第二章 色譜法原理

第二章色譜法的原理

（PrinciplesofChromatography）

第一節(jié)色譜分析的基本原理一、色譜分離的本質(zhì)分配系數(shù)的差異是所有色譜分離的實質(zhì)性原因分配系數(shù)K是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即

K=溶質(zhì)在固定相中的濃度/溶質(zhì)在流動相中的濃度=Cs/Cm

Cs

和Cm的單位是g/ml容量因子k容量因子又稱分配比，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的物質(zhì)的量比。即

k=組分在固定相中的物質(zhì)的量/組分在流動相中的物質(zhì)的量=p/q容量因子k值可直接從色譜圖中測得。k=(tR–tM)/tM

=tR/tM

=VR/V0

k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱分配容量。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動相及固定相的體積有關(guān)。

3.分配系數(shù)K與容量因子k

的關(guān)系

k=CsVS/CmVm

=KVS/VM=K/(=VM/VS)K=k·

在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。其中β稱為相比，它是反映各種色譜柱柱型特點的又一個參數(shù)。例如，對填充柱，其β值一般為6-35；對毛細管柱，其β值為60-600。1、塔板理論的導(dǎo)出始于馬丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點不同而分離。色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。二、色譜分離的塔板理論板式精餾塔

塔板理論的導(dǎo)出將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，引用了處理蒸餾過程的概念、理論和方法來處理色譜過程。把色譜柱比作一個分餾塔，色譜柱可由許多假想的塔板組成（既色譜柱可分成許多小段），在每一小段（塔板）內(nèi)，一部分空間為涂在擔(dān)體上的液相占據(jù)，另一部分空間充滿著載氣（氣相），載氣占據(jù)的空間稱為板體積△V。當(dāng)欲分離的組分隨載氣進入色譜柱后，就在兩相間進行分配。

由于流動相在不停地移動，組分就在這些塔板間隔的氣液兩相間不斷地達到分配平衡?！鱒（除去固定相，稱為板體積）塔板數(shù)（柱長）LH塔板高度塔板理論假定：⑴在這樣一小段間隔內(nèi)，氣相平均組成與液相平均組成可以很快達到分配平衡，這樣達到分配平衡的一小段柱長，稱為理論塔板高度H.⑵載氣進入色譜柱，不是連續(xù)而是脈動式的，每次進氣為一個板體積。⑶試樣開始時都加在第0號塔板上，且試樣沿色譜柱方向的（縱向擴散）擴散可略而不計。⑷分配系數(shù)和分配比在各塔板上是常數(shù)。

為簡單起見，設(shè)色譜柱由5塊塔板（n=5，n為柱子的塔板數(shù))組成，并以r表示塔板編號，r等于0，1，2，…，n—1，某組分的容量因子k=1,則根據(jù)上述假定，在色譜分離過程中該組分的分布可計算如下：

開始時，若有單位質(zhì)量，即m=l(1mg或1μg)的該組分加到第0號塔板上，分配達平衡后，由于k=l，即p=q，故p=q=0.5.

當(dāng)一個板體積(1△v)的載氣以脈動形式進入0號板時，就將氣相中含有q部分組分的載氣頂?shù)?號板上,此時0號板液相中p部分組分及1號板氣相中的q部分組分，將各自在兩相間重新分配，故0號板上所含組分總量為0.5，其中氣液兩相各為0.25，而1號板上所含總量同樣為0.5，氣液兩相亦各為0.25。以后每當(dāng)一個新的板體積載氣以脈動式進入色譜柱時，上述過程就重復(fù)一次，如下所示：塔板號r0123進樣q0.5p0.5進氣1△Vq0.250.25p0.250.25進氣2△Vq0.1250.125+0.1250.125p0.1250.125+0.1250.125進氣3△Vq0.0630.063+0.1250.125+0.0630.063p0.0630.125+0.0630.063+0.1250.063

按上述分配過程，對于n=5，k=1，m=1的體系，隨著脈動式進入柱中板體積載氣的增加，組分分布在柱內(nèi)任一板上的總量(氣相、液相總質(zhì)量)見下表。012345n=01234567891011121314151610.50.250.1250.0630.0320.0160.0080.0040.0020.00100000000.50.50.3750.250.1570.0950.0560.0320.0180.0100.0050.0020.001000000.250.3750.3750.3130.2350.1650.1110.0720.0450.0280.0160.0100.0050.0020.0010000.1250.250.3130.3130.2740.220.1660.0940.0700.0490.0330.0220.0140.00800000.0630.1570.2350.2740.2740.2470.2070.1510.1100.080.0570.0400.027000000.0320.0790.1180.1380.1380.1240.1040.0760.0560.0400.0280.020載體板體積數(shù)Nr由表中數(shù)據(jù)可見，當(dāng)進氣量N=5時，即5個板體積載氣進入柱子后，組分就開始在柱出口出現(xiàn)，進入檢測器產(chǎn)生訊號(見下圖，圖中縱坐標x為組分在柱出口出現(xiàn)的分數(shù)）。n0.150.100.055圖7-4組分從n=5柱中流出曲線圖為組分在柱出口的分數(shù)x

由圖7-4可以看出，組分從具有5塊塔板的柱中沖洗出來的最大濃度是在N為8和9時。流出曲線呈峰形但不對稱。這是由于柱子的塔板數(shù)太少的緣故。經(jīng)多次分配后的濃度分布

當(dāng)n>50時，就可以得到對稱的峰形曲線。在氣相色譜中，n值是很大的，約為103~105，因而這時的流出曲線可趨近于正態(tài)分布曲線。這樣，溶質(zhì)在氣液兩相的分配方式符合數(shù)學(xué)上的“二次項分配”，從二次項分配可以導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)表達式C——色譜流出曲線上任意一點的濃度N——理論塔板數(shù)M——溶質(zhì)的質(zhì)量VR——溶質(zhì)保留體積V——在色譜流出曲線上任意一點的保留體積

式中co為進樣濃度，tR為保留時間，σ為標準偏差，c為時間t時的濃度，此式稱為流出曲線方程式。

以上討論單一組分在色譜柱中的分配過程。流出曲線上的濃度c與時間t的關(guān)系可由下式示：2、有兩個物質(zhì)在色譜柱中的分配及流出曲線假如有A,B兩個物質(zhì)A的K=1/3B的K=3色譜柱固定相和流動相體積相同兩個物質(zhì)經(jīng)過色譜柱之后的流出曲線如圖：分配系數(shù)為0.33及3.00的A、B二組分經(jīng)多次分配的結(jié)果

若試樣為多組分混合物，則經(jīng)過很多次的分配平衡后，如果各組分的分配系數(shù)有差異，則在柱口處出現(xiàn)最大濃度時所需的載氣板體積亦將不同，由于色譜柱的塔板數(shù)相當(dāng)多，因此分配系數(shù)有微小差異，仍可獲得好的分離效果。

色譜峰→窄，塔板數(shù)n→多，理論塔板高→小，柱效能→高。因而n或h作為描述柱效能的一個指標。由塔板理論可導(dǎo)出n與色譜峰峰底寬度的關(guān)系：

式中L為色譜柱的長度，tR及W1/2或W用同一單位（時間，距離）。表示色譜柱的效能指標①

tR，W1/2，W單位統(tǒng)一②對應(yīng)的組分（標明物質(zhì)）③L改變則n有效改變，對H有效無影響。

塔板理論在解釋流出曲線的形狀，濃度極大點位置以及計算評價柱效能等方面取得了成功。第二節(jié)色譜法中常用的術(shù)語和參數(shù)一、氣相色譜法中常用的術(shù)語和參數(shù)

1、典型的色譜圖下圖是使用熱導(dǎo)池檢測器，往色譜儀中注入帶有少量空氣時，得到的色譜圖（二）基線在實驗操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。（三）峰高色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以（h）表示。色譜圖（無鉛汽油）農(nóng)藥碳酸飲料

2、區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學(xué)因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。1.標準偏差---即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2.半峰寬Y1/2---即峰高一半處對應(yīng)的峰寬。它與標準偏差的關(guān)系為

Y1/2=2.3543.峰底寬度Y---即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標準偏差的關(guān)系是Y=43、保留值

1.死時間tM

不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，如下圖。信號進樣tM

因為這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動速度將與流動相流動速度相近。測定流動相平均線速ū時，可用柱長L與tM的比值計算，即

ū=L/tM2.死體積VM

指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當(dāng)后兩項很小可忽略不計時，死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣流速Fco（cm3·min-1）計算。

VM=tMFco

式中Fco為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。3、死區(qū)域VG

色譜柱中不被固定相占據(jù)的空間4.保留時間tR試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間，稱為保留時間，如下圖。信號進樣tR5.調(diào)整保留時間tR′某組分的保留時間扣除死時間后，稱為該組分的調(diào)整保留時間，即tR′=tR

tM

由于組分在色譜柱中的保留時間tR包含了組分隨流動相通過柱子所需的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，所以tR實際上是組分在固定相中保留的總時間。

保留時間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。6.保留體積VR指從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關(guān)系：

VR=tRFco

7.調(diào)整保留體積VR

某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。

VR=VR

V0=tRFco

8、凈保留體積VN經(jīng)過壓力修正的調(diào)整保留體積

VN

=jVR

j為色譜柱進口和出口之間的壓力梯度校正系數(shù)

Pi——色譜柱進口壓力P0——色譜柱出口壓力9、比保留體積Vg把凈保留體積進一步校正到單位質(zhì)量固定液和273K時的保留體積VL——固定液體積ρL——固定液密度ρLVL——固定液質(zhì)量10.相對保留值r2,1

某組分2的調(diào)整保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值。

r2,1=2/tR1′=VR2/VR1

由于相tR對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。

在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（s），然后再求其它峰（i）對這個峰的相對保留值，此時可用符號表示，即

=tR(i)/tR(s)

式中tR(i)為后出峰的調(diào)整保留時間，所以總是大于1的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標，又稱選擇因子。11、保留指數(shù)（I）1958年由克瓦茨（Kovats

）提出，用來表示化合物在一定溫度下在某種固定液上的相對保留值。保留指數(shù)

人為規(guī)定正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為其碳數(shù)乘100,如正己烷和正辛烷的保留指數(shù)分別為600和800。至于其他物質(zhì)的保留指數(shù)，則可采用兩個相鄰正構(gòu)烷烴保留指數(shù)進行標定。測定時，將碳數(shù)為n和n+1的正構(gòu)烷烴加于樣品x中進行分析，若測得它們的調(diào)整保留時間分別為tr′（Cn），tr′（Cn+1；）和tr′（x）且tr′（Cn）＜tr′（x）＜tr（Cn+1）時，則組分X的保留指數(shù)可按下式計算，即12、保留指數(shù)差（ΔI

）化合物X在某一固定液S上測得的保留指數(shù)Ixs減去X在角鯊?fù)楣潭ㄒ荷系玫降谋Ａ糁笖?shù)IxsqΔIxs=Ixs-Ixsq4、色譜柱的柱效率和分離度（1）柱效率柱效率—溶質(zhì)通過色譜柱之后其區(qū)域?qū)挾鹊脑龃蠓?。溶劑效率—兩個物質(zhì)在固定相上的相對保留值的大小。（2）理論塔板數(shù)(n)的計算和測定(3)有效理論塔板數(shù)（neff）消除色譜柱中死體積對柱效的影響（4）溶劑效率固定相對某兩個混合物分離能力的表征即α2,1=ti/ts′=Vi/Vs=Ki/Ks5、分離度

分離度R，是一個綜合性指標。分離度是既能反映柱效率又能反映溶劑效率的指標，稱總分離效能指標。分離度又叫分辨率，(1)分離度(R)

它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即

R=2(tR2-tR1)/W1+W2

(2)半峰寬分離度（R1/2）R1/2=2(tR2-tR1)/W1/2（1）

+W1/2（2）（3）峰高分離度（Rh）當(dāng)一對物質(zhì)分離較差時，可以用峰高分離度表示

Rh=(hI-hM)/hI

R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般說，當(dāng)R<1時，兩峰有部分重疊；當(dāng)R=1時，分離程度可達98%；當(dāng)R=1.5時，分離程度可達99.7%。

通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。6、各色譜參數(shù)之間的關(guān)系（1）保留時間和容量因子之間的關(guān)系

tR

=tM(1+k)=L/ū(1+k)

k=tR'/tM

(2)分離度R=（

n/4）（α-1/α）（k/1+k）上式即為基本色譜分離方程式。

基本的色譜方程的表達式

在實際應(yīng)用中，往往用neff代替n處理上式可得

可以看出，后者為基本色譜分離方程式又一表達式。

二、液相色譜中常用術(shù)語和參數(shù)1、色譜圖和保留值（1）粒間體積（V0）色譜柱填充劑顆粒間隙中流動相所占有的體積（2）（多孔填充劑）孔體積（Vp）色譜柱中多孔填充劑所有孔洞中流動相所占有的體積（3）柱外體積（Vext）從進樣系統(tǒng)到檢測器之間色譜柱外的液路部分中流動相所占有的體積（4）液體總體積（Vtot）Vtot=V0+VP+Vext

（5）淋洗（洗脫）體積（Ve）從進樣開始計算的通過色譜柱的實際淋洗體積（6）流體力學(xué)體積（Vh）每摩爾高分子化合物在溶液中運動時所占的體積，與相對分子量和特性粘度的乘積成正比2、和柱效能有關(guān)的參數(shù)（1）折合板高（hr）折合成固定相單位粒徑的理論板高

hr

=H/dp（2）折合流動相速度（vr）

vr

=udp/Dm1956年荷蘭學(xué)者vanDeemter（范第姆特）等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學(xué)理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，從而在動力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。第三節(jié)色譜的速率理論

vanDeemter方程的數(shù)學(xué)簡化式為

H=A+B/u+Cu式中u為流動相的線速度；A、B、C、為常數(shù)，分別代表渦流擴散系數(shù)、分子擴散項系數(shù)、傳質(zhì)阻力項系數(shù)。一、氣相色譜速率理論（1）.渦流擴散項

A

在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似渦流的流動，故稱渦流擴散。

渦流擴散示意圖初始帶寬最終帶寬

由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長短不一，因而同時進色譜柱的相同組分到達柱口時間并不一致，引起了色譜峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定：

A=2λdp

上式表明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)。為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于空心毛細管，不存在渦流擴散，因此A=0。（2）.分子擴散項B/u（縱向擴散項）縱向分子擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。它隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)的向前和向后擴散，造成譜帶展寬。分子擴散項系數(shù)為B=2γDg（a）柱內(nèi)譜帶構(gòu)型（b）相應(yīng)的響應(yīng)信號B/u（縱向分子擴散項）——指分子沿色譜柱軸向擴散引起的色譜譜帶展寬B=2γDg式中：γ——彎曲因子，填充柱γ

<1

空心柱γ=1Dg——組分在流動相中的擴散系數(shù)

由于組分在液相中的擴散系數(shù)只有氣體中的1/105，因此在液相色譜中B可以忽略。

γ是填充柱內(nèi)流動相擴散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。Dg為組分在流動相中擴散系數(shù)（cm3·s-1）,分子擴散項與組分在流動相中擴散系數(shù)Dg成正比.

T——絕對溫度MA,MB——氣體摩爾質(zhì)量P——總壓力VA.VB——氣體摩爾體積Dg與流動相及組分性質(zhì)有關(guān)：

(a)

相對分子質(zhì)量大的組分Dg小，Dg反比于流動相相對分子質(zhì)量的平方根，所以采用相對分子質(zhì)量較大的流動相，可使B項降低；

(b)Dg隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。

另外縱向擴散與組分在色譜柱內(nèi)停留時間有關(guān)，流動相流速小，組分停留時間長，縱向擴散就大。因此為降低縱向擴散影響，要加大流動相速度。對于液相色譜，組分在流動相中縱向擴散可以忽略。（3）.傳質(zhì)阻力項Cu傳質(zhì)阻力系數(shù)C包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg和液相傳質(zhì)阻力系數(shù)C1兩項，即

C=Cg+C1

氣相傳質(zhì)過程是指試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程。這一過程中試樣組分將在兩相間進行質(zhì)量交換，即進行濃度分配。有的分子還來不及進入兩相界面，就被氣相帶走；