研究生分子醫(yī)學(xué)技能實(shí)驗(yàn)四

實(shí)驗(yàn)七：乙肝病毒PCR及電泳檢測第1頁/共22頁第一頁，共23頁。實(shí)驗(yàn)分組，認(rèn)清試劑（每組做一陽性管，其它人做患者血清）

患者血清40l+40lDNA提取液，混勻

沸水浴10min，10000rpm×5min（離心機(jī)的使用）

取上清2l（或陽性血清2l）加入一PCR反應(yīng)管6000rpm×5s，混勻一、實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)第2頁/共22頁第二頁，共23頁。93℃×3min預(yù)變性(HemaPCR儀的使用與程序設(shè)計(jì))

93℃×45s，55℃×35s，72℃×60s

重復(fù)25個(gè)循環(huán)

72℃保溫5min，-20℃保存?zhèn)溆铆傊悄z板的制備（封板、梳子位置與高度、1%倒膠3mm、凝固后拔梳）第3頁/共22頁第三頁，共23頁。倒緩沖液，加樣電泳（方向、電壓、時(shí)間）

染色與檢測（EB10min，紫外檢測）第4頁/共22頁第四頁，共23頁。此步注意事項(xiàng)：1.每次加樣要換Tip頭，以防試劑的互相污染，尤其不要污染DNA聚合酶。

2.按順序加樣。

3.加樣一定要準(zhǔn)確，正確使用微量移液器是關(guān)鍵。

4.加完試劑后將PCR反應(yīng)管彈勻，離心將液體匯集管底。

5.對(duì)沒有熱敏蓋的PCR儀要加封石蠟油。第5頁/共22頁第五頁，共23頁。二、PCR基本原理及相關(guān)知識(shí)概念聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù),能在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)百萬個(gè)特異DNA序列的拷貝。第6頁/共22頁第六頁，共23頁。KaryMullisPCR技術(shù)最早由美國Cetus公司人類遺傳研究室KaryMullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的。KaryMullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

第7頁/共22頁第七頁，共23頁。

相對(duì)DNA克隆而言，這種方法的特點(diǎn)：操作簡便、時(shí)間短、特異性高、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)；廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、分子生物學(xué)、分子克隆、基因診斷、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。第8頁/共22頁第八頁，共23頁。PCR擴(kuò)增DNA片段的原理

PCR是在模板DNA、引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)，整個(gè)擴(kuò)增過程分三步：變性：加熱，模板DNA形成兩條單鏈退火：降溫，模板單鏈DNA與引物配對(duì)結(jié)合延伸：在DNA聚合酶及鎂離子等存在的條件下，引物3'-端向前延伸，合成與模板配對(duì)的新鏈第9頁/共22頁第九頁，共23頁。

上述三步為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過一個(gè)循環(huán)DNA量增加一倍。新合成的鏈又可以成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25-30個(gè)循環(huán)后目的DNA就可以擴(kuò)增106~109倍。通過循環(huán)可以提高PCR的特異性。第10頁/共22頁第十頁，共23頁。第11頁/共22頁第十一頁，共23頁。PCR反應(yīng)體系的組成及功能

PCR的完成是在一個(gè)0.5ml的EP管中完成，一個(gè)完整的PCR反應(yīng)體系應(yīng)包括以下成分：引物：是預(yù)擴(kuò)增DNA片段兩端的已知序列，是保證PCR特異性的關(guān)鍵因素，合理正確的引物設(shè)計(jì)可以提高擴(kuò)增的效率與特異性。終濃度為0.1~0.5umol/L；濃度過高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來說用低濃度引物經(jīng)濟(jì)、特異，但濃度過低，不足以完成30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，則會(huì)降低PCR的產(chǎn)率。第12頁/共22頁第十二頁，共23頁。

TaqDNA聚合酶有良好的熱穩(wěn)定性，具有5‘-3’聚合酶活性，但無3’→5’外切核酸酶校正活性，無法校正DNA合成過程中產(chǎn)生的錯(cuò)配。其活性對(duì)Mg2+濃度非常敏感終濃度一般為：2.5u/100ul第13頁/共22頁第十三頁，共23頁。

模板DNA

相對(duì)于分子克隆、酶切、連接、標(biāo)記等，PCR對(duì)DNA模板純度的要求并不嚴(yán)格。單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA。用質(zhì)粒作模板時(shí)，線性化的比環(huán)狀的效果好，但在實(shí)際操作中，往往不需要將質(zhì)粒線性化，而直接用做模板。當(dāng)使用高分子量的DNA（如基因組DNA）做模板時(shí)，如果用適當(dāng)?shù)拿赶冗M(jìn)行消化再作為模板，擴(kuò)增效果會(huì)更好。模板用量也是很低的，一般認(rèn)為102~104拷貝模板就可以滿足要求。

第14頁/共22頁第十四頁，共23頁。dNTP：已有商品化的混合液，終濃度一般為20~200umol/L。在PCR反體系中,dNTP終濃度高于50mM會(huì)抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動(dòng)和延伸時(shí)核苷酸錯(cuò)誤摻入，高濃度dNTPs易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。四種dNTP的濃度應(yīng)相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會(huì)誘導(dǎo)聚合酶的錯(cuò)誤摻入，降低合成速度，過早終止反應(yīng)。第15頁/共22頁第十五頁，共23頁。10×PCR反應(yīng)buffer：已作成商品化的產(chǎn)品，它包括：

250~500mmol/LKCl；

100~500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；15~20mmol/LMgCl2（對(duì)Taq酶的活性影響很大，一般濃度為1.5~2.0mmol/L，實(shí)際應(yīng)用時(shí)根據(jù)反應(yīng)體系的情況進(jìn)行調(diào)整。）；

0.1%明膠或牛血清白蛋白第16頁/共22頁第十六頁，共23頁。ddH2O調(diào)節(jié)反應(yīng)體積液體石蠟油第17頁/共22頁第十七頁，共23頁。

影響PCR的主要因素①

PCR反應(yīng)體系的各個(gè)組分②

PCR循環(huán)的溫度（預(yù)變性、變性、退火、延伸）③

PCR循環(huán)的次數(shù)和平臺(tái)效應(yīng)④

操作環(huán)境

第18頁/共22頁第十八頁，共23頁。平臺(tái)效應(yīng)及其原因第19頁/共22頁第十九頁，共23頁。三、結(jié)果分析與問題討論第20頁/共22頁第二十頁，共23頁。謝謝！第21頁/共22頁第二十一頁，共23頁。謝謝您的觀看！第22頁/共22頁第二十二頁，共23頁。內(nèi)容總結(jié)實(shí)驗(yàn)七：乙肝病