第十章吸光光度法

第十章吸光光度法

特點(diǎn)靈敏度高：測(cè)定下限可達(dá)10-5～10-6mol·L-1,10-4%～10-5%

準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分的測(cè)定要求：相對(duì)誤差2～5％（1～2％）操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用廣泛

吸光光度法是基于被測(cè)物質(zhì)的分子對(duì)光具有選擇性吸收的特性而建立起來(lái)的分析方法。第一節(jié)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收一、光的基本性質(zhì)光的波粒二象性波動(dòng)性粒子性E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光電效應(yīng)E：光子的能量（J,

焦耳）：光子的頻率（Hz,赫茲）

：光子的波長(zhǎng)（cm）c：光速（2.99791010cm.s-1）h：Plank常數(shù)（6.625610-34J.s

焦耳.秒）結(jié)論:一定波長(zhǎng)的光具有一定的能量，波長(zhǎng)越長(zhǎng)(頻率越低)，光量子的能量越低。光的電磁波性質(zhì)射線x射線紫外光紅外光微波無(wú)線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見(jiàn)光單色光、復(fù)合光、光的互補(bǔ)單色光復(fù)合光光的互補(bǔ)單一波長(zhǎng)的光由不同波長(zhǎng)的光組合而成的光若兩種不同顏色的單色光按一定的強(qiáng)度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補(bǔ)色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補(bǔ)。藍(lán)黃紫紅綠紫黃綠綠藍(lán)橙紅藍(lán)綠二、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收（一）物質(zhì)對(duì)光產(chǎn)生選擇性吸收的原因吸收光譜光作用于物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)吸收了可見(jiàn)光，而顯示出特征的顏色，這一過(guò)程與物質(zhì)的性質(zhì)及光的性質(zhì)有關(guān)。物質(zhì)對(duì)光的吸收物質(zhì)對(duì)光的吸收滿足Plank條件hS2S1S0S3E2E0E1E3hhh物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收

物質(zhì)的電子結(jié)構(gòu)不同，所能吸收光的波長(zhǎng)也不同，這就構(gòu)成了物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收基礎(chǔ)。例：A物質(zhì)B物質(zhì)同理，得：1ev=1.610-19J.（二）物質(zhì)的顏色與光吸收的關(guān)系物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過(guò)吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光（三）吸收曲線（吸收光譜）將不同波長(zhǎng)的單色光依次通過(guò)某一固定濃度的有色溶液，測(cè)量每一波長(zhǎng)下，有色溶液對(duì)光吸收的強(qiáng)度(A)，作A--λ曲線圖

吸收光譜反應(yīng)了不同物質(zhì)的不同特征吸收：同一物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收強(qiáng)度不同，如

KMnO4對(duì)400nm吸收少，對(duì)525nm吸收最大，稱

λmax

。(2)同一物質(zhì)濃度一定時(shí)，在某波長(zhǎng)下吸收強(qiáng)度一定，濃度不同吸收強(qiáng)度不同，c愈大，A愈大，是光譜定量的依據(jù)。

(3)同一物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的形式相同，結(jié)構(gòu)相同，吸收曲線的形狀相同，且λmax位置不變

。(4)不同物質(zhì)的吸收曲線形狀不同，決定了物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析的依據(jù)。

(5)若選擇在λmax處測(cè)量A，則靈敏度高。

(6)從吸收光譜曲線得出結(jié)論：c愈大，顏色愈深，吸收光愈強(qiáng)；c愈小，則相反。

定性分析與定量分析的基礎(chǔ)定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收ABA在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，物質(zhì)對(duì)光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比AC增大第二節(jié)光吸收的基本定律一、朗伯-比爾定律透光率（透射比）透光率定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%吸光度A

(Absorbance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=—lgT

朗伯定律(1760)：

A=lg(I0/It)=k1b

當(dāng)入射光的，吸光物質(zhì)的c一定時(shí)，溶液的吸光度A與液層厚度b成正比。比爾定律(1852)：

A=lg(I0/It)=k2c

當(dāng)入射光的，液層厚度b

一定時(shí)，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的c成正比。朗伯-比爾定律意義:

當(dāng)一束平行單色光通過(guò)均勻、透明的吸光介質(zhì)時(shí)，其吸光度與吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度和吸收層厚度的乘積成正比。A=lg(I0/It)=kbc吸光度A、透射比T與濃度c

的關(guān)系A(chǔ)T(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

20（一）朗伯-比爾定律的推導(dǎo)I0dbbItII-dIdI

∝NIN：薄層中的吸光粒子數(shù)N=N0cdSdbN0：阿伏加德羅常數(shù)dS

：捕獲面積，薄層中光照射的面積c：吸光溶液的濃度N=k’

cdb故

dI

∝NI=Ik’

cdbdI=-Ik

cdb,dI/I=-k

cdb積分得或得朗伯-比爾定律的適用條件1.

單色光

應(yīng)選用max處或肩峰處測(cè)定3.吸光質(zhì)點(diǎn)之間無(wú)相互作用

稀溶液，濃度增大，分子之間作用增強(qiáng)。

2.吸光物質(zhì)為均勻非散射體系

4.輻射與物質(zhì)之間的作用僅限于光吸收過(guò)程

無(wú)熒光和光化學(xué)現(xiàn)象發(fā)生（二）吸收系數(shù)和桑德?tīng)栰`敏度1、吸收系數(shù)a和摩爾吸收系數(shù)(

)

A=K·b·c

(1)

當(dāng)

c=g/L、b=cm：

K=a=L·g-1·cm-1

A＝abc(2)

當(dāng)

c=mol/L、b=cm：

K==L·mol-1·cm-1

A＝

bc

影響值大小的因素

(1)入射光波長(zhǎng)

(2)與被測(cè)物質(zhì)有關(guān)(FeSCN

，k=200；

Fephen1.1×104

)

(3)溫度，酸度，介質(zhì)，有色物結(jié)構(gòu)

(4)不隨

c或A值變化

越大,靈敏度越高:

<104為低靈敏度

104～105為中等靈敏度

>105為高靈敏度2、桑德?tīng)栰`敏度定義：當(dāng)光度檢測(cè)器的檢測(cè)極限為A=0.001則：?jiǎn)挝唤孛娣e光程內(nèi)所能檢測(cè)出來(lái)的吸光物質(zhì)最低含量。用S表示，單位：g·cm-2A=bc

=0.001

bc

＝0.001/

S小靈敏度高;

相同的物質(zhì)，M小則靈敏度高。變換單位:bcmcmol/L=bcM106g/1000cm2例

鄰二氮菲光度法測(cè)鐵，cFe=1.0mg/L,

b=2cm，A=0.38，計(jì)算、S解：

cFe

=1.0mg/L=1.0×10-3/55.85=1.8×10-5(mol·L-1)S=M/=55.85/1.1×104=0.0051(g/cm2)例

比較用以下兩種方法測(cè)Fe的靈敏度B、用4,7-二苯基鄰二氮菲光度法測(cè)定鐵ε533＝2.2×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(2.2×104)＝0.0025(g·cm-2)B方法比A方法的靈敏度高A、用鄰二氮菲光度法測(cè)定鐵時(shí)，ε508＝1.1×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(1.1×104)＝0.0051(g·cm-2)[例]已知含F(xiàn)e2+12.5μg/25mL，用鄰二氮菲顯色后形成Fe(Phen)3，用2cm比色皿在λ508nm測(cè)得A=0.19，求ε=？

[解]

μg·10-6

———

12.5·10-6(g)Fe(g/mol)25

[Fe2+]=cFe=—————/

————=———

25mL1000M

——

1000=8.95×10-6mol/L

A0.19ε=——=

=1.1×104L·mol-1·cm-1

bc2×8.95×10-6(三）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及其應(yīng)用繪制A-c（吸光度-濃度）曲線，得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。溶液濃度的測(cè)定A＝bc工作曲線法(標(biāo)準(zhǔn)曲線)

01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx二、引起偏離朗伯

–比爾定律的因素

主要原因物理因素化學(xué)因素（一）物理因素1.非單色光引起的偏離

Beer定律應(yīng)用的重要前提——入射光為單色光

照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長(zhǎng)寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過(guò)光對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)，必須保證一定的狹縫寬度這就使分離出來(lái)的光具一定的譜帶寬度設(shè)入射光由1和2兩種波長(zhǎng)組成，溶液的吸光質(zhì)點(diǎn)對(duì)兩種波長(zhǎng)的光的吸收均遵從吸收定律1

2

1+2

入射光的譜帶寬度嚴(yán)重影響吸光系數(shù)和吸收光譜形狀結(jié)論：選擇較純單色光（Δλ↓，單色性↑）選λmax作為測(cè)定波長(zhǎng)（Δ↓，S↑且成線性）成線性關(guān)系A(chǔ)與C不成線性關(guān)系，偏離比爾定律Ａ與Ｃ偏離線性關(guān)系越嚴(yán)重討論：２．非平行入射光引起的偏離３．介質(zhì)不均勻引起的偏離（二）化學(xué)因素Beer定律適用的另一個(gè)前提：稀溶液濃度過(guò)高會(huì)使C與A關(guān)系偏離定律[例]Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO4-

橙色

黃色

λ1max=350nm

λmax=375nm

λ2max=450nm

化學(xué)反應(yīng)引起的偏離第三節(jié)吸光光度法的儀器光度分析的幾種方法目視比色法標(biāo)準(zhǔn)系列未知樣品特點(diǎn)利用自然光比較吸收光的互補(bǔ)色光準(zhǔn)確度低（半定量）不可分辨多組分方法簡(jiǎn)便，靈敏度高光電比色法光電比色計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖通過(guò)濾光片得一窄范圍的光(幾十nm)濾光片吸收濾光片：只允許指定的窄范圍波長(zhǎng)光通過(guò)，其他波長(zhǎng)的光均被吸收。選擇濾光片的原則：

濾光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光,

即濾光片的顏色與有色溶液的顏色互補(bǔ)。吸光光度法通過(guò)棱鏡或光柵得到一束近似的單色光。波長(zhǎng)可調(diào)，故選擇性好，準(zhǔn)確度高。一、分光光度計(jì)的基本部件0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示未考慮吸收池和溶劑對(duì)光子的作用分光光度計(jì)的主要部件光源：發(fā)出所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠的光強(qiáng)度,

穩(wěn)定?？梢?jiàn)光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)

氙燈：紫外、可見(jiàn)光區(qū)均可用作光源/nm鎢燈（熱輻射光源）4006008001000氙燈（氣體放電光源）氫燈強(qiáng)度氙燈氫燈鎢燈單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的 裝置。

棱鏡：依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過(guò)棱鏡時(shí)折射率不同

玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800600500400光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。

利用光通過(guò)光柵時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。波長(zhǎng)范圍寬色散均勻分辨性能好使用方便－平面透射光柵－反射光柵（廣泛使用）吸收池(比色皿)：用于盛待測(cè)及參比溶液。

可見(jiàn)光區(qū)：光學(xué)玻璃池 紫外區(qū)：石英池信號(hào)顯示系統(tǒng)（檢流計(jì)）：檢測(cè)光電流強(qiáng)度的大小，并以一定的方式顯示或記錄下來(lái)。

數(shù)字顯示，自動(dòng)掃描記錄檢測(cè)器：利用光電效應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)換成電流訊號(hào)。

光電池，光電管，光電倍增管光電管(Phototube)h（片）紅敏管625-1000nm藍(lán)敏管200-625nm光電倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)1個(gè)光子可產(chǎn)生106～107個(gè)電子160-700nm二、吸光度的測(cè)量原理檢測(cè)器接受比色皿透過(guò)的光強(qiáng)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并放大顯示，讀取T,A光量調(diào)節(jié)：調(diào)T=100%或A=0三、分光光度計(jì)的類型單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示特點(diǎn)：使用時(shí)來(lái)回拉動(dòng)吸收池→移動(dòng)誤差對(duì)光源要求高比色池配對(duì)比值光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示光束分裂器單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)特點(diǎn)：不用拉動(dòng)吸收池，可以減小移動(dòng)誤差對(duì)光源要求不高可以自動(dòng)掃描吸收光譜雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)

特點(diǎn)：利用吸光度差值定量消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差光源單色器單色器檢測(cè)器切光器狹縫吸收池第四節(jié)吸光光度法分析條件的選擇一、顯色反應(yīng)及其條件的選擇（一）顯色反應(yīng)和顯色劑

顯色反應(yīng)的選擇

靈敏度高，一般ε>104;選擇性好;顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收；對(duì)照性好,

max>60nm;反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，穩(wěn)定;顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好。

顯色劑分類

1.無(wú)機(jī)顯色劑

SCN-→Fe3+，MoV

，Co2+

MoO42-→Si，P，V，Ge，As

H2O2→Ti→TiO(H2O2)2+

黃

2.有機(jī)顯色劑

生色團(tuán)：分子中含不飽和鍵基團(tuán)，吸收波長(zhǎng)

λ>200nm的光

–N=N–;C=O；C=S;–NO2;–N=O

助色團(tuán)：含有孤對(duì)電子的基團(tuán)，與生色團(tuán)上的不飽和鍵作用，影響化合物對(duì)光的吸收，使顏色加深。

–NH2

；RNH–；R2N–；–OH：：：：助色團(tuán)－NH，－OH，－X（孤對(duì)電子）neO生色團(tuán)：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共軛雙鍵）πe有機(jī)顯色劑CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：雙硫腙NN型：丁二酮肟鄰二氮菲磺基水楊酸（二）顯色反應(yīng)條件的選擇c(R)c(R)c(R)1.顯色劑的用量（c、pH一定）Mo(SCN)32+

淺紅Mo(SCN)5

橙紅Mo(SCN)6-淺紅用量范圍寬用量范圍窄嚴(yán)格控制顯色劑量2.溶液的酸度酸度的影響對(duì)顯色劑濃度和顏色的影響M+nR=MRnOH-H+存在型體的變化RH=R-

+H+

12生成不同配比的絡(luò)合物例，磺基水楊酸–Fe3+pH=2~3FeR紫紅色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黃色實(shí)際工作中，作A~pH曲線，尋找適宜pH范圍。pHpH1<pH<pH2溫度的選擇實(shí)際工作中，作A~T

曲線，尋找適宜反應(yīng)溫度。ATATATATAT反應(yīng)時(shí)間的選擇實(shí)際工作中，作A~t

曲線，尋找適宜反應(yīng)時(shí)間。3.時(shí)間和溫度另外，還有介質(zhì)條件、有機(jī)溶劑、表面活性劑等。4.共存離子的干擾及消除

(1)控制酸度，利用酸效應(yīng)提高選擇性

(2)加入掩蔽劑

(3)利用氧化還原反應(yīng)，改變干擾離子價(jià)態(tài)

(4)分離干擾元素

(5)利用參比液消除顯色劑、試劑帶入的干擾

(6)選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量波長(zhǎng)

Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(藍(lán))⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－測(cè)Co2＋

:(掩蔽法)化學(xué)法

Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+

CoR,ZnR

NiR,FeRCoR,Zn2+

,Ni2+

,Fe2+

鈷試劑RH+測(cè)Co2＋

:(生成絡(luò)合物性質(zhì)不同)消除干擾，也可采取分離法。Fe3+,Cu2+FeSSal（紫紅）Cu2+pH=2.5SSal測(cè)Fe3＋:(控制pH)物理法—選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)定波長(zhǎng)515655415500釷-偶氮砷III

鈷-亞硝基紅鹽

AA絡(luò)合物絡(luò)合物試劑試劑/nm/nm二、吸光光度法的測(cè)量誤差及測(cè)量條件的選擇100806040200T/%

c1

c2

c3

T

T

T-透光率讀數(shù)誤差

cc1c1c2c2c3c3><

由于T與濃度c不是線性關(guān)系，故不同濃度時(shí)的儀器讀數(shù)誤差T

引起的測(cè)量誤差c/c不同。（一）儀器測(cè)量誤差檢測(cè)計(jì)標(biāo)尺上A與T的關(guān)系若測(cè)A時(shí)產(chǎn)生微小的絕對(duì)差dA，則相對(duì)誤差Er為：Er=dA/A；A=εbc，當(dāng)b一定時(shí)，兩邊積分得：dA=εbdcdc為測(cè)量濃度時(shí)的絕對(duì)誤差，二式相除：

dA/A=dc/c=Er

因CA，故dc亦正比dA測(cè)量誤差公式推導(dǎo):dA

=d(-lgT)=d(-0.434lnT)=-0.434dT/TA=-lgTTlgT

最大時(shí)，即(TlgT)′=0時(shí)誤差最小,

算得lgT=-0.434,T=36.8%，A=0.4341086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434濃度測(cè)量的相對(duì)誤差與T(或A)的關(guān)系實(shí)際工作中，應(yīng)控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之間(調(diào)c,b,)（二）測(cè)量條件的選擇

1.測(cè)量波長(zhǎng)的選擇：最大吸收的原則λmax

2.控制吸光度讀數(shù)范圍：調(diào)

c或b，使A介于

0.2----0.8之間。

3.參比溶液的選擇:選合適的參比溶液,調(diào)儀器

A=0，T=100%。

1.僅絡(luò)合物有吸收，溶劑作參比。

如phen—Fe2+

標(biāo)準(zhǔn)曲線2.待測(cè)液也有吸收，被測(cè)液作參比。

如測(cè)汽水中的Fe3.顯色劑或其他試劑也有吸收，空白溶液作參比

例:鄰二氮菲光度法測(cè)Li2CO3中的Fe，

參比溶液為不含Li2CO3樣品的所有試劑。4.干擾組分與顯色劑有反應(yīng),又無(wú)法掩蔽消除時(shí)：

1）掩蔽被測(cè)組分，再加入顯色劑，作參比.2）加入等量干擾組分到空白溶液中,作參比.

--選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤旱谖骞?jié)吸光光度法的應(yīng)用一、定量分析（一）單組分的測(cè)定

1）選擇合適的顯色反應(yīng)和顯色條件

2）繪出被測(cè)組分的吸A

收光譜曲線(用標(biāo)液)3）在λmax下測(cè)一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液λ

的A值，繪制工作曲線A---c4）與工作曲線相同的方法，測(cè)未知物AX

，從工作曲線上查

cX

Ax

Cx1.一般方法2.示差分光光度法原理：以稍低于待測(cè)組分濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比溶液，然后測(cè)試液的吸光度，再?gòu)腁求c，從而提高準(zhǔn)確度。參比液cS<cX樣品液

(co<cX)

則AS=εbcSAX=εbcX

A=△A相對(duì)=AX-AS=εb(cX-cS)=εb△c相對(duì)用cS參比液調(diào)“0”，而后測(cè)A值，實(shí)際是試樣與參比之差△A與兩者的濃度差△c成正比故：cX=cS+△cX

方法比較常規(guī)法以空白溶劑為參比示差法以濃度為Cs

的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比A△C△CxA′常規(guī)法TxT051050100

落在測(cè)量誤差較大的范圍示差法T051050100TrTsTs

落在測(cè)量誤差較小的范圍結(jié)論：示差法通過(guò)提高測(cè)量的準(zhǔn)確度提高了方法的準(zhǔn)確度（二）多組分的同時(shí)測(cè)定

xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y標(biāo)液在1,2處分別測(cè)得在1處測(cè)組分x,在2處測(cè)組分yb)在1處測(cè)組分x;在2處測(cè)總吸收,扣除x吸收,可求yc)x,y組分不能直接測(cè)定

A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1處測(cè)得A1)

A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2處測(cè)得A2)二、絡(luò)合物組成和酸堿解離常數(shù)的測(cè)定（一）絡(luò)合物組成的測(cè)定1.摩爾比法:

固定cM

，改變cR

1:13:1c(R)/c(M)A1.02.03,0

M+nR=MRn2.等摩爾連續(xù)變化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:200.20.40.60.8100.20.40.60.81M+nR=MRn條件穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定00.51.0ACM/CA′A′<A0由于絡(luò)合物離解引起離解度MR=R+M總濃度c平衡濃度c(1-a