單克隆抗體制備試驗(yàn)過程

單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程I選出所需要的細(xì)I胞群I選出所需要的細(xì)I胞群J維領(lǐng)培養(yǎng)一、免疫動物免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏8淋巴細(xì)胞的過程。一般選用6-8周齡雌性82比/。小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射.抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆,使其活化、增殖，并分化成為致敏8淋巴細(xì)胞。單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程萬法一速徑佐利飄厘61號）與上次免疫間隔時間首本免疫皮下FCA10-1000第一次加強(qiáng)免疫皮下FIA10-50四周第二次加強(qiáng)免疫皮下FIA10-50三周第三次加強(qiáng)免疫皮下FIA10-50三周沖擊免疫腹腔:尾靜脈或脾內(nèi)一5-20三周方法二途徑佐劉言理區(qū)A與上繳免疫間隔時間首發(fā)免疫皮下FCA10-1000第一次加強(qiáng)免疫腹腔FIA10-50四周第二次加強(qiáng)免疫腹腔FIA10-50三周第三次加強(qiáng)免疫腹腔FIA10-50三周沖擊免疫腹腔、尾靜脈或脾內(nèi)一10-20三周方法三途究佐制,和里（ugj與上次免疫間隔時間首城免疫腿部肌肉 Quick：dTLtibud71-500第一人加強(qiáng)免疫腿部肌肉 Quickantibudy1-50三周沖擊免＜疫腹腔、尾靜脈或脾內(nèi)一一5-20兩周方法四途徑佐劉副里或與上次免疫間隔時間首次免疫牌內(nèi)一1-20口沖擊免疫腹腔一尾靜脈或脾內(nèi)一5?20_周說明：FCA,弗氏完全佐劑；FIA,弗氏不完全佐劑；Quickantibody,北京康碧泉公司研制的佐劑。上表中第四種免疫方法產(chǎn)生的抗體大部份都為用乂，存在親和力弱等缺點(diǎn)，慎用。PS：1、一般皮下注射每個注射點(diǎn)注射30-50ul左右混有佐劑的抗原，每只小鼠注射6—8個點(diǎn)為宜。2、腹腔注射時，如果抗原混有弗氏佐劑，建議注射在左側(cè)腹腔，如果采用右側(cè)腹腔注射，則在免疫過程中，很容易導(dǎo)致小鼠脾臟與腹膜粘連的情況，造成后期取出脾臟麻煩。3、沖擊免疫完成后，應(yīng)在96小時內(nèi)完成細(xì)胞融合，否則相應(yīng)的B細(xì)胞數(shù)量會下降到未沖擊前的水平.二、細(xì)胞融合（Cellfusion）【材料和試劑】（1）骨髓瘤細(xì)胞懸液選好骨髓瘤細(xì)胞株，取體外培養(yǎng)對數(shù)生長期細(xì)胞或體內(nèi)生長的腫瘤分離骨髓瘤細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。（2）免疫小鼠脾細(xì)胞懸液取3天前加強(qiáng)免疫的小鼠，眼眶放血，□分離血清凍存?zhèn)溆谩＠i處死小鼠，浸泡于75%酒精中3?5由加.無菌操作取出脾臟，置入盛有5ml不完全培養(yǎng)液的平皿中洗滌，剪去周圍的結(jié)締組織，將脾臟移入另一盛有5ml不完全培養(yǎng)液的平皿中的鋼網(wǎng)上，先用剪刀剪成3?5個小塊，然后用注射器內(nèi)芯研磨。將脾臟細(xì)胞懸液移至50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液50ml,1000r/min離45min,棄上清，再以同法洗滌離心一次。然后將沉淀細(xì)胞重新懸浮于10ml不完全單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程培養(yǎng)液中，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，一般一只小鼠可得0。5?2X108個脾細(xì)胞。(3)飼養(yǎng)細(xì)胞將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑲從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管.右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清.先用5ml以丁培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2X105/ml,備用。(4)主要試劑的配制①細(xì)胞培養(yǎng)基雜交瘤技術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基主要有RPMI—1640或DMEM(DulbercoModifiedEaglesMedium)兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配好后過濾除菌(0.22口由)，分裝，4℃保存。不完全RPMI—1640培養(yǎng)基：RPMI—1640培養(yǎng)基原液96ml100XL。G.溶液1ml雙抗溶液1ml7.5%NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml不完全口乂￡乂培養(yǎng)基:DMEM13。37g超純水或四蒸水980mlNaHCO33.7g雙抗溶液10ml100XL.G。溶液10ml用1NHCl調(diào)試PH至7.2-7。4,過濾除菌，分裝4℃保存。完全RPMI—1640或DMEM培養(yǎng)基:不完全RPMI—1640或DMEM培養(yǎng)基80ml單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程小牛血清15-20mlHT或以丁培養(yǎng)基:HT培養(yǎng)基HAT培養(yǎng)基完全RPMI—1640或DMEM培養(yǎng)基99ml98mlHT貯存液1ml1mlA貯存液1ml②氨基喋呤6）貯存液（100X,4X10—5mol/L）稱取1076mg氨基喋吟（AminopterinMW440。4），溶于90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再補(bǔ)加超純水或四蒸水至100m1。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存.③次黃嘌吟和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液（100X,H:10-2mo1/L,T:1。6X10-amol/L）稱取136.1mg次黃嘌吟（Hypoxanthine,MW136。1）和38.8mg胸腺喀啶核苷（Thymidine,MW242o2）,加超純水或四蒸水至100ml,置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存.用前可置37℃加溫助溶。④L一谷氨酰胺（L.G.）溶液（100X,0o2mol/L）稱取2.92gL一谷氨酰胺（L-glutamine,MW146.15）,用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4—5ml/瓶），-20℃凍存。⑤青、鏈霉素（雙抗）溶液（100X）取青霉素G（鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g,溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4—5ml/瓶），-20℃凍存。⑥7。5%NaHCO3溶液稱取分析純NaHCOJ.5g,溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。⑦HEPES溶液（1mol/L）稱取23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N,—2-ethanesulfonicacid,N-2單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程—羥乙基哌嗪一N,-2—乙基磺酸，MW238。3)溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶(4—5ml/瓶)，4℃保存。⑧8-氮鳥嘌吟貯存液(100X)稱取200mg8—氮鳥嘌吟(8—azaguanine,MW152.1),加入4mol/LNaOH1ml,待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml,過濾除菌；分裝小瓶，一20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養(yǎng)液中(即終濃度為20ug/ml)。⑨50%PEG稱取PEG1000或400020-508于三角瓶中，蓋緊，60—80℃水浴融化，0.6ml分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘,-20℃存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許7。5%NaHCO3調(diào)PH至8。0,或購買Sigma或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn)品.(5)24孔及96孔培養(yǎng)板等細(xì)胞培養(yǎng)所用材料和試劑.【操作步驟】(1)將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按1:5~1:10比例混合，□加入20?50mlRPMI-1640液。(2)1000r/minX6?10min離心棄上清，將上清盡量吸凈。(3)用手指輕輕擊打離心管底部，使沉淀細(xì)胞分散，將離心管置37℃水浴中。(4)吸取1ml37℃預(yù)溫的50%PEG□緩慢滴入離心管內(nèi)，45秒左右加完，邊加邊輕輕攪拌，37℃靜置1?5min。(5)在5min內(nèi)滴加不完全完全培養(yǎng)液(37℃預(yù)溫)20ml,第一分鐘內(nèi)滴加1ml,第2分鐘2ml,第3分鐘5ml,第4和第5分鐘各6ml,同時應(yīng)邊加邊輕輕地轉(zhuǎn)動離心管，應(yīng)沿管壁滴加，不應(yīng)直接滴加在沉淀細(xì)胞上，以防將剛?cè)诤系募?xì)胞沖開。然后加1640液至50ml使PEG作用終止。800r/minX5?10min離心，棄上清?！鯇⒊恋砑?xì)胞輕輕懸浮于所需容積的HAT培養(yǎng)液中，接種24孔板(每孔1。0-1.5ml)或96孔培養(yǎng)板(每孔0.10—0.15ml)。(8)接種完畢后，將培養(yǎng)板放入37℃5%CO2溫箱中培養(yǎng)。PS：1、凍存的骨髓瘤細(xì)胞在復(fù)蘇后要2周時間才能處于適合于融合的狀態(tài)，培養(yǎng)目標(biāo)是使處于對數(shù)生長的時間盡可能長。2、飼養(yǎng)層細(xì)胞應(yīng)在使的前一天制備好，這樣才能分泌足夠的細(xì)胞因子。三、選擇性培養(yǎng)原理：在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌吟-鳥嘌吟一磷酸單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡.未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌吟-鳥嘌呤一磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡.只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌吟鳥嘌吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖.(1)接種24孔板或96孔板5天后，用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。7-10天后用HT^^養(yǎng)基換出HAT^培養(yǎng)基；(第14天后可用普通完全培養(yǎng)基)。PS：1、經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測.四、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力，通常根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件而定，一般制備單抗的目的決定了篩選克隆所用的方法。由于融合后，細(xì)胞上清份數(shù)多，但每份體積有限，因此ELISA是最適合用于初步篩選的方法.經(jīng)過ELISA篩選出的陽性克隆即可進(jìn)行克隆化，因?yàn)槿绻贿M(jìn)行克隆化，當(dāng)陽性孔有非抗體分泌型的雜交瘤時，非抗體分泌型的雜交瘤由于生長速度更快，將會占主導(dǎo)生長，最終很難分離出目標(biāo)雜交瘤以至丟失.另外雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力.通常在得到針對預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行2—3次克隆化，有時還需進(jìn)行多次?？寺』姆椒ê芏?，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類儀(FACS)分離法。(1)包被將抗原以pH9。6的NaCO3-NaHCO3包被,每塊酶標(biāo)板以5-20ug抗原為宜(如果抗原為多肽或小分子物質(zhì)，則需要加大包被量).每孔的包被體積為50-100ul。37℃包被2h或4℃包被過夜。(2)封閉倒掉抗原，拍干酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，以0。5—1%BSA(用PBST溶解)或5%脫脂牛奶(PBST溶解)或1%明膠(PBST溶解)于37℃封閉2h或4℃封閉過夜，也可以使用10%小牛血清或其它無關(guān)物種血清封閉。封閉完后可立即使用，也可以洗滌一次置于4℃密封保存以備后面使用。(3)一抗封閉完后，棄去孔內(nèi)液體,拍干，加入待檢測細(xì)胞上清，每孔100ul為宜。在每塊板子上做好記號。37℃孵育1h。(4)二抗孵育完一抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，以PBST洗滌3次，每次5min。根據(jù)二抗說明稀釋好二抗，每孔加入100ul。37℃孵育1h。(5)顯色孵育完二抗后，棄去孔內(nèi)液體，拍干，加入顯色劑。待顏色最深時用終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀出各孔OD值,選擇出陽性孔.(1)有限稀釋法從有限稀釋的原理以及影響因素可以知道，其克隆化結(jié)果應(yīng)該是一個修正的泊單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程松分布:標(biāo)準(zhǔn)泊松分布 修正后的沿松分布式中入在有限稀釋里的意義是稀釋時設(shè)計(jì)的每孔細(xì)胞的平均數(shù)，k則代表可能出現(xiàn)的細(xì)胞個數(shù)。材料:a、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等；b、產(chǎn)培養(yǎng)基；c、活力強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞；d、小鼠腹腔細(xì)胞.方法：a、制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）.b、制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2。5、15和50個細(xì)胞3中不同的稀釋度。c、按每毫升加入5義104-1義105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞.d、每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0。2ml,每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為0.5、3和10。e、37℃、7.5%CO2濕潤培養(yǎng)7—10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察,標(biāo)出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測.入取抗體檢測陽性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存.g、本法中“）、（c）、（d）也可簡化為將計(jì)數(shù)后的雜交瘤細(xì)胞準(zhǔn)確地進(jìn)行系列稀釋,直至每毫升含10個細(xì)胞，按每孔接種0.1ml細(xì)胞懸液，即每孔含1個細(xì)胞。（2）軟瓊脂法材料：a、HT1培養(yǎng)基（雙倍濃度）。b、用0.15mol/LNaCl配制的2.0%瓊脂糖:稱取2。0g細(xì)胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于100ml0.15mol/LNaCl,121℃高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4℃保存。c、小鼠腹腔細(xì)胞。d、滅菌平皿。e、45℃水浴。f、活力很好的雜交瘤細(xì)胞。方法：2、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層。b、臨用前將2。0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT1培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45℃水浴中溫育。c、吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml,室溫10分鐘。d、取雜交瘤細(xì)胞懸液標(biāo)八加入1％瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。e、37℃、7。5%濕潤培養(yǎng)7—14天；克隆生長至2mm時，用毛細(xì)吸管吸出克隆,直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板,擴(kuò)大培養(yǎng)。pq.f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存.PS：1、細(xì)胞融合后，一旦鑒定可以產(chǎn)生目標(biāo)抗體，就應(yīng)立即進(jìn)行克隆化，確保能分離出單個細(xì)胞重新形成克隆。單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程2、經(jīng)多次嘗試，確定修正公式中的a值，為以后的實(shí)驗(yàn)提供一個比較穩(wěn)定的經(jīng)驗(yàn)入值。3、應(yīng)在克隆前1天制備好飼養(yǎng)細(xì)胞層.五、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動物體內(nèi)誘生腹水法和體外培養(yǎng)法。1.用20G或22G的注射針，小鼠腹膜內(nèi)注射降植烷,每只鼠0。5?1ml,1周后接種細(xì)胞。2。在175cm2培養(yǎng)瓶中加完全DMEM—10/HEPES/丙酮酸鈉培養(yǎng)液，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，使細(xì)胞生長至對數(shù)期。3。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50ml錐形離心管中，室溫下500g離心5min。.細(xì)胞重懸于50ml無菌的PBS或HBSS（不含F(xiàn)BS）中洗滌.然后室溫下500g離心5min,棄上清。重復(fù)2次，然后細(xì)胞重懸于5ml的PBS或HBSS中。.計(jì)數(shù)細(xì)胞，通過臺盼藍(lán)染色法確定細(xì)胞活力。.用不含F(xiàn)BS的HBSS或PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5X102細(xì)胞/ml。7。用一個10ml的無菌的帶22G針頭的注射器，對裸鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射2ml細(xì)胞,等待腹水形成（1?2周）.8.收獲腹水。（1）一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮膚繃緊。（2）另一只手將一只18G的計(jì)頭插入小鼠腹腔1?2cm深.（3）進(jìn)針部位為左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及腹中線處的主要大血管。（4）令腹水滴入一只無菌的15ml聚丙烯錐形離心管中.9。于室溫下，1500g離心腹水10min,收集上清,棄沉淀，將腹水存放于4℃,直到收集腹水的工作完成（在1周內(nèi)）。10.再次收獲腹水前，讓小鼠再次積累腹水（2?3天），具體操作同步驟8,腹水的加工處理操作同步驟9.重復(fù)這個過程直到再沒有腹水產(chǎn)生可供收集，或者小鼠健康狀況不佳。11。把在幾天內(nèi)收集到的腹水匯集到一起，于56℃水浴45min進(jìn)行熱處理,如果凝塊形成，可用牙簽挑出除之，然后再離心。12。采用適當(dāng)?shù)姆椒z測腹水中的MAb的效價(jià).13。按大于1:10的比例稀釋MAb,并進(jìn)行濾過除菌，濾膜孔徑為0.45um,分裝并凍存于-70℃,避免反復(fù)凍融，可凍存數(shù)年之久。PO：1、腹水含有大量的油脂、巨噬細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、腹腔內(nèi)的上皮細(xì)胞、血液中的細(xì)胞成份等雜質(zhì)，應(yīng)先離心除去這些成份。2、油脂的密度比較小，一般都漂浮在腹水表面，用槍吸出丟掉即可。六、辛酸-硫酸銨兩步沉淀法純化單抗1、原理在酸性條件下（pH4.5）,非IgG的蛋白成份（包括白蛋白，部分Ig）,能被辛酸等單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程短鏈脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要為IgG,再用硫酸銨沉淀上清，即可獲得純度較高的IgG.辛酸/硫酸銨法比硫酸銨法能夠獲得更高純度的IgG.「 血清或腹水+室溫L辛酸沉淀沉淀（白蛋白和其他非IgG俄白質(zhì)）上武液QgG）硫酸筱沉淀I一上消液T沉淀（收口）\ 溶解沉淀透析2、方法（1）將腹水用0。06M醋酸鈉（pH4。0）按1：3稀釋，用1mol/LNaOH調(diào)至血清稀釋液為pH4。5。（2）室溫下邊攪拌（磁力攪拌器或電功攪拌器），邊緩慢滴加辛酸（一般按每毫升稀釋前的腹水加入40ul正辛酸），滴加完后繼續(xù)攪拌30min.（3）4℃靜置2h。（4）4℃100008離心20由加，可見辛酸因溫度低而從系統(tǒng)中結(jié)晶析出漂浮在腹水上層，用多層紗布過濾，棄去此結(jié)晶以及底部沉淀，收集上清夜。（5）向上清中加入1/10體積的10XPBS（0.1M,pH7.4）。（6）4℃條件下，向其中加入飽和硫酸銨溶液，使終濃度為45%飽和度，靜置1h以上。（3）10000g離心10-20min;棄上清，將沉淀溶于適量1XPBS中，再將其裝入透析袋用10mM的tris或PBS透析（透析液應(yīng)為抗體體積的100倍以上，最好攪拌），4℃過夜。（4）收集透析好的抗體，直接現(xiàn)用或加入保護(hù)劑和防腐劑長期保存（一20℃保存或凍干保存）.用這種方法純化出來的抗體純度可達(dá)80-90%左右，損失較少，對抗體的活性損

單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程失也較少，試劑成本低,但是操作比較費(fèi)時。單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)過程3、