流式細(xì)胞術(shù)的原理(科研)

流式細(xì)胞術(shù)的原理BD生物科學(xué)王淑琦概念Definition流式細(xì)胞術(shù)Flowcytometry(FCM)cellsuspension細(xì)胞懸液在流動的狀態(tài)中被檢測各項(xiàng)特性特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析檢測的對象主要是各種生物顆粒，包括大量的臨床樣本：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，實(shí)體組織，同時包括各種各樣的科研研究對象：培養(yǎng)細(xì)胞，藻類、染色體、原生動物流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)以及原理流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)以及工作原理雖然每款流式細(xì)胞儀有各自的特征性結(jié)構(gòu)，但是其內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本組成相同?；窘Y(jié)構(gòu)一共分三部分：液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子系統(tǒng)PrincipleReview液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)包括流動室flowchamber液流驅(qū)動系統(tǒng)InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid鞘液三大作用：避免堵塞噴孔約束樣本位于噴嘴中心、提高測量精度保持細(xì)胞活性液流系統(tǒng)對靈敏度要求不是很苛刻的實(shí)驗(yàn)，可調(diào)高樣本進(jìn)樣速率，從而提高采樣分析速度。光學(xué)系統(tǒng)主要由激發(fā)光源、光束成形及收集系統(tǒng)組成

弧光燈：氙燈、高壓汞燈價格便宜激發(fā)光譜廣但是單色性差-單一譜線上能量弱穩(wěn)定性差-功率不穩(wěn)定激光器：氣體激光器：氬離子（488nm）、氦氖（633nm）、氪離子（647nm）、氪氬（568nm）半導(dǎo)體激光器：價格低、結(jié)構(gòu)簡單、使用壽命長。BDFACSCalibur采用的635nm染料激光器光學(xué)系統(tǒng)激光器：單波長、高能量、發(fā)散角小、高穩(wěn)定性光照光學(xué)系統(tǒng)激光在檢測細(xì)胞樣本前經(jīng)過透鏡聚焦成為非常窄的高能量光束。激光光束的橫截面呈橢圓形光斑，所以除了集聚能量（細(xì)胞通過檢測區(qū)時就可以得到很強(qiáng)的信號），這樣還可以避免照射到其他細(xì)胞造成干擾。激光光束成形-透鏡聚焦光學(xué)系統(tǒng)收集系統(tǒng)

如何將混合的熒光區(qū)分開來，分別進(jìn)行收集呢？濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍光學(xué)系統(tǒng)電子系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的工作原理散射光信號前向角散射光（FSC，F(xiàn)orwardScatter）：細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC，SideScatter）：細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞核相對復(fù)雜性散射光信號熒光信號特異熒光信號背景信號熒光素什么是熒光及熒光素？某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光波長長的光線-即熒光。而這些受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光素。什么是熒光發(fā)生機(jī)理？室溫下的熒光素分子大部分處于穩(wěn)定的“基態(tài)”。當(dāng)熒光素在激發(fā)光的照射下吸收足夠的光能后，躍遷到新的狀態(tài)，即“激發(fā)態(tài)”。處于激發(fā)態(tài)的熒光分子極不穩(wěn)定，它可以通過極短時間（納秒）內(nèi)以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜所有的熒光素都有兩個特征光譜。激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：-是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。-我們一般標(biāo)注的是吸收波峰，也就是最大吸收波長：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：-是指熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光。所有熒光都是寬譜發(fā)射。-一般標(biāo)注的是發(fā)射波峰，即最大發(fā)射波長：Em-MaxFITC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料FITC可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：525nm，可以配用530/30接收通道488nm525nmPI的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料PI同樣可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：625nm，所以配用不同的585/42接收通道488nm625nmAPC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料APC可被635nm激光激發(fā)，Em-Max：660nm，可以配用660/20接收通道635nm660nm熒光染料的選擇儀器配置：激光器種類；光信號接收通道；減少發(fā)射光光譜重疊補(bǔ)償——熒光染料寬譜發(fā)射的特征產(chǎn)生補(bǔ)償問題。—PE滲漏到FITC通道的信號FL1-x%FL2—FITC滲漏到PE通道的信號FL2-x%FL1先電壓，后補(bǔ)償雙色染色的實(shí)驗(yàn)中先使用陰性管調(diào)電壓陰性對照（1）：細(xì)胞加上IgG1FITC,IgG1PE然后用單染管調(diào)補(bǔ)償單染管（2）：細(xì)胞+抗體AFITCor抗體BPE調(diào)電壓

-尋找目標(biāo)細(xì)胞群;-多色實(shí)驗(yàn)中，分出陰陽性細(xì)胞群分界線調(diào)閾值-減少背景信號調(diào)補(bǔ)償-減去干擾信號調(diào)節(jié)電壓、閾值、補(bǔ)償調(diào)整熒光接收器電壓電壓改變對數(shù)據(jù)顯示的影響數(shù)據(jù)存儲ListMode列表模式：每個細(xì)胞的參數(shù)依次按順序排列存儲

FSCSSCFL1FL2EVENVENT210020024540EVENT3300600100700FITC/PE雙染樣本數(shù)據(jù)顯示二維點(diǎn)圖（DotPlot）直方圖（Histogram）等高線圖（ContourPlot）密度圖（Density）三維圖（3DPlot）等·樣本收集及處理制備單細(xì)胞懸液免疫熒光染色上機(jī)檢測數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)操作流程1.樣本制備樣本來源血液骨髓淋巴結(jié)體液（尿液、腦脊液、胸腹腔積液）灌洗液（肺泡支氣管）加抗凝劑（EDTA），室溫保存，24h內(nèi)實(shí)體組織機(jī)械法制備單細(xì)胞懸液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性劑2.免疫熒光染色染色方式的選擇直接染色—標(biāo)有熒光染料的抗體直接特異結(jié)合目標(biāo)抗原。—首選的方式：方便快捷、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、非特異結(jié)合少間接染色—標(biāo)有熒光染料的二抗間接特異結(jié)合目標(biāo)抗原?！谥苯尤旧荒軐?shí)現(xiàn)的情況下，選用的方式：非特異性結(jié)合相對增加。在流式試劑日益全面的情況下，越來越少的客戶選擇這種方式。僅適用于研究最新發(fā)現(xiàn)抗原的客戶。熒光染料的選擇1，首先，了解目標(biāo)抗原1）細(xì)胞表面抗原2）細(xì)胞內(nèi)或是核內(nèi)抗原（固定、透膜步驟）3）以上兩者兼?zhèn)?。先?biāo)記表面抗原，固定后，破膜標(biāo)記胞內(nèi)抗原。4）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測定。使用細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑，如monensin、BFA，使得細(xì)胞因子不能分泌到細(xì)胞外。（活化、固定、透膜）2，了解熒光染料及其工作原理，做出準(zhǔn)確的選擇。熒光染料的種類熒光染料分為三大類1.小分子化合物：FITC、PacificBlue2.大分子熒光蛋白：AmCyan，PerCP，PE,APC3.串聯(lián)染料：PerCP-Cy5.5，PE-Cy5如何正確選擇與使用熒光素儀器配置：有哪些激光器與接收通道多色實(shí)驗(yàn)中，盡量減少熒光素之間的相互干擾—如APC與Cy5不能串聯(lián)使用，兩者光譜重疊大，補(bǔ)償不好調(diào)。BD網(wǎng)站提供每一種熒光素的激發(fā)以及發(fā)射光譜如何正確選擇與使用熒光素儀器配置：有哪些激光器與接收通道多色實(shí)驗(yàn)中，盡量減少熒光素之間的相互干擾—如APC與Cy5不能串聯(lián)使用，兩者光譜重疊大，補(bǔ)償不好調(diào)。盡量選擇應(yīng)用廣、亮度高的熒光素—熒光素的強(qiáng)弱用StainIndex染色指數(shù)來表示，數(shù)值越大，信噪比越高。多色實(shí)驗(yàn)中，亮度高的熒光素搭配表達(dá)量低的目標(biāo)抗原—例如，PE，APC這類大分子蛋白相對亮度高。SI值如何正確選擇與使用熒光素儀器配置：有哪些激光器與接收通道多色實(shí)驗(yàn)中，盡量減少熒光素之間的相互干擾—如APC與Cy5不能串聯(lián)使用，兩者光譜重疊大，補(bǔ)償不好調(diào)。盡量選擇應(yīng)用廣、亮度高的熒光素—熒光素的強(qiáng)弱用StainIndex染色指數(shù)來表示，數(shù)值越大，信噪比越高。多色實(shí)驗(yàn)