GB/T 41212-2021納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測(cè)納米顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧

ICS07120

CCSC.04

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測(cè)

納米顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧

Nanotechnoloies—5-and6-Chloromethl-2'7'Dichloro-dihdrofluorescein

g()y,y

diacetateCM-H2DCF-DAassaforevaluatinnanoarticle-inducedintracellular

()ygp

reactiveoxygenspeciesROSproductioninRAW2647macrophagecellline

().

ISO/TS190062016IDT

(:,)

2021-12-31發(fā)布2022-07-01實(shí)施

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

目次

前言

…………………………Ⅰ

引言

…………………………Ⅱ

范圍

1………………………1

規(guī)范性引用文件

2…………………………1

術(shù)語(yǔ)和定義

3………………1

符號(hào)和縮略語(yǔ)

4……………3

材料

5………………………3

技術(shù)設(shè)備

6…………………4

納米顆粒樣品制備

7………………………4

準(zhǔn)備工作

8…………………5

概述

8.1…………………5

流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)

8.2……………………6

實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

8.3…………………………6

試劑制備

8.4……………6

細(xì)胞培養(yǎng)物的準(zhǔn)備

8.5…………………6

準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用的培養(yǎng)物

8.6………………6

檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

8.7…………………6

評(píng)估納米顆粒的干擾

8.8………………7

對(duì)照組的準(zhǔn)備

8.9………………………8

概述

8.9.1……………8

對(duì)照組說(shuō)明

8.9.2……………………8

儲(chǔ)備溶液制備

8.9.3Sin-1(1mM)…………………8

評(píng)價(jià)納米材料對(duì)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的影響

9ROS……………8

準(zhǔn)備孔板中的細(xì)胞

9.124………………8

用對(duì)照物和不同濃度納米顆粒處理細(xì)胞

9.2…………8

細(xì)胞暴露

9.3CM-H2DCF-DA…………9

用孵育細(xì)胞

9.4CM-H2DCF-DA………………………9

流式細(xì)胞儀分析

9.5……………………9

數(shù)據(jù)分析和結(jié)果

10………………………10

附錄資料性替代細(xì)胞系

A()……………11

附錄資料性可替代的熒光表征技術(shù)

B()………………12

附錄資料性懸浮液的制備和表征

C()…………………13

附錄資料性來(lái)自的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)示例

D()RAW264.7…………………14

參考文獻(xiàn)

……………………16

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

前言

本文件按照標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

本文件使用翻譯法等同采用納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測(cè)納米顆粒誘

ISO/TS19006:2016《

導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧

》。

與本文件中規(guī)范性引用的國(guó)際文件有一致性對(duì)應(yīng)關(guān)系的我國(guó)文件如下

:

醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第部分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

———GB/T16886.5—20175:(ISO10993-5:

2009,IDT)。

本文件做了下列編輯性修改

:

將術(shù)語(yǔ)和定義一章引導(dǎo)語(yǔ)引用的文件列入了第章規(guī)范性引用文件

———2“”;

參考文獻(xiàn)重新排序

———。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任

。。

本文件由中國(guó)科學(xué)院提出

。

本文件由全國(guó)納米技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口

(SAC/TC279)。

本文件起草單位國(guó)家納米科學(xué)中心中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所中國(guó)食品藥品檢定研究院

:、、。

本文件主要起草人吳曉春紀(jì)英露樊慧真李海蕓李一葉聶廣軍許海燕溫濤文海若淡墨

:、、、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

引言

隨著新材料產(chǎn)品和應(yīng)用的不斷開(kāi)發(fā)納米技術(shù)領(lǐng)域持續(xù)快速發(fā)展與此同時(shí)人們對(duì)其中一些納

、,。,

米材料對(duì)人類(lèi)健康和環(huán)境可能造成潛在風(fēng)險(xiǎn)的疑慮也在不斷上升目前國(guó)際上正在開(kāi)展大量的相關(guān)研

。

究以便更好地了解和量化這些潛在風(fēng)險(xiǎn)此外在加工過(guò)程中或最終產(chǎn)品中用于包覆納米顆粒表面的

,。,

化學(xué)品也可能影響納米顆粒與細(xì)胞之間的相互作用特別是考慮到納米顆粒比表面積大的特點(diǎn)這一

。,

影響可能會(huì)更加突出因此對(duì)這些化學(xué)功能化的納米顆粒需要發(fā)展可靠快速的篩選方法來(lái)判定其

。,,、

潛在的顆粒毒性

。

監(jiān)測(cè)納米顆粒暴露后模式細(xì)胞的生物響應(yīng)有望加深我們對(duì)納米顆粒作用模式的理解以及判斷

“”,

其中哪些因素可能需要進(jìn)一步研究以便進(jìn)行接下來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

。

年國(guó)際上一些研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一些已發(fā)表的納米材料毒性研究結(jié)果在不同的實(shí)驗(yàn)室無(wú)法重

2008,,

復(fù)需要發(fā)展準(zhǔn)確并可以重復(fù)的納米毒理學(xué)測(cè)試方法納米環(huán)境健康與安全協(xié)調(diào)國(guó)際聯(lián)盟

,。(nanoEHS)

應(yīng)運(yùn)而生旨在開(kāi)發(fā)可以準(zhǔn)確評(píng)估納米顆粒毒性及其與細(xì)胞生物作用的測(cè)試規(guī)程并且這些測(cè)

(IANH),,

試規(guī)程在任何實(shí)驗(yàn)室均可重復(fù)采用二甲基噻唑基羧基甲氧基苯基磺

。IANH3-(4,5--2-)-5-(3-)-2-(4-

基苯基四唑法氯甲基二氯二氫熒光素二乙酸酯法和碘化

)-2H-(MTS)、5-(6)--2',7'--(CM-H2DCF-DA)

丙啶法對(duì)液體懸浮液中的粒徑分布和納米材料與細(xì)胞的體外相互作用進(jìn)行了比對(duì)研究發(fā)現(xiàn)

,。IANH

了一些增加測(cè)試不確定性的因素并開(kāi)發(fā)了降低此類(lèi)不確定性的技術(shù)

,。

氧化應(yīng)激可導(dǎo)致?lián)p傷是造成生物體突變累積的主要驅(qū)動(dòng)力因此評(píng)估納米顆粒是否會(huì)導(dǎo)

DNA,。

致活細(xì)胞產(chǎn)生活性氧非常重要

(ROS)。

本文件提供了評(píng)估納米顆粒細(xì)胞暴露產(chǎn)生的體外測(cè)量方法雖然測(cè)定細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生有很

ROS。ROS

多技術(shù)但目前僅開(kāi)展了法評(píng)價(jià)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的比對(duì)研究

,CM-H2DCF-DARAW264.7ROS。

法是檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激的一種常用方法對(duì)氧自由基或氧活性物種不具有特異性[9]

CM-H2DCF-DA,。

雖然該方法尚未在更為廣泛的細(xì)胞系中進(jìn)行評(píng)估但它提供了深入了解巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生可能性

,ROS,

而這一機(jī)制可能在清除體內(nèi)顆粒中發(fā)揮重要作用

。

在有對(duì)照組的情況下法也可能出現(xiàn)誤判有若干因素可能會(huì)造成假陰性[9]

,CM-H2DCF-DA。。

法并非對(duì)所有的都能實(shí)現(xiàn)最佳檢測(cè)例如對(duì)半衰期較短的超氧陰離子和羥基

CM-H2DCF-DAROS。,

自由基其檢測(cè)效果欠佳二氯二氫熒光素和二氯熒光素能從細(xì)胞中浸出

,。2',7'-(DCFH)2',7'-(DCF)

或被氧化因此用流式細(xì)胞儀測(cè)量時(shí)應(yīng)在細(xì)胞暴露后迅速進(jìn)行檢測(cè)此外法

DCFH,,。,CM-H2DCF-DA

在血清中失效在清洗細(xì)胞去除血清的過(guò)程可能會(huì)造成細(xì)胞丟失產(chǎn)生假陰性一些納米顆粒可能與

,,。

相互作用導(dǎo)致熒光部分淬滅因此如果存在上述情況實(shí)驗(yàn)測(cè)得的陰性結(jié)果并不是絕對(duì)

DCFH。,,ROS

的用電子自旋共振波譜法檢測(cè)細(xì)胞中該方法可以在無(wú)干擾的情況下區(qū)

。ISO/TS18827(ESR)ROS。

分不同的

ROS。

反過(guò)來(lái)有些因素可能會(huì)造成假陽(yáng)性[10]有些納米顆粒及死細(xì)胞會(huì)發(fā)熒光有些納米顆粒可催化

,。。

氧化檢測(cè)試劑可能會(huì)優(yōu)先吸附在顆粒表面[10]為確保陽(yáng)性結(jié)果可靠應(yīng)在測(cè)試條件

CM-H2DCF-DA。。,

下采用對(duì)照組單獨(dú)對(duì)納米顆粒進(jìn)行表征并將死細(xì)胞產(chǎn)生的熒光與活細(xì)胞產(chǎn)生的熒光區(qū)分開(kāi)

,ROS。

此外可發(fā)生光誘導(dǎo)的自氧化因此其儲(chǔ)備液無(wú)論濃度高低都應(yīng)在充氮?dú)鍤獾拿?/p>

,CM-H2DCF-DA,/

閉容器中避光儲(chǔ)存防止光線照射和空氣進(jìn)入

,。

因此法可能僅適用于特定的細(xì)胞系和納米顆粒在給出最終結(jié)論前還應(yīng)借助

,CM-H2DCF-DA。,

其他檢測(cè)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)參見(jiàn)附件替代細(xì)胞系當(dāng)檢測(cè)體系中存在著可能會(huì)造成假

(A)。

陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的因素時(shí)尤其需要注意例如對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)尋找其他檢測(cè)方法確保該陽(yáng)性結(jié)

,。,,

Ⅱ

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

果不是由干擾引起的其他需要考慮的因素包括應(yīng)用對(duì)照組確定未暴露細(xì)胞的熒光基線應(yīng)確定細(xì)胞

。:;

是否受無(wú)毒納米顆粒的影響應(yīng)確保陽(yáng)性對(duì)照試劑和納米顆粒產(chǎn)生的在所使用的測(cè)定條件

;ROSROS

下都能被檢測(cè)到此外還需確定納米顆粒是否干擾熒光測(cè)定進(jìn)一步導(dǎo)致顆粒誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的

。,,ROS

評(píng)估結(jié)果無(wú)效如果可能存在這一干擾可用暴露于嗎啉代二亞胺的細(xì)胞添加不同劑量的納

。,3-(Sin-1)

米顆粒進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以判定納米顆粒是否淬滅熒光

,。

注此方法被認(rèn)為是一種快速篩選納米顆粒與細(xì)胞相互作用的方法雖然篩選類(lèi)方法在評(píng)估納米顆粒的細(xì)胞效應(yīng)

:。

時(shí)非常關(guān)鍵但結(jié)果解釋能夠被其他及相關(guān)的細(xì)胞檢測(cè)方法驗(yàn)證也是非常重要的

,ROS。

Ⅲ

GB/T41212—2021/ISO/TS190062016

:

納米技術(shù)熒光素二乙酸酯法檢測(cè)

納米顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧

1范圍

本文件描述了如何用氯甲基二氯二氫熒光素二乙酸酯檢測(cè)和評(píng)價(jià)

5-(6)--2',7'-(CM-H2DCF-DA)

巨噬細(xì)胞暴露于納米物體納米顆粒及其聚集體和團(tuán)聚體后產(chǎn)生活性氧的方法

RAW264.7、(ROS)。

本文件適用于用孔板的檢測(cè)如果用其他孔板需要調(diào)整樣品用量并檢驗(yàn)操作步驟的有效性以

24。,

保證檢測(cè)結(jié)果可信

。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款其中注日期的引用文

。,

件僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于

,;,()

本文件

。

醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第部分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

ISO10993-55:(Biologicalevaluationof

medicaldevices—Part5:Testsforinvitrocytotoxicity)