H，=-EPilnPi(i=1,2,3,…，n)；Pielou均勻度指數(shù)：J=H，/lnS。式中，Pi=di,表示第i種個體數(shù)占總個體數(shù)的比例。Jaccard相似性指數(shù)：Cj=c/(a+b+c)。式中，a和b分別為2種生境地中真菌的種數(shù)或?qū)贁?shù)，c為2種生境地中共有的真菌種數(shù)或?qū)贁?shù)。Jaccard相似性系數(shù)(Cj)用于比較2個生境中真菌種類組成的相似程度，根據(jù)其原理：當(dāng)Cj為0.00?紫色土＞黃棕壤，物種數(shù)(屬數(shù))N為紫色土＞黃壤＞黃棕壤，Margalef豐富度指數(shù)R黃壤＞紫色土＞黃棕壤，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H,紫色土＞黃壤＞黃棕壤，Pielou均勻度指數(shù)J黃棕壤＞黃壤＞紫色土。紫色土和黃棕壤的Jaccard相似性指數(shù)Cj為0.536,中等相似；紫色土和黃壤Cj為0.500,中等相似，黃棕壤和黃壤Cj為0.444,中等不相似。3討論本研究采用種群優(yōu)勢度、豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)、均勻度和相似度指數(shù)，對寬闊水自然保護區(qū)3種不同土壤的真菌群落多樣性進行了分析。結(jié)果表明，從群落組成來看，各類土壤的優(yōu)勢種屬、常見種屬和稀有種屬均有較大差異，其中有一些屬為其相應(yīng)土壤所特有。寬闊水自然保護區(qū)土壤中大量存土壤類型S(N)RH‘J紫色土26(127)5.16082.77560.8519黃棕壤17(90)3.55572.46820.8712黃壤22(136)4.27472.67610.8658在的酵母菌屬(Saccharomyces)、木霉屬(Trichoderma)、被抱霉屬(Mortierella)、擬青霉屬(Paecilomyces)、綠僵菌屬(Metarhizium)、黏帚霉屬(Gliocladium)等，具有較高的利用價值和應(yīng)用前景，可作為農(nóng)林病害防治和可持續(xù)開發(fā)的資源［11-15］。此外，不同土壤真菌群落多樣性存在一定差異，Margalef豐富度指數(shù)最高的是黃壤真菌，最低的是黃棕壤；3種土壤真菌群落的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在2.46?278之間，紫色土最高，黃棕壤最低；黃棕壤的Pielou均勻度指數(shù)最高，紫色土最低；Jaccard相似性指數(shù)為0.444?0536,表明3種土壤相似性介于中等相似和中等不相似之間。造成不同土壤真菌群落多樣性的差異原因比較復(fù)雜，除了土壤質(zhì)地和土壤肥力外，還與其對應(yīng)生境地的光照、降雨量、植被類型等有關(guān)［16-17］。同時由于其中一些種屬的菌株具有生防功能，且不同微生物群落之間產(chǎn)生的相互作用使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此在一定程度上也影響了環(huán)境中的真菌多樣性［18］。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，大量不可培養(yǎng)微生物無法通過分離獲得，菌株數(shù)量十分有限。因此還需嘗試多種不同的分離方法，結(jié)合以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)進行多樣性分析，才能更加全面地了解寬闊水保護區(qū)的土壤真菌多樣性分布特征以及與環(huán)境之間的相互關(guān)系。參考文獻：［1］喻理飛，謝雙喜，吳太倫.寬闊水自然保護區(qū)綜合科學(xué)考察集［M］.貴陽：貴州科技出版社，2004.［2］JessicaLG,BrendanJMB,RachelJW.Microbialbiogeography：fromtaxonomytoTraits［J］.Science,2008,320：1039-1041.[3]PagalingE,WangHZ,VenablesM,etal.MicrobialbiogeographyofsixsaltlakesinInnerMongolia,China,andasaltlakeinArgentina[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2009,75（18）：5750-5760.[4]FinlayBJ.Globaldispersaloffree-livingmicrobialeukaryotespecies[J].Science,2002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