微生物工程課件

（第7-10周）05431-33班江寧（6：40amB310周五（單周）B211

2008-04-08第三章

微生物工程第一節(jié)

概述微生物工程（又稱為發(fā)酵工程）：是指應用微生物為人類制造有益產(chǎn)品及提供服務的技術。

微生物工程基本原理：微生物細胞一方面可以看成一種催化劑，它能促使生物物質之間的轉化；另一方面又可以將之看成一種微小的生物反應器，細胞外物質透過微生物細胞周圍的細胞壁和細胞膜進入微生物體內，然后再由微生物體內的酶系統(tǒng)的催化作用，把反應物轉化成產(chǎn)品，并釋放出來。因此，人們可以利用微生物體內特定的酶系所進行的催化作用(代謝作用)，把原材料轉變成人們需要的產(chǎn)品，如各種抗生素、氨基酸、有機酸、維生素等。

1870年以后，Pasteur等觀察到一種微生物對另一種微生物具有拮抗作用，并預計這種拮抗作用能應用于治療疾病。1928年，英國細菌學家AlexanderFleming偶然發(fā)現(xiàn)，污染在金黃色葡萄球菌培養(yǎng)皿上的點青霉能抑制細菌的生長。當時他指出，能夠抑制細菌生長的活性成分是一種由點青霉產(chǎn)生的、被稱為青霉素的物質所致。但這個重要的發(fā)現(xiàn)限于當時的社會條件，沒能及時地得到重視。直到第二次世界大站爆發(fā)以后，由于醫(yī)療的需要，F(xiàn)lorey和Chain等重新對點狀青霉的拮抗原理進行研究，經(jīng)過幾年的努力，終于分離提純了青霉素。1944年底他們首次使用青霉素進行治療，療效出人意料的顯著。于是，在美國北方地區(qū)實驗室的幫助下，于1945年前后實現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)。這一具有劃時代意義的工作，為現(xiàn)代抗生素工業(yè)奠定了基礎，同時掀起了尋找新抗生素的熱潮，一批具有臨床應用、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)應用價值的抗生素相繼被發(fā)現(xiàn)?？股毓I(yè)的崛起，不僅對很多微生物發(fā)酵工藝的發(fā)展起到了先驅作用，同時還為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)積累了豐富經(jīng)驗，建立了一整套的研究和生產(chǎn)方法。

十九世紀50年代和60年代發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展除了抗生素生產(chǎn)品種不斷增加，其主要的發(fā)展是微生物發(fā)酵產(chǎn)品范圍的不斷擴大，如氨基酸發(fā)酵、核苷酸發(fā)酵和對石油微生物的研究應用等，顯示出發(fā)酵工程的廣闊應用前景。

第一節(jié)

發(fā)酵工程中的微生物一、微生物菌種保藏微生物菌種在多次傳代中，會發(fā)生遺傳性的變異，而且退化性的變異是大量的，久置的菌種還會死亡，所以微生物菌種應妥善保藏，使之能長期保持存活、不退化，便于生產(chǎn)和科研使用。菌種保藏的原理是根據(jù)菌種的生理、生化特點，創(chuàng)造條件使菌體的代謝處于不活潑的狀態(tài)。保藏時，先挑選優(yōu)良的純種，最好是選取它們的休眠體（孢子、芽孢等），然后創(chuàng)造一個最有利于休眠的環(huán)境條件（如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質等），以降低菌種代謝活動的速度，達到延長保存期的目的。一種較好的保藏方法，首先要求能較長期地保存原有菌種的優(yōu)良特性，但也要考慮方法本身的經(jīng)濟簡便。至于具體采用哪種方法，要根據(jù)菌種特性及具體條件決定。

（二）、液體石蠟封藏法在長好菌苔的斜面試管中，加入滅過菌的液體石蠟，可防止或減少培養(yǎng)基內水分蒸發(fā)，隔絕培養(yǎng)物與氧的接觸，從而降低微生物的代謝活動，推遲細胞老化，延長了保存時間。適用于不能利用石蠟油作碳源的微生物的保藏。方法為選用優(yōu)質純凈無色中性的液體石蠟，經(jīng)121℃加壓蒸汽滅菌30min，然后在150~170℃烘箱中干燥1~2h，使水汽蒸發(fā)，石蠟油變清。再按無菌操作將滅菌的石蠟油注人長好菌苔的斜面試管中，液面高出斜面lcm。這種方法比較簡便易行，比斜面定期移植法的保藏時間長，但石蠟油管的轉接和搬運都很不方便。部分工業(yè)上的生產(chǎn)菌株也不易用此法保藏，因其容易造成生產(chǎn)能力的下降。

（三）、真空冷凍干燥保藏法真空冷凍干燥保藏法是在較低的溫度下(-15℃以下)，快速地將細胞凍結，并且保持細胞完整，然后在真空中使水分升華。為防止凍結和水分不斷升華對細胞的損害，采用保護劑來制備細胞懸液。經(jīng)過冷凍干燥的微生物的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因此菌種可以保存很長時間，一般5~10年，最多可達15年之久。真空冷凍干燥保藏法是目前保存菌種的一種比較好的方法。此法適用的微生物種類多，它能使菌種長時間保持活力，又能減少經(jīng)常移植引起的變異。凍干的菌種密封于小的安瓿管中，適于大批量的保存。

（四）、液氮超低溫保藏法微生物在-130℃的低溫下，所有的代謝活動暫時停止而生命延續(xù)，微生物菌種得以長期保存?？赏ㄟ^加入保護劑來降低細胞內溶液的冰點，減少冰晶對細胞的傷害。其方法是取合適的培養(yǎng)物，以5％～10％的甘油或二甲亞砜(DMSO)制成孢子懸液或菌懸液，濃度以大于108個／ml為宜。將此懸液注入無菌的安瓿管或聚丙烯小管內，密封。采用專用冷凍溫度控制儀以每lmin降低1℃的速度，從O℃降至-35℃，然后取出直接放入液氮中。保藏的菌種如需用時，將安瓿管由液氮中取出，立即置于38～40℃溫水浴中，振蕩，直到全部融化為止，開啟移種。液氮保藏法在實際應用中尚存在一些問題，如需要經(jīng)常補充液氮，保藏菌種的管理費用高，菌種的取出也不如凍干管方便。但這種方法可用微生物的多種培養(yǎng)材料進行保藏，不論孢子或菌體、液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)、菌落或斜面均可。此法是目前最可靠的一種長期保存菌種的方法。

沙土管保藏法的具體操作如下：取細沙除去有機雜質及鐵屑，過40～60目篩；取庭園土過100~120目篩，洗凈。將細土與沙按1：2(W／W)混合，分裝入小管內約2cm高，加棉塞，于121℃滅菌1h，間歇滅菌3~5次。將菌苔已長好的斜面，注入無菌水3～5ml，用接種針輕輕將菌苔刮下，制成菌懸液，接種0.2~0.3ml菌懸液人沙土管中，然后放在裝有干燥劑(如無水氯化鈣)的真空干燥器中，接通真空泵，抽干(一般4～6h即可抽干，管內沙土成松散狀)。干燥后的沙土管放在干燥器內置4℃冰箱中保存。此法適用于產(chǎn)孢子的微生物，如產(chǎn)芽孢的細菌、放線菌和絲狀真菌等，也是保存抗生素產(chǎn)生菌常用的方法。其缺點是存活率低，變異率高。以上這幾種保藏方法中，以斜面低溫保藏法和液體石蠟封藏法最為簡便，沙土管保藏法次之，真空冷凍干燥保藏法最為復雜。但是，在保藏效果上則恰好相反。

（六）、菌種保藏的注意事項1、在整個保存處理過程中要防止雜菌污染，并一定要做無菌檢查。2、保藏所用的菌種要在新鮮的斜面上生長豐滿，生長時間不宜過長。3、保藏過程中要防止菌種退化現(xiàn)象的發(fā)生，及時采用有效方法復壯，傳代次數(shù)過多容易退化。4、菌種制備過程是保持菌種優(yōu)良特性的一個重要環(huán)節(jié)。接種斜面不宜過密，接種量必須控制適當，使菌落能充分生長好。

二、菌種選育

菌種選育是微生物工程的關鍵技術，主要方法有傳統(tǒng)的自然選育、誘變育種以及現(xiàn)代的原生質體融合、代謝調控與基因工程等。1.自然選育自然選育是一種純種選育的方法。它利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離，篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株。因此，它能達到純化、復壯菌種、穩(wěn)定生產(chǎn)的目的。自然選育有時也可用來選育高產(chǎn)突變株，不過這種正突變的幾率很低，獲得優(yōu)良菌種的可能性極小，因此也就難以依賴自然選育來獲得高產(chǎn)突變株。自然選育一般包括單孢子懸浮液的制備、分離及單菌落培養(yǎng)、篩選等操作過程，為保持生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，自然選育常作為日常工作的一部分。

定向培育抗異煙肼的吡哆醇高產(chǎn)菌株的方法：先在培養(yǎng)皿中加入10ml的一般瓊脂培養(yǎng)基，使皿底斜放，待凝固后，將皿底放平，再在原先的培養(yǎng)基上倒10ml含有適當濃度(據(jù)實驗而定)的異煙肼的培養(yǎng)基，待凝。用此法制成的瓊脂平板上存在著一個由濃到稀的異煙肼的濃度梯度。然后在平板表面涂大量微生物細胞，培養(yǎng)后，出現(xiàn)圖(右)所示的結果。這是因為，右邊是低濃度異煙肼區(qū)域，因此長滿了原始的敏感菌，而左側是高濃度異煙肼區(qū)，該區(qū)中微生物的生長受到了抑制。只有在適中的部位才出現(xiàn)少數(shù)由抗異煙肼細胞形成的菌落。這類抗性菌落是由于供試菌中個別細胞產(chǎn)生了某種自發(fā)突變，所以形成了抗異煙肼的突變體。根據(jù)微生物產(chǎn)生抗藥性的原理，它們可能產(chǎn)生了分解異煙肼的酶類，也可能通過合成更高濃度的代謝產(chǎn)物(吡哆醇)來克服異煙肼的競爭性抑制作用。實驗結果證明，多數(shù)菌株因發(fā)生了后一類的突變才獲得抗性。因此，利用梯度平板法可達到定向培育某一代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的目的。3.誘變育種

本法是指人為地采用物理及化學方法使微生物基因產(chǎn)生突變的育種技術。誘變因素分為物理、化學及生物三類。物理誘變因子物理誘變因子主要包括紫外線（UV）、X射線（X-ray），γ射線（γ-ray）、快中子（FN）、β射線、超聲波、激光等，其中以紫外線輻照使用最為普遍，其它物理誘變因子則受設備條件的限制，難以普及。

（3）誘變劑插入（移碼誘變劑）：包括吖啶黃、吖啶橙等吖啶類化合物。這類化合物的平面三環(huán)結構可插入DNA雙螺旋的鄰近堿基對之間，造成DNA鏈上堿基的添加或缺失，從而造成堿基突變點后全部遺傳密碼轉錄和翻譯錯誤，引起菌種變異。生物誘變劑噬菌體可作為誘變劑應用于抗噬菌體菌種的選育，其作用原理可能與傳遞遺傳信息，誘發(fā)抗性突變有關。

誘變育種一般分為出發(fā)菌株的選擇、誘變和篩選三個步驟第一步：出發(fā)菌株的選擇。出發(fā)菌株是用于誘變的原始菌株，挑選合適的出發(fā)菌株對提高育種效率有重要意義。選擇出發(fā)菌株時，應考慮以下幾個問題：①.出發(fā)菌株的穩(wěn)定性，盡量挑選純系菌株，以排除異核體與異質體菌株，因此對選定的出發(fā)菌株常需通過自然選育進一步純化；②.選用具備某種優(yōu)良特性的菌株，如土霉素、四環(huán)素的通氨補料工藝的成功，是因為選育了一系列能把較高的糖、氨通過合成途徑轉化成抗生素的新菌株；③.挑選對誘變劑敏感的菌株，以提高突變頻率；④.菌種的生理狀態(tài)及生長發(fā)育時間，因為誘變劑對處于轉錄狀態(tài)或翻譯狀態(tài)的菌種效應要比靜止狀態(tài)或休眠狀態(tài)的菌種敏感得多。一般細菌處理營養(yǎng)體，并以處于對數(shù)生長期的菌體為佳。真菌和放線菌則處理它們的孢子，或處于剛開始萌發(fā)狀態(tài)的孢子。為了保證菌體和誘變劑均勻接觸，出發(fā)菌株都必須制備成單細胞（孢子）懸浮液，嚴格控制單孢子的分散度在95%以上。

第三步：突變株的篩選。因為突變的不定向性，優(yōu)良突變株的產(chǎn)生頻率極低，如何在較短時間內從大量變異的菌株中把極少數(shù)的優(yōu)良突變株篩選出來，需要設計一個高效率的篩選方案。常用的篩選方法有兩種，即隨機篩選和半理性化篩選。

隨機篩選：隨機篩選指菌種經(jīng)誘變處理后，憑經(jīng)驗隨機選擇一定數(shù)量的菌落，其中包括未發(fā)生突變的野生型菌株和發(fā)生突變后的正向及負向突變株，再進行搖瓶篩選。

半理性化篩選：近年來，隨著遺傳學、生物化學知識的積累，人們對多種抗生素生物合成途徑及代謝調控機制的了解不斷深入，抗生素產(chǎn)生菌的推理選育技術應運而生，即根據(jù)已知的或可能的生物合成途徑、代謝調控機制和產(chǎn)物分子結構來設計篩選方法，以打破微生物原有的代謝調控機制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株。

傳統(tǒng)的微生物育種方法推動了抗生素生產(chǎn)乃至整個發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，但這種選育方法費時費事，而且是盲目的，不能定向。后來由于對微生物的有性雜交，準性生殖和原核微生物物種基因重組現(xiàn)象的研究，實踐中又出現(xiàn)了雜交育種的新技術。1978年，第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學討論會上提出了原生質體融合的育種方法，20世紀70年代，綜合分子生物學和微生物遺傳學的最新技術——基因工程應運而生，這是處于分子水平的定向育種，它給生產(chǎn)實踐帶來了飛躍的發(fā)展。

4.雜交育種雜交育種一般指將兩個基因型不同的菌株通過接合使遺傳物質重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。雜交育種是選用已知性狀的供體菌株和受體菌株作為親本，把不同菌株的優(yōu)良性狀集中于重組體中。因此雜交育種具有定向育種的性質。雜交后的雜種不僅能克服原有菌種活力衰退的趨勢，而且，雜交育種使得遺傳物質重新組合，擴大了變異范圍，改變產(chǎn)品質量和產(chǎn)量。

第二節(jié)發(fā)酵設備及消毒滅菌一、發(fā)酵設備

發(fā)酵設備包括：（一）主發(fā)酵設備：種子罐和發(fā)酵罐（二）輔助設備：無菌空氣和培養(yǎng)基制備（三）發(fā)酵液預處理設備：（四）粗產(chǎn)品提取設備(五）產(chǎn)品精制與干燥設備（六）流出液回收、利用和處理設備（一）發(fā)酵罐的基本類型：1、

攪拌釜反應器（stirredtankreactor,STR)：包括罐體、攪拌器、擋板、冷卻裝置、軸封等部件。利用機械攪拌器的作用，使無菌空氣與發(fā)酵液充分混合，促進氧的溶解。2、鼓泡式反應器(bubblecolumn)：氣體由底部高壓引入，利用通氣中產(chǎn)生的上升的空氣泡使發(fā)酵液混合。3、氣升式反應器(airliftreactor)：內置擋板型和外置循環(huán)通道型，在通入空氣的一側由于液體密度降低使液面上升，這樣在反應器內形成液體環(huán)流，使培養(yǎng)基混合。（二）發(fā)酵輔助設備：主要包括：無菌空氣系統(tǒng)、滅菌系統(tǒng)、發(fā)酵車間管道和閥門發(fā)酵過程中所用的大量無菌空氣也是用過濾除菌法。傳統(tǒng)的過濾方式是深層過濾，所采用的過濾介質有棉花、玻璃纖維，活性炭，石棉濾板和活性炭纖維素等。深層過濾的除菌效果靠多種物理因素的共同作用來完成，這些因素主要包括沉降作用、擴散作用、慣性撞擊作用、攔截作用和靜電吸咐作用等。深層過濾所用的介質有著良好的過濾效果，在生產(chǎn)中已長期延用。但它們存在著使用壽命短、更換作業(yè)麻煩的缺點。為克服這些缺點并進一步降低工業(yè)使用成本，人們又開發(fā)了一些新的過濾介質，如燒結金屬板、燒結金屬管、燒結玻璃纖維，以及硝酸纖維酯、聚砜、聚四氟乙烯、尼龍微孔濾膜等。這些過濾介質具有與深層過濾相同的過濾除菌效果，且使用壽命較長，介質更換作業(yè)簡便，因而使用起來要方便得多。從大氣空間采集的空氣，在進過濾器之前，還要經(jīng)過一系列復雜的處理過程，以盡量除去其中的粉塵、油和水，從而確保進罐空氣的潔凈。二、培養(yǎng)基培養(yǎng)基是人工配制的適合于不同微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質。它是微生物的營養(yǎng)基礎，是合成代謝產(chǎn)物的物質來源。培養(yǎng)基成分和配比合適與否，對微生物生長發(fā)育、物質代謝、發(fā)酵產(chǎn)物的積累以及生產(chǎn)工藝等都有很大的影響。只有選用適宜的培養(yǎng)基成分和配方，才能充分發(fā)揮微生物合成代謝產(chǎn)物的能力．獲得良好的生產(chǎn)效果。一種良好培養(yǎng)基的確定，往往要經(jīng)過長期的反復的試驗，并不斷調整改進，逐漸趨于完善。同時，良好的培養(yǎng)基組成并不是一成不變的，應根據(jù)菌種特性、發(fā)酵條件和工藝的改變進行相應的調整、改善。除培養(yǎng)基組成外，還需考慮其他培養(yǎng)條件的控制，才能發(fā)揮其最大性能。

根據(jù)微生物對營養(yǎng)的要求，任何培養(yǎng)基都應具備微生物生長所需要的六大營養(yǎng)要素，即碳源、氮源、無機鹽、生長因子和水。在發(fā)酵過程中，為提高產(chǎn)物的量或減少雜質的生成，有時還添加前體、誘導物或抑制劑等成分。培養(yǎng)基配好后必須立即進行滅菌，否則會因雜菌生長而破壞其固有成分和性質。

1、碳源碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一。它可為微生物菌種的生長繁殖提供能源和合成菌體細胞所必需的碳成分，還為菌體合成目的產(chǎn)物提供所需的碳成分。常用的碳源主要有碳水化合物、脂類、有機酸和烴類。在某些特殊情況下(例如碳源貧乏等)，蛋白質及其降解物如氨基酸等也可以被某些微生物作為碳源。微生物的種類不同，利用不同碳源的能力也不同。例如，假單抱菌屑中的有些菌可以利用90種以上的含碳化合物；有的微生物利用碳源物質的能力極為有限，如某些甲基營養(yǎng)型細茵只能利用甲醇或甲烷生長。

（一）、培養(yǎng)基的成分及功能對于異養(yǎng)微生物來說，糖類是最廣泛使用的碳源。單糖，特別是葡萄糖極易被利用，幾乎所有的微生物都能利用葡萄糖，它可以由玉米淀粉、馬鈴薯淀粉經(jīng)酸或酶水解制得。葡萄糖可作為加速微生物生長的一種有效的糖，但是過多的葡萄糖會加重菌體的呼吸，以致培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而累積在菌體或培養(yǎng)基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等導致pH下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長和產(chǎn)物的合成。另外，有些葡萄糖的分解產(chǎn)物，雖然不導致pH下降，但它能阻遏或抑制某些產(chǎn)物合成所必需的酶的形成或酶的活性，即發(fā)生葡萄糖效應。蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等糖類物質等也是常用的碳源。2、氮源氮源主要用于構成菌體細胞物質，如氨基酸、蛋白質、核酸等和含氮的目的產(chǎn)物如青霉素、鏈霉素等抗生素。在特殊環(huán)境中，如有些厭氧菌在無氧和缺糖時，也可將氮源(氨基酸)當作能源用。氮源可分為有機氮源和無機氮源兩大類。常用的有機氮源有花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉(即玉米麩質粉)、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體等。它們在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌體吸收后再進一步分解代謝，最終用于合成菌體細胞物質和含氮的目的產(chǎn)物。

發(fā)酵工業(yè)中首選的一種氮源是黃豆餅粉，但由于黃豆的產(chǎn)地和加工方法不同，對發(fā)酵的影響也很大。如在紅霉素生產(chǎn)時應該用熱榨的黃豆餅粉，而在鏈霉素發(fā)酵時應該用冷榨的黃豆餅粉。黃豆的不同產(chǎn)地及其不同的加工方法不僅影響抗生素的發(fā)酵單位，還影響各組分的生物合成。

玉米漿是一種很容易被微生物利用的良好氮源。玉米漿中含有磷酸肌醇，對促進紅霉素、鏈霉素、青霉素和土霉素等品種的生產(chǎn)有積極作用。因玉米漿含有較多的有機酸，所以pH在4.0左右。由于玉米的來源和加工條件不同，玉米漿的成分常有較大的波動，在使用時應注意適當調配。

有機氮源除含有豐富的蛋白質、多肽和游離氨基酸外，往往還含有少量糖類、脂肪、無機鹽、維生素、某些生長因子和目的產(chǎn)物合成所需的調節(jié)物、前體等，因此能否選擇一種或幾種合適的有機氮源是工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基成功與否的關鍵。

常用的無機氮源有銨鹽(如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨)，硝酸鹽(如硝酸鈉、硝酸鉀)和氨水等。微生物對它們的吸收利用一般比有機氮源快，所以也稱為迅速利用的氮源。這類氮源在抗生素發(fā)酵工業(yè)中也會出現(xiàn)類似于葡萄糖效應的現(xiàn)象，即由于微生物快速吸收利用而使其代謝物阻遏或抑制了參與抗生素生物合成的有關酶的形成和活力，使抗生素產(chǎn)量大幅度下降。培養(yǎng)基中的無機氮源被微生物迅速利用后的另一個特點是常會引起pH的變化，如用(NH4)2SO4或NaNO3作為氮源時，被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質，這種經(jīng)微生物生理作用(代謝)后能形成酸性物質的無機氮源(如硫酸銨)稱為生理酸性物質；經(jīng)菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質的無機氮源(如硝酸鈉)稱為生理堿性物質。正確使用生理酸堿性物質，對穩(wěn)定和調節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。

氨水在發(fā)酵過程中常作為pH調節(jié)劑，它也是一種容易被利用的氮源，在許多抗生素發(fā)酵中都采用通氨工藝。在采用通氨工藝時應注意兩個問題：一是氨水堿性較強，為防止局部堿性過強，應多次小量加入，并在通氨時要加強攪拌；二是氨水中含有多種嗜堿性微生物，因此在使用前應用石棉等過濾介質進行除菌過濾，這樣可防止因通氨而引起的污染。

3、無機鹽

無機鹽為微生物生長提供必要的礦物質元素。這些元素參與酶的組成，激活酶活性，維持細胞結構的穩(wěn)定性，調節(jié)細胞滲透壓，控制細胞的氧化還原電位。無機鹽對微生物的生長發(fā)育相代謝產(chǎn)物的生物合成影響很大。在生產(chǎn)實踐中，應根據(jù)菌種的不同特性和發(fā)酵要求，合理選擇和使用無機鹽，發(fā)揮其在發(fā)酵過程中的重要作用。根據(jù)微生物對無機鹽的需求量，通常將無機鹽分為主要元素和微量元素兩類。主要元素如磷、硫、鉀、鎂、鈣、鈉等，所需濃度在10-3~10-4mol/L范圍內。凡所需濃度在10-6~10-8mol/L范圍內的元素，則稱為微量元素，如Cu、Zn、Mn、Mo和Co等。Fe介于主要元素和微量元素之間。這種區(qū)分帶有人為和相對性質，對不同的微生物來說，往往有很大差別。例如，G-細菌所需的Mg比G+細菌高10倍。微量元素需求量極少，因此，混雜在水或其他營養(yǎng)物中的極微數(shù)量就能滿足微生物的需要，無特殊原因，配制培養(yǎng)基時沒有必要另外加入。工業(yè)發(fā)酵中，常用的無機磷鹽有KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4，無機硫化物有MgSO4、FeSO4、MnSO4，鎂鹽有MgSO4，鉀鹽有KH2PO4、KNO3。4、生長因子

有些微生物即使在具有合適的水分、碳源、氮源、無機鹽等的條件下，還不能生長或生長不好，但如果加入少量酵母粉或動物肝臟的浸出液，則生長良好。這是由于酵母粉及動物肝臟中存在某些微生物生長所必需的有機物質，但其需要量不大，通常把這些特殊的營養(yǎng)物質稱為生長因子。生長因子根據(jù)其化學結構及代謝功能可分成三類，即維生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶。維生素是所發(fā)現(xiàn)的第一類生長因子，大多數(shù)維生素是輔酶的組成成分，例如煙酸經(jīng)胺化生成煙酰胺，煙酰胺是輔酶I(NAD)和輔酶Ⅱ(NADP)的組成成分；通過煙酰胺的氧化還原催化微生物的生物氧化作用。有些氨基酸是多種微生物的生長因子，這與它們缺乏合成這些氨基酸的酶有關。嘌呤和嘧啶也是許多微生物所需要的生長因子，它們的主要功能是構成核酸和輔酶。

5、水

水是微生物最基本的營養(yǎng)物質。首先，水是微生物細胞內主要組成成分，它在微生物細胞中含量達70％~90％，微生物生長必須有水。其次，微生物特別是單細胞微生物由于沒有特殊的攝食及排泄器官，它的營養(yǎng)物、代謝物、氧氣等必須溶解于水后才能通過細胞表面進行正常的活動。同時，細胞中的水直接參加代謝過程中的許多反應。此外，由于水的比熱大，傳熱快，能有效地吸收代謝過程中所釋放的熱量，使細胞內的溫度不致驟然升高，且有利于放熱，可以調節(jié)細胞的溫度和保持環(huán)境溫度的穩(wěn)定。由此可見，水的功能是多方面的，它為微生物生長繁殖和合成目的產(chǎn)物提供了必需的生理環(huán)境。

6、前體在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物直接利用來構成抗生素分子結構的一部分，而化合物本身的結構沒有大的變化，這些物質稱為抗生素的前體。前體最早是從青霉素生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的，在青霉素發(fā)酵培養(yǎng)時添加玉米漿后，青霉素可從20μ/ml增加到100μ/m1。進一步研究表明發(fā)酵單位增長的主要原因是玉米漿中含有苯乙胺，它能被優(yōu)先結合到青霉素分子中去，從而提高了青霉素G的產(chǎn)量。以后的有關青霉素生物合成的研究結果表明，青霉素合成的能力決定于其側鏈的合成，即側鏈的合成是整個青霉素生物合成過程中的限速步驟；另外發(fā)現(xiàn)加入不同的側鏈能夠得到一系列青霉素產(chǎn)物。因此，通過在基礎培養(yǎng)基中加入及中間補料苯乙酸的方法來制備青霉素G，加入苯氧乙酸來生產(chǎn)青霉素V。應該指出，很多前體物質如苯乙酸等濃度過高時對菌體會產(chǎn)生毒性，菌體還具有將前體氧化分解的能力。因此在生產(chǎn)中為了減少毒性和提高前體的利用率，常采用少量多次的流加工藝。

7、誘導物或刺激劑

所謂誘導物是指一些具有調節(jié)抗生素生物合成能力的小分子物質，當在微生物發(fā)酵過程中添加這些小分子物質后，能夠使那些缺乏這種物質而不能合成其目的產(chǎn)物的阻斷突變株恢復其生產(chǎn)能力，或是在生產(chǎn)菌株中添加這些物質后能大幅度提高其生產(chǎn)能力。如存在于酵母膏中的B因子(3’-磷酸丁酰-腺苷)可使利福霉素產(chǎn)生菌的生產(chǎn)能力成倍增長。近年來，在對微生物代謝調控的研究中還發(fā)現(xiàn)某些物質能夠刺激抗生素等次級代謝物的生物合成。如甲硫氨酸或亮氨酸對頭孢菌素C生物合成的刺激作用，巴比妥能促進鏈霉素生物合成等，推測其能誘導產(chǎn)生參與這些代謝產(chǎn)物生物合成的酶。

8、抑制劑在發(fā)酵過程中加入抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需的某種產(chǎn)物，或使正常代謝的中間產(chǎn)物積累起來。如在四環(huán)素發(fā)酵時，加入溴化物以減少金霉素的含量。生產(chǎn)利福霉素B時，加入二乙基巴比妥鹽可抑制其他利福霉素的生成。

（二）、培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基按其組成物質的來源可分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基，前者所用原料的化學成分明確、穩(wěn)定，但營養(yǎng)單一且價格昂貴，用這種培養(yǎng)基進行實驗重現(xiàn)性好、低泡、呈半透明，適用于研究菌種基本代謝和過程的物質變化，不適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)酵工業(yè)普遍使用天然培養(yǎng)基，它的原料是一些天然的動植物產(chǎn)品，如花生餅粉、酵母膏、蛋白胨等。天然培養(yǎng)基的特點是營養(yǎng)豐富，適合于微生物的生長繁殖和目的產(chǎn)物的合成。一般天然培養(yǎng)基中不需要另加微量元素、維生素等物質，且組成培養(yǎng)基的原料來源豐富，價格低廉，適用于工業(yè)生產(chǎn)。但由于天然培養(yǎng)基的組分復雜，不易重復，故若對原料質量等方面不加控制會嚴重影響生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

培養(yǎng)基按狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基比較適用于菌種的分離和保存。半固體培養(yǎng)基即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量瓊脂，一般用量為0.5％~0.8％，培養(yǎng)基即呈半固體狀態(tài)，主要用于鑒定菌種、觀察細菌運動特征及噬菌體的效價測定等。液體培養(yǎng)基中的80％～90％是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基，它有利于氧和物質的傳遞。

培養(yǎng)基按其用途一般可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用的固體培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質孢子并不易引起菌種發(fā)生變異。種子培養(yǎng)基一般指一、二級種子罐的培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基主要含有容易被利用的碳源、氮源、無機鹽等，使孢子很快發(fā)芽、生長以及大量繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯和使各種有關的初級代謝酶的活力提高。種子培養(yǎng)基要和發(fā)酵培養(yǎng)基相適應，成分不應相差太大，以避免進罐后的種子對新環(huán)境的適應時間延長。發(fā)酵培養(yǎng)基可供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物。它既要使種子接種后能迅速生長達到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成所需的產(chǎn)物，因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進劑等。由于各種培養(yǎng)基的用途不同，其培養(yǎng)基的組成差異也很大。

（三）、發(fā)酵設備及培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌方可使用，目前大多數(shù)生產(chǎn)用培養(yǎng)基均采用高壓蒸汽滅菌法，如操作控制不當，滅菌時溫度偏高，受熱時間過長，則營養(yǎng)成分會受到一定程度的破壞。影響這種方法有效程度的因素主要有：待殺滅微生物的種類、待滅培養(yǎng)基的組成、pH值、以及培養(yǎng)基中顆粒成分的粒度。一般來說，生物的營養(yǎng)體在較低溫度下很快就可殺滅；而要殺死微生物的泡子，則需要至少121℃的高溫。在所有的微生物孢子中，因熱脂肪芽孢桿菌的孢子對熱的耐受性最強，因此，人們常常用它作為檢驗滅菌是否徹底的指標。表4給出了濕熱滅菌法殺死某些微生物所需的滅菌時間和溫度。不同微生物的滅菌時間和溫度

常用的加熱滅菌方式有高溫蒸汽濕熱滅菌法和干熱滅菌法。濕熱滅菌比干熱滅菌更為有效，因蒸汽在冷凝時要釋放大量的潛能，且蒸汽有強大的穿透力，易于傳熱，用蒸汽將物料升溫至115~140℃保持一定時間，可殺死各種微生物。這種方法普遍被用來對培養(yǎng)基和設備容器進行滅菌。干熱滅菌的效果不如濕熱滅菌，它只適用于工業(yè)要求為滅菌后能保持干燥狀態(tài)的物料滅菌。實驗室規(guī)模的玻璃器皿等器具常采用干熱滅菌。一般采用干熱滅菌的條件是160℃，120min。

目前在工業(yè)生產(chǎn)上通常采用的蒸汽滅菌法，包括實罐滅菌(實消)、空罐滅菌(空消)、連續(xù)滅菌(連消)及附屬設備滅菌。

1、實罐滅菌(實消)實消是將配制好的培養(yǎng)基投入發(fā)酵罐中，同時開動攪拌器，通入高溫蒸汽進行滅菌。實消的溫度一般為121℃，滅菌時間則視培養(yǎng)基組成、罐容積而定，一般在30~60分鐘之間。在滅菌過程中，應讓高溫蒸汽通過所有與發(fā)酵罐相連的管道、接口、閥門相電極，以避免在這些部位留下死角而引起雜菌污染。

實消又分直接加熱和間接加熱兩種形式。間接加熱是使高溫蒸汽通過發(fā)酵罐的夾層或內部蛇管，與培養(yǎng)基發(fā)生熱交換；而直接加熱則是使經(jīng)純化處理、不合雜質的高溫蒸汽通入培養(yǎng)基中，使其溫度在短時間內升至要求的溫度。在蒸汽與培養(yǎng)基直接接觸時，有一部分蒸汽要冷凝成水，從而使培養(yǎng)基稀釋，因而在配制培養(yǎng)基時應預先扣除這部分冷凝水。

2、空罐滅菌空罐滅菌即發(fā)酵罐罐體的滅菌。空罐滅菌一般維持罐壓1.5×105～2.0×105Pa、罐溫125~130℃、時間30～45min。滅菌時要求總蒸汽壓力不低于3.0×105～3.5×105Pa。滅菌后為避免罐壓急速下降造成負壓，要等到經(jīng)過連續(xù)滅菌的無菌培養(yǎng)基輸入罐內后，才可以開冷卻水冷卻。

3、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌將配好的培養(yǎng)基在高溫快速的情況下，向發(fā)酵罐輸送的同時經(jīng)過加溫、保溫、冷卻等過程，進行滅菌的方法。其操作步驟大致可分為：（1）培養(yǎng)基預熱：將料液預熱到60～75℃，避免連續(xù)滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲。（2）連續(xù)滅菌：連續(xù)滅菌是在連消塔中完成的。連消塔的主要作用是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混合，并使料液溫度很快升高到滅菌溫度。連續(xù)滅菌的溫度一般以126~132℃為宜，（3）維持滅菌溫度：由于連消塔加熱時間較短，光靠這短時間的滅菌是不夠的。因此，利用維持罐使料液在滅菌溫度下保持5~7min，以達到滅菌的目的。維持罐的罐壓一般維持在4×105Pa左右。（4）冷卻：生產(chǎn)上一般采用冷水噴淋冷卻，即用冷水在排管外從上向下噴淋，使管內料液逐漸冷卻。一般料液冷卻到40～50℃后，輸送到預先空消過的罐內。在冷水噴淋前，冷卻管內應充滿填料。連續(xù)滅菌的時間短、溫度較高，培養(yǎng)基受到的破壞較少，故質量較好。連續(xù)滅菌時蒸汽負荷均衡一致，但不足之處是所需設備較多，操作較麻煩，染菌的機會也相應增多。4、發(fā)酵附屬設備及管路的滅菌發(fā)酵附屬設備有總空氣過濾器、管道、計量罐、補料罐等。糖水罐滅菌時罐壓為1×105Pa、時間為30min；油罐(消沫劑罐)滅菌的蒸汽壓力為1.5×105～1.8×105Pa、時間為60min?？偪諝膺^濾器滅菌時，先關閉總進氣和出氣閥門，開啟放氣閥門，使總空氣過濾器內的壓力降到零(表壓)。滅菌時的蒸汽壓力為3.5×105Pa左右，蒸汽自上端輸入，上下放氣口同時放汽，總過濾器內壓控制為1.5×105~2.0×105Pa(表壓)，滅菌時間為2h。滅菌完畢，自上端輸入空氣，自上而下吹干過濾介質。管道滅菌的蒸汽壓力不應低于3.4×105Pa(表壓)，滅菌時間為1h。新安裝的管道或長期未使用的管道滅菌時間可適當延長到1.5h。滅菌后以無菌空氣保壓，自然冷卻30min即可交付使用。第三節(jié)發(fā)酵過程的控制一、發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)（一）物理參數(shù)1．溫度（℃）：指發(fā)酵整個過程或不同階段所維持的溫度。它的高低與發(fā)酵中的酶反應速率，氧在培養(yǎng)液中的溶解度和傳遞速率、菌體生長速率和產(chǎn)物結合速率等有密切關系。2．壓力（Pa）：這是發(fā)酵過程中發(fā)酵罐維持的壓力。罐內維持正壓可以防止外界空氣中的雜菌侵入而避免污染，以保證純種培養(yǎng)。同時罐壓的高低還與O2與CO2在培養(yǎng)液中的溶解度有關，間接影響菌體代謝。罐壓一般維持在0.2×105~0.5×105Pa。3．攪拌轉速（r/min）：指攪拌器在發(fā)酵過程中的轉動速度，通常以每1min的轉速來表示，它的大小與氧容量傳遞速率與發(fā)酵液的均勻性有關。4．攪拌功率（kW）：指攪拌器攪拌時所消耗的功率，常指每1m3發(fā)酵液所消耗的功率（kW/m3）。

5．空氣流量（V/V·min）：空氣流量是每1min內每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積，也是需氧發(fā)酵的控制參數(shù)。它的大小與氧的傳遞和其他控制參數(shù)有關。一般控制在0.5~1.0V/V·min范圍內。6．黏度（Pa·s）：黏度大小可以作為細胞生長或細胞形態(tài)的一項標志，也能反映發(fā)酵罐中菌絲分裂過程的情況。它的大小可改變氧傳遞的阻力，又可表示相對菌體濃度。7．濁度（%）：濁度能及時反應單細胞生長狀況，對某些產(chǎn)品的生產(chǎn)是極其重要的。8．料液流量（L/min）：這是控制流體進料的參數(shù)。

（二）化學參數(shù)生產(chǎn)或科研中所采用的化學參數(shù)有下列幾個：1．pH（酸堿度）：發(fā)酵液的pH是發(fā)酵過程中各種產(chǎn)酸和產(chǎn)堿的生化反應的綜合結果。它是發(fā)酵工藝控制的重要參數(shù)之一。它的高低與菌體生長和產(chǎn)物合成有重要的關系。2．基質濃度（g或mg%）：指發(fā)酵液中糖、氮、磷等重要營養(yǎng)物質的濃度。它的變化對產(chǎn)生菌的生長和產(chǎn)物的合成有重要的影響，也是提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要控制手段。因此，在發(fā)酵過程中，必須定時測定糖（還原糖和總糖）、氮（氨基氮和銨鹽）等基質的濃度。3．溶解氧濃度[10-6（ppm）或飽和度（%）]：溶解氧是需氧菌發(fā)酵的必備條件。氧是微生物體內的一系列經(jīng)細胞色素氧化酶催化產(chǎn)能反應的最終電子受體，也是合成某些代謝產(chǎn)物的基質，所以，對溶氧濃度大小的影響是多方面的。利用溶氧濃度的變化，可了解產(chǎn)生菌對氧利用的規(guī)律，反映發(fā)酵的異常情況，也可作為發(fā)酵中間控制的參數(shù)及設備供氧能力的指標。溶氧濃度一般用絕對含量（10-6）來表示，有時也用在相同條件下，氧在培養(yǎng)液中飽和度的百分數(shù)（%）來表示。4．氧化還原電位（mV）：培養(yǎng)基的氧化還原電位是影響微生物生長及其生化活性的因素之一。對各種微生物而言，培養(yǎng)基最適宜的與所允許的最大電位值，應與微生物本身的種類和生理狀態(tài)有關。氧化還原電位常作為控制發(fā)酵過程的參數(shù)之一，特別是某些氨基酸發(fā)酵是在限氧條件下進行的，氧電極已不能精確的使用，這時用氧化還原參數(shù)控制則較為理想。5．產(chǎn)物的濃度（μg（u）/ml）：這是發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量高低或合成代謝正常與否的重要參數(shù)，也是決定發(fā)酵周期長短的根據(jù)。6．廢氣中的氧濃度（Pa）：廢氣中的氧含量與產(chǎn)生菌的攝氧率有關。7．廢氣中的CO2濃度（%）：測定廢氣中的CO2可以算出產(chǎn)生菌的呼吸熵，從而了解產(chǎn)生菌的呼吸代謝規(guī)律。（呼吸熵=呼出CO2的體積÷消耗的O2的體積，呼吸熵的不同將顯示哪種養(yǎng)分被作為主要的供能物質.）

（二）生物參數(shù)生產(chǎn)上采用的生物參數(shù)主要有：1．菌絲形態(tài)：絲狀菌發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)的改變是生化代謝變化的反映。一般都以菌絲形態(tài)作為衡量種子質量、區(qū)分發(fā)酵階段、控制發(fā)酵過程的代謝變化和決定發(fā)酵周期的依據(jù)之一。2．菌體濃度：菌體濃度是控制微生物發(fā)酵的重要參數(shù)之一，特別是對抗生素次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵。它的大小和變化速度對菌體的生化反應都有影響，因此測定菌體濃度具有重要意義。菌體濃度與培養(yǎng)基的表觀黏度有關，間接影響發(fā)酵液的溶氧濃度。在生產(chǎn)上，常根據(jù)菌體濃度來決定適合補料量和供氧量，以保證生產(chǎn)達到預期的水平。

二、液體深層發(fā)酵的操作方式（一）分批發(fā)酵

分批培養(yǎng)是指在一封閉培養(yǎng)系統(tǒng)內含有初始限制量的基質的發(fā)酵方法。發(fā)酵過程從移種開始，要經(jīng)過四個期：即遲滯期（也稱遲緩期）、對數(shù)生長期、減速期（也稱衰減期）和穩(wěn)定期（也稱靜止期）。1．遲滯期：從圖示曲線來看，在接種后，這是一個不生長期。其實，這段過程是菌體從一個環(huán)境轉到另一個環(huán)境的適應過程，因此可把這段不生長期稱為適應期。遲滯期的長短與三方面的因素有關，一是新的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件與舊的越接近，則一般遲滯期越短；二是種子的質量，一般移種對數(shù)生長期的細胞比移種其他生長期的細胞遲滯期短；三與接種量有關，接種量大，遲滯期要相對短些。對于工業(yè)生產(chǎn)來說，遲滯期越短越好。2．對數(shù)生長期：在這個分期中，細胞的生長率逐漸加大，達到最大生長率，此時將菌體濃度的自然對數(shù)與時間作圖可得一直線。處于對數(shù)生長期的微生物其各種酶系的活力最強，因此工業(yè)生產(chǎn)中，常以此作為種子移入新環(huán)境中以縮短發(fā)酵過程中的遲滯期。3．減速期和穩(wěn)定期：在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物逐步耗盡，微生物生長速度變慢（進入減速期），直至停止（進入穩(wěn)定期）。由于這一時期菌體代謝十分活躍，有許多次級代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物在此期合成，因此也被稱為生產(chǎn)期或分化期。

（二）補料分批發(fā)酵

補料分批發(fā)酵是指在分批培養(yǎng)過程中，連續(xù)地或間歇地補加培養(yǎng)基（或某一營養(yǎng)成分），而不從發(fā)酵罐中間斷地放出培養(yǎng)液。發(fā)酵過程中采用補料分批培養(yǎng)技術的優(yōu)越性有：1.可使底物的殘留濃度保持在較低的水平，以免微生物受到這些底物的調節(jié)作用。2.能夠增加微生物細胞的合成能力。因為通過補料工藝能夠不斷地提供足夠的養(yǎng)料用于合成微生物細胞。3.能夠提高非生長偶聯(lián)型產(chǎn)物（如抗生素等次級代謝產(chǎn)物）的合成量。因為通過補料工藝可在微生物生長期和產(chǎn)物合成期提供不同質和不同量的養(yǎng)分用于微生物生長和產(chǎn)物合成。4.可以解除快速利用底物而造成的阻遏效應。5.能夠降低發(fā)酵液的黏度，提高溶解氧的濃度。6.可以防止培養(yǎng)基中某一組分的毒性。

（三）半連續(xù)發(fā)酵

在補料分批發(fā)酵的基礎上，加上間隙放掉部分發(fā)酵液進入下游提取工段的發(fā)酵操作方式稱為半連續(xù)發(fā)酵（Semi-continuousfermentation)。

優(yōu)點：半連續(xù)發(fā)酵不僅可以補充養(yǎng)分和前體，而且有害物質被稀釋，有利于產(chǎn)物的繼續(xù)合成。

缺點：（1）放掉發(fā)酵液的同時會損失未被利用的營養(yǎng)物質和正處于代謝活躍狀態(tài)的菌體細胞；（2）中間補料會造成發(fā)酵液稀釋，增加下游提取液的體積；（3）發(fā)酵液中一些由代謝產(chǎn)生的前體有可能會丟失，造成發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量下降；（4）染菌問題。（四）連續(xù)發(fā)酵

所謂連續(xù)發(fā)酵是指培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時放出含有產(chǎn)品的發(fā)酵液的過程。與分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵相比，連續(xù)發(fā)酵具有以下三個優(yōu)點：1.能維持較低的基質濃度，有利于產(chǎn)物形成。2.可以提高設備利用率和單位時間的產(chǎn)量，節(jié)省發(fā)酵罐的非生產(chǎn)時間。3.由于發(fā)酵罐內微生物、基質、產(chǎn)物和溶解氧濃度等各種參數(shù)維持在一定水平，故便于自動化控制。盡管連續(xù)發(fā)酵有如此多的優(yōu)點，但在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)上尚未得到廣泛應用，其關鍵因素是由于長時間的連續(xù)培養(yǎng)難以保證純種培養(yǎng)，且菌種發(fā)生變異的可能性較大。

三、發(fā)酵過程中幾個重要參數(shù)的影響及其控制

（一）溫度對發(fā)酵過程的影響及其控制微生物生長、維持及產(chǎn)物的生物合成都是在一系列酶催化下進行的，溫度是保證酶活性的重要條件。不同的微生物菌種的最適生長溫度和產(chǎn)物形成的最適溫度都是不同的。在發(fā)酵過程中，隨著菌體對培養(yǎng)基的利用以及機械攪拌的作用，將產(chǎn)生一定的熱量。同時因罐避散熱、水分蒸發(fā)等也帶走部分熱量，因此可用發(fā)酵熱代表整個發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量：Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q顯-Q輻射1．生物熱（Q生物）：產(chǎn)生菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的熱量，叫做生物熱。生物熱的大小隨菌種和培養(yǎng)基成分不同而變化。

2．攪拌熱（Q攪拌）：攪拌器轉動引起的液體之間和液體與設備之間的摩擦所產(chǎn)生的熱量，即攪拌熱。3．蒸發(fā)熱（Q蒸發(fā)）：空氣進入發(fā)酵罐與發(fā)酵液廣泛接觸后，引起水分蒸發(fā)所需的熱能，即為蒸發(fā)熱。水的蒸發(fā)熱和廢氣因溫度差異所帶的部分顯熱（Q顯）一起都散失到外界。由于進入的空氣和濕度是隨外界的氣候和控制條件而變化，所以蒸發(fā)熱和顯熱是變化的。4．輻射熱（Q輻射）：由于罐外壁和大氣間的溫度差異而使發(fā)酵液中的部分熱能通過罐體向大氣輻射的熱量，即為輻射熱。輻射熱的大小取決于罐內溫度與外界氣溫的差值。

最適發(fā)酵溫度隨菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長階段而改變，理論上，在整個發(fā)酵過程中不應只選一個培養(yǎng)溫度，而應根據(jù)培養(yǎng)的不同階段調整溫度，以達到最佳效果。有試驗報導青霉素發(fā)酵時，起初5h維持在30℃，然后降至25℃培養(yǎng)35h，再降到20℃培養(yǎng)85h，最后又提高到25℃培養(yǎng)40h，放罐，青霉素產(chǎn)量可比在25℃恒溫培養(yǎng)提高50%以上。然而在工業(yè)發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵液的體積很大，升降溫度都比較困難，所以在整個發(fā)酵過程中，往往采用一個比較適合的培養(yǎng)溫度，使得到的產(chǎn)物產(chǎn)量最高，或者在可能條件下進行適當?shù)恼{整。

（二）pH的影響及其控制

發(fā)酵培養(yǎng)基的pH對微生物生長具有非常明顯的影響，也是影響發(fā)酵過程中各種酶活的重要因素。微生物生長都有最適pH范圍及其變化的上下限，超出此上下限，菌體將無法忍受而自溶。pH對產(chǎn)物的合成也有明顯的影響。合適的pH根據(jù)試驗結果來確定的。在發(fā)酵過程中，首先考慮和試驗發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎配方，采用適當?shù)呐浔?，使發(fā)酵過程中pH變化在合適的范圍內。因為培養(yǎng)基中含有代謝產(chǎn)酸（如葡萄糖、硫酸銨等）和代謝產(chǎn)堿（如硝酸鈉、尿素等）物質以及緩沖劑（如碳酸鈣等），它們在發(fā)酵過程中要影響pH的變化。在分批發(fā)酵中，常采用這種方法來控制pH的變化。然而利用上述方法調節(jié)pH的能力是有限的，如果達不到要求，就可在發(fā)酵過程中直接補加酸或堿和補料的方式來控制。

（三）溶氧的影響及其控制

溶氧是需氧發(fā)酵控制的最重要參數(shù)之一。氧在水中的溶解度很小，所以需要不斷通氣和攪拌，才能滿足溶氧的要求。溶氧的多少對菌體生長和產(chǎn)物的性質及產(chǎn)量都會產(chǎn)生不同的影響。溶氧高雖然有利于菌體生長，但溶氧太大有時反而會抑制產(chǎn)物的形成。在已有設備和正常的發(fā)酵條件下，每種產(chǎn)物發(fā)酵過程中溶氧的變化都有自己的規(guī)律，并與菌體自身的繁殖和代謝密切相關。有時會出現(xiàn)溶氧濃度明顯降低或明顯升高的異常變化，常見的是溶氧下降，這可能有下列幾種原因：1.污染了好氣性雜菌，大量的溶氧被消耗；2.菌體代謝發(fā)生異?，F(xiàn)象，需氧要求增加，使溶氧下降；3.某些設備或工藝控制發(fā)生故障或變化，如攪拌功率消耗變小或攪拌速度下降等，也可能引起溶氧的下降。因此，從發(fā)酵液中溶解氧的濃度的變化，可了解微生物生長代謝是否正常，工藝控制是否合理，設備供氧能力是否充足等問題，幫助我們查找不正常的原因和控制好發(fā)酵生產(chǎn)。

（四）二氧化碳的影響及其控制

CO2是微生物生長繁殖過程中的代謝產(chǎn)物，也是某些合成代謝的基質，對微生物生長和發(fā)酵具有刺激或抑制作用。CO2還能使發(fā)酵液的pH下降，或與其它物質如生長所必須的金屬離子形成碳酸鹽沉淀等，造成間接作用而影響菌的生長代謝和產(chǎn)物的合成。CO2在發(fā)酵液中的濃度不像溶氧那樣，它的變化沒有一定的規(guī)律。它的大小受到許多因素的影響，如菌體的呼吸強度、發(fā)酵液流變學特性、通氣攪拌程度和外界壓力大小等因素。設備規(guī)模大小也有影響，由于CO2的溶解度隨壓力增加而增大，大發(fā)酵罐中發(fā)酵液的靜壓較大，尤其在罐的底部，CO2濃度較大，形成碳酸，進而影響菌體的呼吸和產(chǎn)物的合成。在發(fā)酵過程中，如遇到泡沫上升而引起“逃液”時，采用增加罐壓的方法來消泡，也會增加CO2的溶解度，對菌體產(chǎn)生不利的影響。CO2濃度的控制可通過通氣攪拌來控制，對其形成的碳酸，可用堿來中和，罐壓的調節(jié)，也影響CO2的濃度。

（五）泡沫的影響及其控制

在大多數(shù)微生物發(fā)酵過程中，由于培養(yǎng)基中有蛋白質類表面活性劑存在，在通氣條件下，培養(yǎng)液中就形成了泡沫。起泡會帶來許多不利因素，如發(fā)酵罐的裝料系數(shù)減小，氧傳遞系數(shù)減小等。泡沫過多時，影響更為嚴重，可能會造成大量逃液，發(fā)酵液從排氣管路或軸封逃出而增加染菌機會等，嚴重時通氣攪拌也無法進行，菌體呼吸受到阻礙，導致代謝異?；蚓w自溶。所以，控制泡沫乃是正常發(fā)酵的基本條件。

泡沫的控制，可采用調整培養(yǎng)基成分、改變某些物理化學參數(shù)或者改變發(fā)酵工藝來控制，但這些方法的效果有一定限度。另外就是采用消沫的方法，這是公認的比較好的方法。消沫可采用機械消沫和消沫劑消沫兩大類方法：機械消沫是利用機械強烈振動或壓力變化而使泡沫破裂，常用在罐內，靠消沫漿轉動打碎泡沫。該法的優(yōu)點是節(jié)省原料，染菌機會小，但消沫效果不理想，僅可作為消沫的輔助方法；

另一種消沫的方法是采用外加消沫劑，使泡沫破裂。常用的消沫劑主要有天然油脂類，高碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類，硅酮類等，其中以天然油脂類和聚醚類在微生物發(fā)酵中最為常用。天然油脂中有豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和豬油等。油不僅可用作消沫劑，還可作為碳源和發(fā)酵控制的手段。它們的消沫能力和對產(chǎn)物合成的影響也不相同。油脂的質量和新鮮程度對發(fā)酵及消沫也有影響。聚醚類消沫劑的品種很多，它們是氧化丙烯或氧化丙烯和環(huán)氧乙烷與甘油聚合而成的聚合物。氧化丙烯和甘油聚合而成的，叫聚氧丙烯甘油（簡稱GP型），氧化丙烯、環(huán)氧乙烷和甘油聚合而成的叫做聚氧乙烯氧丙烯甘油（簡稱GPE型），又稱泡敵。GP型親水性差，在發(fā)泡介質中的溶解度小，消泡能力相當于豆油的60~80倍；GPE型親水性好，在發(fā)泡介質中易鋪展，消沫能力強，作用快，通常用量為0.03%~0.035%，消沫能力一般相當于豆油的10~20倍。消沫劑的使用應結合生產(chǎn)實際加以選擇。

（六）發(fā)酵終點的判斷微生物發(fā)酵終點的判斷，對提高產(chǎn)物的生產(chǎn)能力和經(jīng)濟效益是很重要的。不同類型的發(fā)酵，要求達到的目標不同，因而對發(fā)酵終點的判斷標準也有所不同。一般對發(fā)酵及原料成本占整個生產(chǎn)成本主要部分的發(fā)酵品種，主要追求提高生產(chǎn)率[kg/（m3·h）]，得率（kg產(chǎn)物/kg基質）和發(fā)酵系數(shù)[kg產(chǎn)物/（罐容積m3·發(fā)酵周期h）]。如果下游工程提取精制成本占主要部分，且產(chǎn)品的價格較貴，則除了要求較高產(chǎn)率和發(fā)酵系數(shù)外還要求高的產(chǎn)物濃度。

要確定一個合理的放罐時間，須考慮下列幾個因素：1．經(jīng)濟因素：發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)能力是實際發(fā)酵時間和發(fā)酵準備時間的綜合反應。實際發(fā)酵時間要以最低的成本來獲得最大生產(chǎn)能力的時間為最適發(fā)酵時間。2．產(chǎn)品質量因素：發(fā)酵時間長短對后續(xù)工藝和產(chǎn)品質量有很大的影響，如果發(fā)酵時間太短，勢必有過多的尚未代謝的營養(yǎng)物質殘留在發(fā)酵液中；時間太長，菌體會自溶，釋放出菌體蛋白或體內的酶，又會顯著改變發(fā)酵液的性質，甚至使產(chǎn)物遭到破壞。這些都會影響到后續(xù)分離純化以及產(chǎn)物的收得率和質量。3．特殊因素：在個別特殊發(fā)酵的情況下，還要考慮個別因素。對老品種的發(fā)酵來說，放罐時間都已掌握，在正常情況下可根據(jù)作業(yè)計劃。但在異常情況下，如染菌、代謝異常（糖耗緩慢等），就應根據(jù)不同情況，進行適當處理，適當提前或拖后放罐時間。合理的放罐時間是由實驗來確定的，就是根據(jù)不同的發(fā)酵時間所得的產(chǎn)物產(chǎn)量計算出的發(fā)酵罐生產(chǎn)力和產(chǎn)品成本，采用生產(chǎn)力高而成本又低的時間，作為放罐時間。

四、固體發(fā)酵由于生長所需水分少，可以利用疏松而含有必需營養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基進行發(fā)酵生產(chǎn)，稱為固體發(fā)酵。固體發(fā)酵一般采用開放式方法進行培養(yǎng)，無菌要求不高，不是純培養(yǎng)。其過程是：將原料預加工處理后再經(jīng)蒸煮滅菌，然后制成含一定水分的固體物料，接入預先培養(yǎng)好的菌種，進行發(fā)酵。固體發(fā)酵具有投資省、工藝簡單、能耗低等優(yōu)點，最適宜用來加工酒精、味精濃縮液。固體發(fā)酵產(chǎn)品活性蛋白是優(yōu)質的蛋白飼料，附加值高。采用濃縮――固體發(fā)酵酒精味精廢水不僅根治了污染，開發(fā)了蛋白飼料資源，并提高了企業(yè)利潤。

第四節(jié)、發(fā)酵產(chǎn)品與代謝調控一、微生物工程產(chǎn)品的主要類型1、微生物菌體許多微生物菌體在醫(yī)藥、食品及化學工業(yè)中具有重要用途。如酵母菌用于治療消化不良、雙歧桿菌用于治療腹瀉等。某些微生物細胞內酶系具有催化羥基化、羧基化、加成、縮合、脫氫、氧化及還原等反應能力，可用于生產(chǎn)多種藥物和化工產(chǎn)品。如用酵母細胞生產(chǎn)果糖-1，6-二磷酸；黃色短桿菌轉化富馬酸生產(chǎn)L-蘋果酸等2、初級代謝產(chǎn)物

微生物代謝過程中所形成的為自身生長繁殖所必需的營養(yǎng)物質為初級代謝產(chǎn)物。許多種藥品屬于初級代謝產(chǎn)物，如氨基酸、核苷酸、糖類中間代謝物、有機酸、及維生素等。多種化工產(chǎn)品如乙醇、丙酮、丁醇等也屬于初級代謝產(chǎn)物。3、次級代謝產(chǎn)物次級代謝產(chǎn)物是指微生物代謝過程中所產(chǎn)生的其自身生長繁殖所不需要的物質。這類物質主要有：多種抗生素產(chǎn)品、甾體激素類藥品、酶抑制劑、毒素等。4、生物活性大分子

微生物細胞代謝過程中所產(chǎn)生的生物活性大分子有酶類、活性蛋白、蛋白類激素、核酸、多糖等。如天門冬酰胺酶、透明質酸、右旋糖酐等。二、代謝調控初級和次級代謝產(chǎn)物合成的調控可分為兩種：1、控制培養(yǎng)和發(fā)酵條件（1）使用誘導物許多與蛋白質、糖類、和其它物質降解有關的水解酶以及某些次生代謝產(chǎn)物合成代謝相關的酶是誘導酶，增加誘導劑可以增加酶表達量。如苯乙酸可以誘導青霉素酰化酶；甾體底物可以誘導甾體羥化反應的羥化酶。（2）改變細胞通透性使用細胞通透劑可以減少代謝產(chǎn)物的胞內濃度，避免末端產(chǎn)物的反饋抑制。（3）添加生物合成前體如在產(chǎn)黃青霉發(fā)酵液中加入苯乙酸可以增加青霉素的總產(chǎn)量和青霉素G的含量。（4）解除末端產(chǎn)物反饋抑制作用產(chǎn)物分離偶聯(lián)技術使用發(fā)酵與產(chǎn)物分離偶聯(lián)技術，能及時移去發(fā)酵液中的代謝物，解除末端產(chǎn)物反饋抑制作用，提高發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。（5)解除分解代謝物阻遏如乳糖作為青霉素發(fā)酵的碳源優(yōu)于葡萄糖，原因是乳糖被緩慢水解成單糖的速度，正好符合青霉素生產(chǎn)期合成青霉素的需要，而不會產(chǎn)生高濃度的分解代謝物來抑制青霉素的合成。2、誘變選育突變株，控制代謝途徑（1）營養(yǎng)缺陷型突變株的應用選育喪失合成途徑中的某一酶的突變株，代謝過程不能進行到底，末端產(chǎn)物不能合成，發(fā)酵時加入少量缺失酶的產(chǎn)物，這樣可以解除反饋抑制。（2）抗代謝類似物突變株的應用抗賴氨酸類似物(S-(2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC）、γ-甲基賴氨酸（ML））突變株可以解除蘇氨酸和賴氨酸對天門冬氨酸激酶（AK）的反饋抑制作用。（3）抗生素抗性突變株的應用如衣霉素可以抑制細胞膜蛋白的生物合成，改變細胞的分泌機制，有助于胞內物質分泌到細胞外。枯草桿菌的衣霉素抗性突變株的α-淀粉酶的產(chǎn)量較親株提高了5倍。二、代謝工程代謝工程是指利用多基因重組技術有目的地對細胞代謝途徑進行修飾、改造，改變細胞特性，并與細胞基因調控、代謝調控及生化工程相結合，為實現(xiàn)構建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個新的學科領域。代謝工程的目的在于構建具有新的代謝途徑、能生產(chǎn)特定的目的產(chǎn)物或具有過量生產(chǎn)能力的工程菌，用于工業(yè)生產(chǎn)。主要分為以下三個方面：（一）改變代謝流：指改變分支代謝途徑的流向，阻斷有害代謝產(chǎn)物的合成，以達到提高產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。（二）擴展代謝途徑：指在引入外源基因后，使原來的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物，或使原來的代謝途徑向前延伸，可以利用新的原料合成代謝末端產(chǎn)物。

（三）構建新的代謝途徑：指將催化一系列生物反應的多個酶基因克隆到不能產(chǎn)生某種產(chǎn)物的微生物中，使之獲得產(chǎn)生新化合物的能力；或利用基因工程手段，克隆少數(shù)基因，是細胞中原來無關的代謝途徑連接起來，形成新的代謝途徑，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物；或將催化某一代謝突進的基因組克隆到另一位生物中，使之發(fā)生代謝轉移，產(chǎn)生目的產(chǎn)物。第五節(jié)、發(fā)酵工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應用1、抗生素類抗生素是一類由微生物產(chǎn)生的在低濃度下具有抑制或殺死其他微生物作用的化學物質。繼Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素后，最杰出的抗生素先驅是美國放線菌專家Waksman，他與同事在1941年從放線菌培養(yǎng)液中找到紫放線菌素。接著他又在1944年發(fā)現(xiàn)了第一個用于臨床的從放線菌產(chǎn)生的抗生素——鏈霉素。由于Waksman開拓了尋找新抗生素來源的途徑，使人們在僅10年左右的時間內相繼發(fā)現(xiàn)了眾多的抗生素：如1947年找到第一個廣譜抗生素——氯霉素和由細菌產(chǎn)生的多粘菌素；1948年發(fā)現(xiàn)了金霉素；1949年發(fā)現(xiàn)了新霉素；1950年發(fā)現(xiàn)了制霉菌素和土霉素；1952年發(fā)現(xiàn)了紅霉素；1953年發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素等。到目前為止，世界上已篩選出的抗生素已達9000種以上，應用于臨床治療的在百余種左右（不包括半合成抗生素）。

抗生素的種類繁多，性質復雜，用途又是多方面的，一般以生物來源、作用對象、作用機制、化學結構、生物合成途徑作為分類依據(jù)

分類方法

種類

舉例

根據(jù)生物來源

1．由放線菌產(chǎn)生的抗生素

鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素

2．由真菌產(chǎn)生的抗生素

青霉素、頭孢菌素

3．由細菌產(chǎn)生的抗生素

多粘菌素、桿菌肽

4．由植物及動物產(chǎn)生的抗生素

地衣酸、綠藻素、蒜素

分類方法種類舉例根據(jù)抗生素的作用對象1．