糞菌移植對炎癥性腸病大鼠血清tnfα、il8的影響課件

研究生：蔡景融導(dǎo)師：武華教授2015年4月糞菌移植對炎癥性腸病大鼠血清TNF-α、IL8的影響專業(yè)：普通外科研究方案研究基礎(chǔ)研究計劃及預(yù)算國內(nèi)外研究進(jìn)展選題依據(jù)

Content糞菌移植對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清TNF-α、IL8的影響選題依據(jù)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因和患病機(jī)制還未完全闡明，可能與微生態(tài)環(huán)境、黏膜的免疫應(yīng)答、應(yīng)激、遺傳等因素有關(guān)的慢性腸道炎癥性疾病，病變主要局限于結(jié)直腸粘膜及粘膜下層，可累及整個結(jié)腸甚至末端回腸。目前研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，UC患者腸道中微生物的多樣性減少約1/4，擬桿菌門與厚壁菌門在總菌群中所占比例明顯減少，而放線菌門與變形菌門的比例明顯增加。腸道菌群是機(jī)體一個特殊器官，其調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、調(diào)控炎癥、參與物質(zhì)代謝等方面發(fā)揮重要作用。

腸道菌群的生理作用1.防御病原體的侵犯2.物質(zhì)代謝作用3.生長與衰老4.合成維生素5.腸道的生物、免疫屏障作用選題依據(jù)

傳統(tǒng)的升階治療方案，序貫地應(yīng)用5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑，無疑最為安全易行、經(jīng)濟(jì)實用；然而無限期地等待療效，可能錯失治療良機(jī)，延誤緩解時間，使約50％患者仍處于活動狀態(tài)，導(dǎo)致失用或致殘的并發(fā)癥，其療效費(fèi)用比反而降低。隨著新藥問世后治療經(jīng)驗的積累，專家們提出早期、強(qiáng)力治療，即降階治療方案。這種看似昂貴、危險，實則經(jīng)濟(jì)、高效的治療方法已使相當(dāng)多的IBD患者獲益，但降階治療藥物昂貴，又有一定風(fēng)險，如嚴(yán)重感染、藥物反應(yīng)等，對非選擇性病例也存在過度治療之嫌，而且停藥或減藥后病情仍會發(fā)復(fù)發(fā)作，并表現(xiàn)出一定的激素依賴性。對常規(guī)治療失敗或有手術(shù)禁忌證的UC病人，F(xiàn)MT或許是不錯的選擇。目前FMT應(yīng)用最為廣泛的是治療復(fù)發(fā)性難治性難辨梭狀芽胞桿菌感染(CDI)腸炎，其短期緩解率可達(dá)90％以上。FMT也在其他多種疾病中被用于試驗性治療，都取得了良好的效果，如IBD、IBS、肥胖、代謝綜合征、糖尿病等。還有FMT被成功運(yùn)用于系統(tǒng)性硬化病、帕金森病、慢性疲勞綜合征和特發(fā)性血小板減少性紫癜等的個案報道。

國內(nèi)外研究進(jìn)展1檢測指標(biāo)及意義3實驗方案2創(chuàng)新之處及可行性分析4研究方案研究目標(biāo)和內(nèi)容（1）分組情況（2）模型建立（3）糞菌液的制備（4）指標(biāo)檢測（5）

Chiu氏6級評分法評估損傷程度

（6）統(tǒng)計學(xué)分析2實驗方案2.1分組情況健康SD大鼠54只，雌雄各半，體重200-250g，由山西醫(yī)科大學(xué)生理實驗室提供。隨機(jī)分成3組：空白對照組(A組)、模型對照組（B組）、糞菌液模型組（C組），每組18只。其中A組為正常大鼠，給予無菌生理鹽水保留灌腸，每天一次，自由飲水、進(jìn)食。B、C兩組為潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠，分別給予無菌生理鹽水、糞菌液保留灌腸，每天一次，自由飲水、進(jìn)食。（生理鹽水量、糞菌液量按體重?fù)Q算）2.2模型建立大鼠造模前1d禁食24h，不禁水，稱重后，3％的戊巴比妥（1ml/kg）腹腔注射麻醉，5％2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBSW/V)按100mg/kg加入等體積50%乙醇溶液；體位為頭朝下，用聚丙烯管插入肛門上段8cm，注射器注人。再倒立1～5min左右，以防藥液溢出，一次性灌腸。2.4指標(biāo)檢測

2.5Chiu氏6級評分法評估損傷程度

分別于造模后3d、7d、11d每組各取6只大鼠，3％戊巴比妥鈉麻醉后開腹，使用一次性采血針穿刺門靜脈取全血2ml，待低溫離心后，再吸出上清液，置于一80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，采用酶?lián)免疫法（ELISA）測定血清TNF-α、IL-8濃度。取肛門以上8cm腸段卷起，置10％中性甲醛中固定、石蠟包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察。并且于取材完畢后采用頸椎脫臼法處死相應(yīng)大鼠。2.6統(tǒng)計學(xué)分析采用Spss13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，各組實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，血清學(xué)指標(biāo)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3檢測指標(biāo)及意義TNF-α主要由脂多糖(LPS)激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，對免疫反應(yīng)、機(jī)體代謝、炎癥反應(yīng)、抗腫瘤均有重要的調(diào)節(jié)介導(dǎo)作用。1.潰瘍性結(jié)腸炎中TNF-α分泌水平及其mRNA表達(dá)高于正常組或未受累結(jié)直腸粘膜。2.TNF-α不僅能刺激巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌花生四烯酸代謝物、細(xì)胞因子和蛋白酶，還能吞噬細(xì)胞產(chǎn)物和補(bǔ)體片段引起細(xì)胞壞死、間質(zhì)中蛋白質(zhì)破壞和水腫的發(fā)生，從而促進(jìn)胃腸細(xì)胞的組織損害。3.TNF-α可使中性粒細(xì)胞聚集，內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子上調(diào)以及增加上皮緊密連接的通透性和抑制上皮細(xì)胞的生長等，還可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，破壞腸粘膜屏障，同時血管系統(tǒng)也遭到破壞，通過以上途徑導(dǎo)致一系列潰瘍性結(jié)腸炎典型的炎癥病變。IL-8是一種強(qiáng)而有力的中性粒細(xì)胞趨化和活化因子，由單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞在IL-1、TNF和外源性因子細(xì)菌多糖(LPS)的刺激下產(chǎn)生,其主要生物學(xué)作用是1.趨化并激活中性粒細(xì)胞,促進(jìn)中性粒細(xì)胞的溶酶體酶活性和吞噬作用,對嗜堿性粒細(xì)胞和T細(xì)胞也有一定的趨化作用。2.臨床試驗發(fā)現(xiàn)IL-8在UC患者的腸黏膜上皮中高表達(dá)并且IL-8水平與結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。檢測指標(biāo)及意義3可行性分析創(chuàng)新點

1導(dǎo)師對此項課題有系統(tǒng)、全面的認(rèn)識與把握

2.已初步掌握動物飼養(yǎng)及實驗操作的基本要領(lǐng)3.山西醫(yī)科大學(xué)實驗中心具備本實驗相關(guān)條件創(chuàng)新之處及可行性分析4現(xiàn)階段，F(xiàn)MT研究大部分是關(guān)于FMT治療復(fù)發(fā)性、難治性炎癥性腸?。↖BD）的個案或系列病例報道,對常規(guī)治療失敗或有手術(shù)禁忌證的UC病人，F(xiàn)MT或許是不錯的選擇，但其作用機(jī)制尚不完全清楚研究基礎(chǔ)前期研究工作積累（1）

導(dǎo)師武華教授有深厚的學(xué)術(shù)造詣和豐富的臨床經(jīng)驗，可為實驗提供理論技術(shù)指導(dǎo)。（2）已參閱大量與課題相關(guān)的中英文文獻(xiàn)及與本課題參考性較強(qiáng)的相關(guān)資料和理論。硬件設(shè)施基本完備我校生理實驗室具備完成本實驗的基本條件：高速冷凍離心機(jī)、均漿機(jī)、超低溫冰箱、氮氣操作廚、，可以滿足本課題的需求。動物中心實驗室有飼養(yǎng)動物的動物房和飼養(yǎng)條件。預(yù)期結(jié)果

1.給予糞菌水的UC大鼠與給予無菌生理鹽水的UC大鼠相比，血清TNF-α、IL-8檢測值較小，說明前者的腸道炎癥反應(yīng)輕，通透性低，腸屏障功能相比后者較好。2.給予糞菌水的UC大鼠與給予無菌生理鹽水的UC大鼠相比，結(jié)直腸損傷情況判定評分較低。經(jīng)費(fèi)預(yù)算支出科目金額（萬元）計算根據(jù)及理由合計0.8科研業(yè)務(wù)費(fèi)0.25查閱資料、發(fā)表論文實驗材料費(fèi)0.5動物飼養(yǎng)、化學(xué)試劑及耗材0.05儀器設(shè)備使用費(fèi)參考文獻(xiàn)主要參考文獻(xiàn)：．參考文獻(xiàn)

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