生物發(fā)光與仿生學(xué)

生物發(fā)光與仿生學(xué)生物世界里說到發(fā)光，人們首先會想到螢火蟲，生物發(fā)光（bioluminescence）是指生物體發(fā)光或生物體提取物在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)光的現(xiàn)象。它不依賴于有機(jī)體對光的吸收，而是一種特殊類型的化學(xué)發(fā)光，化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿男蕩缀鯙?00%。也是氧化發(fā)光的一種。生物發(fā)光的一般機(jī)制是：由細(xì)胞合成的化學(xué)物質(zhì)，在一種特殊酶的作用下，使化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。生物發(fā)光的分類自然界具有發(fā)光能力的有機(jī)體種類繁多。一些細(xì)菌和高等真菌有發(fā)光現(xiàn)象。動物界25個門中，就有13個門28個綱的動物具有發(fā)光現(xiàn)象，從最簡單的原生動物到低等脊椎動物中都有發(fā)光動物，如鞭毛蟲、海綿、水螅、海生蠕蟲、海蜘蛛和魚等。動物的發(fā)光，除其自身發(fā)光即一次的發(fā)光以外，由寄生或共生而產(chǎn)生二次發(fā)光的例子也不少。不同生物體的發(fā)光顏色不盡一致，多數(shù)發(fā)射藍(lán)光或綠光，少數(shù)發(fā)射黃光或紅光。螢火蟲的發(fā)光是生物發(fā)光的一種。螢火蟲的發(fā)光原理是：螢火蟲有專門的發(fā)光細(xì)胞，在發(fā)光細(xì)胞中有兩類化學(xué)物質(zhì)，一類被稱作螢光素（在螢火蟲中的稱為螢火蟲螢光素(Fireflyluciferin)），另一類被稱為熒光素酶。熒光素能在熒光素酶的催化下消耗ATP，并與氧氣發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)中產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，當(dāng)氧化熒光素從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時釋放出光子。反應(yīng)中釋放的能量幾乎全部以光的形式釋放，只有極少部分以熱的形式釋放，反應(yīng)效率為95%，甲蟲也因此而不會過熱灼傷。人類到目前為止還沒辦法制造出如此高效的光源。海螢受刺激時，就把直徑只有萬分之一厘米的熒光素黃色顆粒，和直徑只有萬分之二厘米的無色熒光酶顆粒，以及由發(fā)光腺中產(chǎn)生的粘液一齊排入水中，產(chǎn)生淺藍(lán)色的光。發(fā)光機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)發(fā)光和細(xì)胞外發(fā)光兩類：前者較普遍，以夜光藻為代表；后者為從生物體排放出來的某些腺體中含有能發(fā)光的物質(zhì)。兩者都是通過化學(xué)反應(yīng)將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽?。因放出的能量很微，稱為冷光。節(jié)足動物細(xì)菌它的反應(yīng)機(jī)制與前三種不同。底物在催化循環(huán)中會形成還原型核黃素磷酸鹽和醛化合物，當(dāng)遇到熒光素酶和氧時，就會形成一種激發(fā)的絡(luò)合物。絡(luò)合物斷裂時生成氧化核黃素磷酸鹽、酸、水及一個光子，波長470～505納米，光為藍(lán)綠色。腔腸動物包括刺絲胞亞門和櫛水母亞門。這種類型發(fā)光具有各種不同的活化反應(yīng)。亞門和綱不同，活化反應(yīng)與激發(fā)特性也不同。此類發(fā)光還可以從一個發(fā)光種傳遞激發(fā)態(tài)能量給另一個發(fā)光種，即有敏化生物發(fā)光現(xiàn)象。這種發(fā)光可發(fā)出不同顏色的光，較多地偏向紅色，波長480～490納米。過氧化氫生物包括海筍屬、蚯蚓屬及柱頭蟲屬等。這類發(fā)光包括兩個過程，蟲熒光素與氧或過氧化物單獨(dú)或兩者作用后先生成超氧陰離子（自由基），然后再激發(fā)。生物發(fā)光的應(yīng)用活體生物發(fā)光成像技術(shù)活體動物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光(種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動物以獲得數(shù)據(jù)。1.標(biāo)記細(xì)胞(1)癌癥與抗癌藥物研究直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可對癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時觀測和評估?；铙w生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。精諾真生物成像技術(shù)提高了檢測的靈敏度，即使微小的轉(zhuǎn)移灶也能被檢測到(可以檢測到體內(nèi)102個細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移)。目前已商品化的腫瘤細(xì)胞株包括：前列腺癌,黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，子宮頸癌和結(jié)腸癌等BiowareTM細(xì)胞系模型。將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植入脾及骨髓，可用于實(shí)時觀測活體動物體內(nèi)干細(xì)胞造血過程的早期事件及動力學(xué)變化。有研究表明，應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞，檢測放射及化學(xué)藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)制。應(yīng)用可見光活體成像原理標(biāo)記細(xì)胞，建立動物模型，可有效的針對同一組動物進(jìn)行連續(xù)的觀察，節(jié)約動物樣品數(shù)，同時能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉(zhuǎn)移途徑及抗性蛋白表達(dá)的改變。(2)免疫學(xué)與干細(xì)胞研究當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白無熒光素酶活性，細(xì)胞不能發(fā)光，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase-3在特異識別位點(diǎn)切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，由此可用于觀察活體動物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)事件。(3)細(xì)胞凋亡2.標(biāo)記病毒(1)病毒浸染以熒光素酶基因標(biāo)記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵和病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的過程。多種病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標(biāo)記，用于觀察病毒對機(jī)體的侵染過程。(2)基因治療基因治療包括在體內(nèi)將一個或多個感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效的傳遞到靶細(xì)胞?？蓱?yīng)用熒光素酶基因作為報告基因用于載體的構(gòu)建，觀察目的基因是否能夠在試驗(yàn)動物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達(dá)。這種非侵入方式具有容易準(zhǔn)備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中,用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況。3.標(biāo)記細(xì)菌(1)細(xì)菌浸染研究可以用標(biāo)記好的革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌侵染活體動物,觀測其在動物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應(yīng)。(2)抗生素藥物利用標(biāo)記好的細(xì)菌在動物體內(nèi)對藥物的反應(yīng)，醫(yī)藥公司和研究機(jī)構(gòu)可用這種成像技術(shù)進(jìn)行藥物篩選和臨床前動物實(shí)驗(yàn)研究。近年來，國際上大型制藥公司紛紛將精諾真技術(shù)在動物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為FDA(美國食品和藥品檢驗(yàn)局)藥物申報材料中非常重要的臨床前動物實(shí)驗(yàn)部分。(1)組織特異性基因表達(dá)熒光素酶(luciferase)是一類生物發(fā)光酶，其中的renilla熒光素酶和firefly熒光素酶分別識別不同的底物,一種細(xì)胞可被這兩種熒光素酶標(biāo)記:renilla熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動子驅(qū)動,作為內(nèi)參，反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化;firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動子驅(qū)動。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號的變化，在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動子在動物體內(nèi)的表達(dá)活性。(2)蛋白質(zhì)相互作用觀察細(xì)胞中或活體動物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導(dǎo)入細(xì)胞或動物體內(nèi)表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強(qiáng)相互作用時，表達(dá)的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應(yīng)用此原理亦可用于研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑。(3)阻斷RNA通過對比生物發(fā)光的變化，驗(yàn)證在成年小鼠體內(nèi)，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達(dá)。4.基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用(1)基因表達(dá)為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。利用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況，從而實(shí)現(xiàn)對目的基因的研究?？捎糜谘芯縿游锇l(fā)育過程中特定基因的時空表達(dá)情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá)，以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。(2)各種疾病模型研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記，同時轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)