束永前ngs肺癌臨床應(yīng)用束永前ws課件

1NGS在肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用

高通量測序技術(shù)的發(fā)展及研究報道高通量測序技術(shù)在腫瘤臨床的應(yīng)用1目錄

TableofContents3SequencingGetsCheaperandFaster單人全基因組測序成本（美金）：HGP: $3Billion2004: $30,000,0002008: $100,0002010: $10,0002011: $4,0002014: $1,000???: $100測序成本迅速下降，超過了摩爾定律

Cost

isDecreasingExponentially,BeatingMoore’sLaw562013年NEJM發(fā)表的臨床文獻(xiàn)，43%運(yùn)用高通量技術(shù)目前高通量測序大量應(yīng)用于國內(nèi)外臨床癌癥研究21世紀(jì)的癌癥分型需要病理和分子聯(lián)合進(jìn)行

–ASCO2014,Chicago,Dr.MStratton(英國首相醫(yī)學(xué)顧問）7在不同病理類型中，肺癌驅(qū)動基因突變譜存在明顯的差異早期肺腺癌中EGFR突變率和晚期相似ZhangX,etal.2013ASCOAbstract1547.YangPC,etal.2012ASCOAbstract1534.2013ASCO早期NSCLCICANEGFR突變狀態(tài)(%)2012ASCO晚期NSCLCPIONEEREGFR突變狀態(tài)(%)8023：NTRK1基因融合作為肺癌新的癌基因靶點(diǎn)結(jié)論在肺腺癌中通過NGS/FISH發(fā)現(xiàn)了一種新的癌基因NTRK1融合需要開展更多研究以明確NTRK1融合在肺癌中的發(fā)生率和特征該研究提示需要在NTRK1融合陽性患者中開展前瞻性Trk抑制劑的臨床研究35例泛陰性(EGFR,KRAS,ALK,ROS1)肺腺癌樣本新的Break-Apart

FISH檢測

第2代測序技術(shù)(CLIA認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室)對表現(xiàn)為新NTRK1基因融合的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及藥理抑制分析56例泛陰性(EGFR,KRAS,ALK,ROS1,RET)肺腺癌樣本DoebeleRC,etal.2013ASCOAbstract8023.3/91(3.3%)肺鱗癌驅(qū)動基因突變研究71肺鱗癌病人標(biāo)本NGS和定量PCR檢測突變和基因擴(kuò)增基因名稱突變頻率TP5359.2%PI3KCA19.7%FGFR21.4%HRAS2.8%APC1.4%KRAS1.4%MET1.4%EGFR4.2%AKT11.4%PTEN1.4%SMAD41.4%KIF5B-RET1.4%FGFR31.4%基因名稱變異類型頻率CDKN2A缺失/突變/甲基化72%PI3KCA突變16%PTEN突變/缺失15%FGFR1擴(kuò)增15%EGFR擴(kuò)增9%PDGFRA擴(kuò)增/突變9%CCND1擴(kuò)增8%DDR2突變4%BRAF突變4%ERBB2擴(kuò)增4%FGFR2突變3%KohY,etal.2013ASCOAbstract7572.GovindanR,etal.2012ASCOAbstract7006.2013ASCO

178例肺鱗癌標(biāo)本127例（75%）患者確認(rèn)潛在治療靶點(diǎn)檢測基因拷貝數(shù)，外顯子突變，mRNA表達(dá)和啟動子甲基化2012ASCO40.9%的鱗癌患者存在聯(lián)合基因突變，表明了鱗癌患者基因型的復(fù)雜性13手術(shù)切除的肺鱗癌患者中FGFR1擴(kuò)增對預(yù)后的影響63例經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)、臨床已切除肺鱗癌評估FGFR1狀態(tài)與臨床特征#和DFS*之間的關(guān)系FGFR1擴(kuò)增定義為FGFR1拷貝數(shù)≥2.2xCEP8拷貝數(shù)結(jié)果：FGFR1擴(kuò)增與年齡(p>0.99)、性別(p>0.99)、吸煙史(p=0.32)或疾病分期(p=0.18)之間無相關(guān)性多因素分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR1擴(kuò)增與DFS改善顯著相關(guān)(HR3.2,95%CI1.1-9.4)HellmannMD,etal,etal.2013ASCOAbstract7559.*Log-rank，#Fisher’s精確檢驗(yàn)PI3K通路驅(qū)動IV期肺鱗癌患者的轉(zhuǎn)移模式和生存68例IV期肺鱗癌患者的FFPE腫瘤標(biāo)本FGFR1擴(kuò)增(FISH)PIK3CA突變(Sequenom)PTEN缺失(IHC)PTEN突變(外顯子測序)采用Kaplan-Meier法估算生存率采用Log-rank檢驗(yàn)和Cox比例風(fēng)險法進(jìn)行組間比較PaikPK,etal.2013ASCOAbstract8022.PI3K通路驅(qū)動IV期肺鱗癌患者的轉(zhuǎn)移模式和生存OS單因素分析：OS多因素分析：考慮到年齡、性別、KPS因素后，仍然顯示PI3K與生存期短相關(guān)HR=3.3，(95%CI:1.5-7,p=0.03)

轉(zhuǎn)移部位的驅(qū)動基因分析腦轉(zhuǎn)移在鱗癌中不常見，但在PI3K異常腫瘤高達(dá)22%腦轉(zhuǎn)移僅出現(xiàn)在PI3K異常腫瘤PaikPK,etal.2013ASCOAbstract8022.OS95%CIP值(vs其他)FGFR1擴(kuò)增19.510.8-NR0.059PI3K9.498.1-NR0.004其他13.79.7-NR結(jié)論：IV期PI3K異常肺鱗癌患者的生存較差腦轉(zhuǎn)移在PI3K異常的患者中更常見，且僅出現(xiàn)在PI3K異常的患者中PI3K通路活化具有不同的生物學(xué)特點(diǎn)，以該通路為靶點(diǎn)的治療方法可能是伴腦轉(zhuǎn)移的肺鱗癌患者的一種有效治療策略靶向治療耐藥后基因突變研究針對驅(qū)動基因突變研制的分子靶向藥物在晚期NSCLC治療方面已經(jīng)顯現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。表皮生長因子受體(EGFR)敏感突變的患者，可從EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療中獲得更好的療效，但幾乎所有患者遲早均要發(fā)生EGFR-TKI獲得性耐藥，中位無進(jìn)展時間只有8~12個月當(dāng)靶向治療后出現(xiàn)耐藥時，臨床上面臨眾多治療困惑，也是當(dāng)今肺癌個體化治療的研究熱點(diǎn)之一靶向治療耐藥機(jī)制（1）EGFR二次突變，例如20外顯子T790M、T854A、L747S、D761Y等。（2）下游信號傳導(dǎo)通路基因突變，例如RAS、RAF、PI3CA、PTEN等。（3）旁路激活，例如HER2擴(kuò)增或突變、MET基因擴(kuò)增、ALK基因融合ROS1基因融合、AXL基因擴(kuò)增等。（4）表皮間質(zhì)化（EMT）。（5）轉(zhuǎn)化為SCLC。EGFR-TKI耐藥機(jī)制：EGFR二次突變&其他致癌基因激活同時有EGFR擴(kuò)增機(jī)制不明SCLC轉(zhuǎn)化T790MSequistLV,etal.SciTranslMed2011;3(75);AdaptedfromSequistLV,etal.2012ASCO.EGFR-TKI治療NSCLC耐藥過程中

cMET/ErbB3激活和過表達(dá)的作用無論EGFR突變狀態(tài)如何，EGFR/cMET相對水平高的患者PFS顯著更好隨著cMET參與的程度越高或E/M指數(shù)越低，NSCLC的臨床獲益越差PFS越短(<8個月)的患者總體和磷酸化ErbB3水平(陽性率67%vs.27%)顯著高于PFS越長(>8個月)的患者結(jié)論：cMET和ErbB3在NSCLC患者對EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥過程中具有重要作用E/M指數(shù)及其活化可作為選擇EGFR抑制劑和cMET抑制劑的預(yù)測標(biāo)志物，但還需要前瞻性臨床研究的驗(yàn)證AhnMJ,etal.2013ASCOAbstract11113.NGS發(fā)現(xiàn)NSCLC靶向治療新的合并突變在人類H3255NSCLC細(xì)胞株(攜帶EGFRL858R，但無BRAFV600E，對厄洛替尼敏感)中，BRAFV600E的過表達(dá)會導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生BRAFV600E介導(dǎo)的厄洛替尼耐藥可通過BRAF抑制劑Vemurafenib逆轉(zhuǎn)結(jié)論：EGFR突變NSCLC可包含額外BRAF致癌驅(qū)動突變且在治療前發(fā)生率低EGFRTKI治療可以導(dǎo)致BRAFV600E表達(dá)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增，產(chǎn)生獲得性EGFRTKI耐藥，而BRAF抑制劑治療后可逆轉(zhuǎn)突變率治療前EGFRL858R95%BRAFV600E～6%獲得耐藥性后EGFRT790M～14%BRAFV600E60%10倍BlakelyCB,etal.2013ASCOAbstract11004.收集EGFR-TKI治療前及EGFR-TKI耐藥后的FFPE標(biāo)本，使用IlluminaHiSeq2000進(jìn)行398個腫瘤相關(guān)基因的外顯子測序伴T790M突變的EGFR突變型NSCLC患者

中ROR1mRNA表達(dá)（來自EURTAC研究）入組EURTAC研究中的95例患者：65%伴有治療前T790M突變，評估45例患者的ROR1表達(dá)與治療和生存的關(guān)系厄洛替尼組(n=24)化療組(n=21)同時伴T790M突變、接受厄洛替尼治療的患者(n=15)ROR1高表達(dá)ROR1低/中表達(dá)ROR1高表達(dá)ROR1低/中表達(dá)ROR1高表達(dá)ROR1低/中表達(dá)中位PFS,月5.811.895.62.710.8P值0.0330.0174結(jié)論：高ROR1表達(dá)顯著限制伴T790M突變患者的PFSROR1導(dǎo)向治療可提高厄洛替尼治療伴ROR1過表達(dá)的EGFR突變型NSCLC患者的療效*僅在低ROR1表達(dá)者中有效KarachaliouN,etal.2013ASCOAbstract11027.第三代EGFR-TKI已經(jīng)初步確立了臨床療效靶病灶自基線最大變化(%)

(T790M+可評估患者，擴(kuò)大隊列[N=107])ORR=64%(69/107)DCR(CR+PR+SD)=94%(101/107)40200-20-40-60-80-10020mgQD40mgQD80mgQD160mgQD240mgQDJannePA,etal.2014ASCOAbstract8009.通過NGS發(fā)現(xiàn)C797S突變?yōu)锳ZD9291的獲得性耐藥突變Thressetal,NatMed.2015,doi:10.1038/dm.3854NGS的臨床應(yīng)用探索仍在繼續(xù)

-----2015ASCO最新報道29世和基因版權(quán)所有EGFR信號通路（紅色為世和檢測的重要節(jié)點(diǎn)基因）EGFR為肺癌最主要用藥基因常見突變集中于18，19，20，21外顯子；但突變類型多變，包括點(diǎn)突變，缺失，插入，拷貝數(shù)變化。這些對用藥都有極其重要意義傳統(tǒng)熱點(diǎn)檢測只能檢測一種突變類型如點(diǎn)突變，往往漏掉許多重要信息基因上下游綜合信號通路分析也至關(guān)重要，如RAS-RAF-MEK-ERK及PI3K-AKT等NGS與肺癌EGFR專題3031EGFR少見突變研究進(jìn)展

UnusualmutationofEGFREGFR基因常見激活突變21外顯子L858R、19外顯子非移碼插入突變目前檢測較多18-21外顯子其他敏感突變?nèi)鏕719Xaa、L861Q、S768I目前檢測較少最新大樣本研究結(jié)果顯示，在3項(xiàng)肺癌臨床實(shí)驗(yàn)600例肺癌患者中，12%（75/600）肺癌患者攜帶18-21外顯子少見突變（如G719Xaa、L861Q、S768I），并根據(jù)突變情況分成三組，給予阿法替尼給藥治療。第一組：18-21外顯子少見點(diǎn)突變第二組：單獨(dú)T790M突變或者T790M突變與其它突變共存第三組：EGFR基因20外顯子插入突變分組Group1Group2Group3ORR71.1%14.3%8.7%MPFS10.7month2.9month2.7monthMOS19.4month14.9month9.2monthJamesC-HYangetal.Lancetoncology2015發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制

RevealDrugResistance耐藥機(jī)制突變所占比例臨床意義及治療方案選擇EGFR基因T790M突變50%一代EGFRTKI抗藥，二代TKI如阿法替尼仍部分有效，三代針對此突變的TKI如AZD9291高度有效EGFR基因20外顯子非移碼插入突變4-9.2%一代、二代EGFRTKI均可能抗藥ALK基因融合3%-7%ALKTKI如克唑替尼、色瑞替尼有效；一代EGFRTKI抗藥ALK基因融合并攜帶特定點(diǎn)突變未統(tǒng)計一代ALKTKI如克唑替尼可能抗藥；二代ALKTKI如色瑞替尼部分有效BRAF基因V600E激活突變1%-2%一代EGFRTKI抗藥；BRAF抑制劑如威羅菲尼、達(dá)拉菲尼可能有效BRAF基因15外顯子其他激活突變1%-4%一代EGFRTKI可能抗藥HER2基因20外顯子非移碼插入突變2%-4%一代EGFRTKI可能抗藥，二代TKI如阿法替尼仍有效HER2單抗如赫塞汀可能有效KRAS基因2、3、4外顯子激活突變15%-25%一代EGFRTKI抗藥；MEK抑制劑可能有效MEK1基因特定激活突變1%一代EGFRTKI抗藥；MEK抑制劑可能有效MET/HGFR基因擴(kuò)增5%-20%一代EGFRTKI抗藥；MET抑制劑如克唑替尼可能有效NRAS基因2、3外顯子激活突變1%一代EGFRTKI抗藥；MEK抑制劑可能有效PIK3CA基因9、20外顯子激活突變5%一代EGFRTKI抗藥；MTOR抑制劑如伊維莫司可能有效PTEN基因截短失活突變?nèi)鏡233*4%-8%一代EGFRTKI抗藥；MTOR抑制劑如伊維莫司可能有效ROS1基因融合2%ROS1TKI如克唑替尼有效；一代EGFRTKI可能抗藥發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制實(shí)現(xiàn)個體化治療，真正做到“對癥下藥耐藥機(jī)制也是臨床科研領(lǐng)域的熱門領(lǐng)域，高分值科研成果322015年ASCO會議報道EGFR-TKIs新耐藥機(jī)制332015年ASCO會議報道了肺癌兩種驅(qū)動突變，同時也是EGFR-TKIs耐藥機(jī)制：MET基因14外顯子缺失和NF1基因失活突變突變MET基因14外顯子缺失NF1基因失活突變突變解釋MET基因14外顯子缺失引起MET蛋白與c-CBL結(jié)合能力缺失，抑制c-CBL對MET的泛素化，抑制MET蛋白溶酶體降解途徑，導(dǎo)致MET蛋白水平升高。NF1基因介導(dǎo)KRAS-GTP向KRAS-GDP轉(zhuǎn)化過程，NF1失活導(dǎo)致其對KRAS抑制活性缺失，KRAS持續(xù)激活下游信號通路用藥相關(guān)EGFR-TKIs耐藥MET抑制劑如克唑替尼可能有效EGFR-TKIs耐藥MEK抑制劑可能有效突變特點(diǎn)全新的突變類型—剪切突變（常見突變類型包括拷貝數(shù)變化、堿基置換突變、缺失突變、插入突變、染色體斷裂重排）無突變熱點(diǎn)—抑癌基因失活(腫瘤中原癌基因突變主要集中在結(jié)構(gòu)域、結(jié)合位點(diǎn)等熱點(diǎn)位點(diǎn)，抑癌基因不存在突變熱點(diǎn)，全基因各區(qū)域均可能發(fā)生失活突變)檢測方法高通量測序或PCR方法高通量測序P.Paiketal.2015ASCOAbstract8021；PA.Redigetal.2015ASCOAbstract80222.總結(jié)隨著研究的深入，我們不斷發(fā)現(xiàn)新的肺癌驅(qū)動基因，不斷完善肺癌的驅(qū)動基因譜，并研發(fā)新的靶向治療藥物EGFR基因是突變概率最大、最多病人治療獲益的靶點(diǎn)，尤其是在亞裔患者，除了常見位點(diǎn)，攜帶少見EGFR突變，通過NGS檢測出來仍然能通過靶向藥物獲益由于原發(fā)或繼發(fā)性耐藥的發(fā)生，未來驅(qū)動基因的檢測決不是一次性就可解決的問題，需要伴隨治療過程進(jìn)行動態(tài)的檢測測序技術(shù)的不斷發(fā)展優(yōu)化是未來根據(jù)驅(qū)動基因選擇靶點(diǎn)治療的技術(shù)保證，是個體化治療的基礎(chǔ)高通量測序技術(shù)的發(fā)展及研究報道高通量測序技術(shù)在腫瘤臨床的應(yīng)用2目錄

TableofContents35精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的到來肺癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是精確診斷與靶向治療的結(jié)合精確診斷靶向治療分子靶點(diǎn)藥物EGFR吉非替尼、厄洛替尼、?？颂婺?、阿法替尼、CO-1686,AZD9291ALK克唑替尼、AlectinibMetTivantinib(ARQ197),Onartuzumab(MetMab)Cabozantinib(XL184)FGFR1Nintedanib,XL999HER-2阿法替尼RET/ROS融合基因克唑替尼,AP26113,ASP3026RAS/MAPK通路Trametinib(GSK1120212)，Pimastertib，Refametinib,TAK733……PI3K/PTEN/AKTBEZ235,XL-765……PD-1/PDL-1Nivolumab,MPDL3280AHSP90…..Ganetespib未來5年內(nèi)靶向臨床藥物的選擇將會有一個爆炸性的增長

ExplosiveGrowthforTargetsTherapiesExpectedinNext5YearsFDA統(tǒng)計于2012年38肺癌臨床藥物及治療

TargetedTherapiesinLungCancer39英文藥名中文藥名藥敏基因備注Bevacizumab貝伐單抗VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3等--Erlotinib特羅凱EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等一代TKIGefitinib易瑞沙EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等一代TKIIcotinib?？颂婺酔GFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等一代TKICetuximab西妥昔單抗EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等貴，T790M突變可用Crizotonib克唑替尼EML4-ALK融合，ALK擴(kuò)增，ROS1，MET等貴，一代ALK抑制劑肺癌靶向藥物極多且選擇邏輯復(fù)雜，目前在國內(nèi)上市的肺癌藥物有以下六種此外肺癌還有20款以上藥物在國外上市或處于臨床實(shí)驗(yàn)中，包括AZD9291、CO-1686等肺癌臨床藥物及治療

TargetedTherapiesinLungCancer英文藥名中文藥名藥敏基因備注Ramucirumab雷莫盧單抗VEGFR2貴，國外上市Afatinib阿法替尼EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等貴，國外上市但一代TKI耐藥可用Nimotuzumab尼妥珠單抗EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等國外上市T790M耐藥后可用Panitumumab帕妥珠單抗EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等國外上市T790M耐藥后可用Ceritinib色瑞替尼EML4-ALK融合，ALK擴(kuò)增，ROS1，MET等國外上市克唑替尼耐藥后可用Alectinib-EML4-ALK融合，ALK擴(kuò)增，ROS1，MET等國外上市，腦轉(zhuǎn)移可用克唑替尼耐藥后可用AZD9291-EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等未上市T790M突變可用CO-1686-EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等未上市T790M突變可用AUY922-EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等未上市20外顯子耐藥插入可用肺癌靶向藥物還有20款以上藥物在國外上市或處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，包括AZD9291、CO-1686等40目前靶向治療現(xiàn)狀（I/IV）癌種部分關(guān)聯(lián)基因突變靶向藥物EGFRExons18-21Erlotinib/gefitinib肺癌

EML4--‐ALKFusionproductPF02341066ALK/c-Metinhibitor

XRCC25SNPsResponsetoplatinumagents

ERCC1mRNAexpression

RRMImRNAexpression

41現(xiàn)國內(nèi)常見檢測位點(diǎn)，一般為幾個基因，幾個位點(diǎn)目前靶向治療現(xiàn)狀（II/IV）42信號通路復(fù)雜性決定了：一代桑格測序采用的一個或幾個基因檢測不能準(zhǔn)確的指導(dǎo)用藥目前靶向治療現(xiàn)狀（III/IV）43美國麻省綜合醫(yī)院現(xiàn)采用的癌癥檢測包括236個基因的全長測序德州MDAndersonCancerCenter正在研發(fā)的檢測包括近400基因如果要準(zhǔn)確進(jìn)行個性化用藥，我們需要了解癌癥突變?nèi)跋嚓P(guān)基因：包括信號通路上下游基因、同一基因家族基因等目前靶向治療現(xiàn)狀（IV/IV）44基因的突變類型多種多樣，單位點(diǎn)檢測漏掉大量信息突變類型現(xiàn)常用檢測方法單堿基突變（KRASG12D）PCR+桑格測序小范圍堿基缺失/插入（KITV559del）PCR+桑格測序大范圍堿基缺失/插入（EGFR19外顯子）ARMSPCR基因擴(kuò)增/表達(dá)變化（ERBB2/HER2擴(kuò)增）熒光定量PCR,FISH基因融合（EML4-ALK融合）FISH高通量測序可以一次檢測上面列舉的所有突變類型人類基因組結(jié)構(gòu)變化示圖：基因突變類型多種多樣通過臨床新一代測序技術(shù)(NGS)揭示

基因變異高檢出率以指導(dǎo)肺癌的靶向治療386個肺癌FFPE標(biāo)本，95%為NSCLC(367/386)通過NGS為基礎(chǔ)的診斷性檢驗(yàn)方法來描繪基因變異圖譜檢測182個癌癥相關(guān)基因的3320個外顯子檢測腫瘤中重排頻率較高的14個基因的37個內(nèi)含子結(jié)果：確認(rèn)1205個基因改變，平均每個腫瘤3.31個改變(0-10)85%(310)標(biāo)本包含1個可作為靶點(diǎn)的基因改變*，平均每個標(biāo)本1.79個(0-6)在68%(248)的腫瘤中，至少1個檢測到的基因變異會被目前“熱點(diǎn)”檢測**所遺漏AliSM,etal.2013ASCOAbstract8020.*可作為靶點(diǎn)的基因改變定義為具有相應(yīng)的靶向抗腫瘤藥物或能夠在臨床研究中加以評價的基因靶點(diǎn)改變*

*熱點(diǎn)檢測