GB/T 41212-2021納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測納米顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧

ICS07120

CCSC.04

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測

納米顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧

Nanotechnoloies—5-and6-Chloromethl-2'7'Dichloro-dihdrofluorescein

g()y,y

diacetateCM-H2DCF-DAassaforevaluatinnanoarticle-inducedintracellular

()ygp

reactiveoxygenspeciesROSproductioninRAW2647macrophagecellline

().

ISO/TS190062016IDT

(:,)

2021-12-31發(fā)布2022-07-01實施

國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布

國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

目次

前言

…………………………Ⅰ

引言

…………………………Ⅱ

范圍

1………………………1

規(guī)范性引用文件

2…………………………1

術(shù)語和定義

3………………1

符號和縮略語

4……………3

材料

5………………………3

技術(shù)設(shè)備

6…………………4

納米顆粒樣品制備

7………………………4

準(zhǔn)備工作

8…………………5

概述

8.1…………………5

流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)

8.2……………………6

實驗培養(yǎng)基

8.3…………………………6

試劑制備

8.4……………6

細(xì)胞培養(yǎng)物的準(zhǔn)備

8.5…………………6

準(zhǔn)備實驗用的培養(yǎng)物

8.6………………6

檢測細(xì)胞生長狀態(tài)

8.7…………………6

評估納米顆粒的干擾

8.8………………7

對照組的準(zhǔn)備

8.9………………………8

概述

8.9.1……………8

對照組說明

8.9.2……………………8

儲備溶液制備

8.9.3Sin-1(1mM)…………………8

評價納米材料對細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的影響

9ROS……………8

準(zhǔn)備孔板中的細(xì)胞

9.124………………8

用對照物和不同濃度納米顆粒處理細(xì)胞

9.2…………8

細(xì)胞暴露

9.3CM-H2DCF-DA…………9

用孵育細(xì)胞

9.4CM-H2DCF-DA………………………9

流式細(xì)胞儀分析

9.5……………………9

數(shù)據(jù)分析和結(jié)果

10………………………10

附錄資料性替代細(xì)胞系

A()……………11

附錄資料性可替代的熒光表征技術(shù)

B()………………12

附錄資料性懸浮液的制備和表征

C()…………………13

附錄資料性來自的實驗數(shù)據(jù)示例

D()RAW264.7…………………14

參考文獻

……………………16

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

前言

本文件按照標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

本文件使用翻譯法等同采用納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測納米顆粒誘

ISO/TS19006:2016《

導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧

》。

與本文件中規(guī)范性引用的國際文件有一致性對應(yīng)關(guān)系的我國文件如下

:

醫(yī)療器械生物學(xué)評價第部分體外細(xì)胞毒性試驗

———GB/T16886.5—20175:(ISO10993-5:

2009,IDT)。

本文件做了下列編輯性修改

:

將術(shù)語和定義一章引導(dǎo)語引用的文件列入了第章規(guī)范性引用文件

———2“”;

參考文獻重新排序

———。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任

。。

本文件由中國科學(xué)院提出

。

本文件由全國納米技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口

(SAC/TC279)。

本文件起草單位國家納米科學(xué)中心中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所中國食品藥品檢定研究院

:、、。

本文件主要起草人吳曉春紀(jì)英露樊慧真李海蕓李一葉聶廣軍許海燕溫濤文海若淡墨

:、、、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

引言

隨著新材料產(chǎn)品和應(yīng)用的不斷開發(fā)納米技術(shù)領(lǐng)域持續(xù)快速發(fā)展與此同時人們對其中一些納

、,。,

米材料對人類健康和環(huán)境可能造成潛在風(fēng)險的疑慮也在不斷上升目前國際上正在開展大量的相關(guān)研

。

究以便更好地了解和量化這些潛在風(fēng)險此外在加工過程中或最終產(chǎn)品中用于包覆納米顆粒表面的

,。,

化學(xué)品也可能影響納米顆粒與細(xì)胞之間的相互作用特別是考慮到納米顆粒比表面積大的特點這一

。,

影響可能會更加突出因此對這些化學(xué)功能化的納米顆粒需要發(fā)展可靠快速的篩選方法來判定其

。,,、

潛在的顆粒毒性

。

監(jiān)測納米顆粒暴露后模式細(xì)胞的生物響應(yīng)有望加深我們對納米顆粒作用模式的理解以及判斷

“”,

其中哪些因素可能需要進一步研究以便進行接下來的風(fēng)險評估

。

年國際上一些研究團隊發(fā)現(xiàn)一些已發(fā)表的納米材料毒性研究結(jié)果在不同的實驗室無法重

2008,,

復(fù)需要發(fā)展準(zhǔn)確并可以重復(fù)的納米毒理學(xué)測試方法納米環(huán)境健康與安全協(xié)調(diào)國際聯(lián)盟

,。(nanoEHS)

應(yīng)運而生旨在開發(fā)可以準(zhǔn)確評估納米顆粒毒性及其與細(xì)胞生物作用的測試規(guī)程并且這些測

(IANH),,

試規(guī)程在任何實驗室均可重復(fù)采用二甲基噻唑基羧基甲氧基苯基磺

。IANH3-(4,5--2-)-5-(3-)-2-(4-

基苯基四唑法氯甲基二氯二氫熒光素二乙酸酯法和碘化

)-2H-(MTS)、5-(6)--2',7'--(CM-H2DCF-DA)

丙啶法對液體懸浮液中的粒徑分布和納米材料與細(xì)胞的體外相互作用進行了比對研究發(fā)現(xiàn)

,。IANH

了一些增加測試不確定性的因素并開發(fā)了降低此類不確定性的技術(shù)

,。

氧化應(yīng)激可導(dǎo)致?lián)p傷是造成生物體突變累積的主要驅(qū)動力因此評估納米顆粒是否會導(dǎo)

DNA,。

致活細(xì)胞產(chǎn)生活性氧非常重要

(ROS)。

本文件提供了評估納米顆粒細(xì)胞暴露產(chǎn)生的體外測量方法雖然測定細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生有很

ROS。ROS

多技術(shù)但目前僅開展了法評價小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的比對研究

,CM-H2DCF-DARAW264.7ROS。

法是檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激的一種常用方法對氧自由基或氧活性物種不具有特異性[9]

CM-H2DCF-DA,。

雖然該方法尚未在更為廣泛的細(xì)胞系中進行評估但它提供了深入了解巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生可能性

,ROS,

而這一機制可能在清除體內(nèi)顆粒中發(fā)揮重要作用

。

在有對照組的情況下法也可能出現(xiàn)誤判有若干因素可能會造成假陰性[9]

,CM-H2DCF-DA。。

法并非對所有的都能實現(xiàn)最佳檢測例如對半衰期較短的超氧陰離子和羥基

CM-H2DCF-DAROS。,

自由基其檢測效果欠佳二氯二氫熒光素和二氯熒光素能從細(xì)胞中浸出

,。2',7'-(DCFH)2',7'-(DCF)

或被氧化因此用流式細(xì)胞儀測量時應(yīng)在細(xì)胞暴露后迅速進行檢測此外法

DCFH,,。,CM-H2DCF-DA

在血清中失效在清洗細(xì)胞去除血清的過程可能會造成細(xì)胞丟失產(chǎn)生假陰性一些納米顆?？赡芘c

,,。

相互作用導(dǎo)致熒光部分淬滅因此如果存在上述情況實驗測得的陰性結(jié)果并不是絕對

DCFH。,,ROS

的用電子自旋共振波譜法檢測細(xì)胞中該方法可以在無干擾的情況下區(qū)

。ISO/TS18827(ESR)ROS。

分不同的

ROS。

反過來有些因素可能會造成假陽性[10]有些納米顆粒及死細(xì)胞會發(fā)熒光有些納米顆?？纱呋?/p>

,。。

氧化檢測試劑可能會優(yōu)先吸附在顆粒表面[10]為確保陽性結(jié)果可靠應(yīng)在測試條件

CM-H2DCF-DA。。,

下采用對照組單獨對納米顆粒進行表征并將死細(xì)胞產(chǎn)生的熒光與活細(xì)胞產(chǎn)生的熒光區(qū)分開

,ROS。

此外可發(fā)生光誘導(dǎo)的自氧化因此其儲備液無論濃度高低都應(yīng)在充氮氬氣的密

,CM-H2DCF-DA,/

閉容器中避光儲存防止光線照射和空氣進入

,。

因此法可能僅適用于特定的細(xì)胞系和納米顆粒在給出最終結(jié)論前還應(yīng)借助

,CM-H2DCF-DA。,

其他檢測方法對結(jié)果進行進一步確認(rèn)參見附件替代細(xì)胞系當(dāng)檢測體系中存在著可能會造成假

(A)。

陰性或假陽性結(jié)果的因素時尤其需要注意例如對于陽性結(jié)果應(yīng)尋找其他檢測方法確保該陽性結(jié)

,。,,

Ⅱ

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

果不是由干擾引起的其他需要考慮的因素包括應(yīng)用對照組確定未暴露細(xì)胞的熒光基線應(yīng)確定細(xì)胞

。:;

是否受無毒納米顆粒的影響應(yīng)確保陽性對照試劑和納米顆粒產(chǎn)生的在所使用的測定條件

;ROSROS

下都能被檢測到此外還需確定納米顆粒是否干擾熒光測定進一步導(dǎo)致顆粒誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的

。,,ROS

評估結(jié)果無效如果可能存在這一干擾可用暴露于嗎啉代二亞胺的細(xì)胞添加不同劑量的納

。,3-(Sin-1)

米顆粒進行對照實驗以判定納米顆粒是否淬滅熒光

,。

注此方法被認(rèn)為是一種快速篩選納米顆粒與細(xì)胞相互作用的方法雖然篩選類方法在評估納米顆粒的細(xì)胞效應(yīng)

:。

時非常關(guān)鍵但結(jié)果解釋能夠被其他及相關(guān)的細(xì)胞檢測方法驗證也是非常重要的

,ROS。

Ⅲ

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測

納米顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧

1范圍

本文件描述了如何用氯甲基二氯二氫熒光素二乙酸酯檢測和評價

5-(6)--2',7'-(CM-H2DCF-DA)

巨噬細(xì)胞暴露于納米物體納米顆粒及其聚集體和團聚體后產(chǎn)生活性氧的方法

RAW264.7、(ROS)。

本文件適用于用孔板的檢測如果用其他孔板需要調(diào)整樣品用量并檢驗操作步驟的有效性以

24。,

保證檢測結(jié)果可信

。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款其中注日期的引用文

。,

件僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于

,;,()

本文件

。

醫(yī)療器械生物學(xué)評價第部分體外細(xì)胞毒性試驗

ISO10993-55:(Biologicalevaluationof

medicaldevices—Part5:Testsforinvitrocytotoxicity)