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文檔簡介
第十六章與微生物有關的藥物制劑
抗生素維生素氨基酸酶及酶抑制劑
低成本、高質量的藥物
第一節(jié)抗生素
目前從自然界發(fā)現(xiàn)和分離的抗生素已達10,000多種,實際應用于生產(chǎn)和醫(yī)療上的抗生素約有一百多種,連同各種半合成衍生物及其鹽類共約三百種。抗生素是指青霉素、鏈霉素等一類化合物的總稱,是人類控制、治療感染性疾病,保障身體健康及用來防治動植物災害的重要化合物。原始含義:是指那些由微生物產(chǎn)生的、能抑制其微生物生長的物質。習慣上:將那些由微生物產(chǎn)生的,極微量即具有選擇性地抑制其他微生物或腫瘤細胞的天然有機化合物稱為抗生素。
一、抗生素的概念和分類
(一)抗生素的概念
抗生素是生物(包括微生物、植物和動物)在其生命活動過程中所產(chǎn)生的(或有其他方法獲得的),能在低濃度下選擇性地抑制或影響他種生物功能的有機物質。(二)抗生素的分類
1、根據(jù)抗生素的生物來源分類
2、根據(jù)抗生素的化學結構分類
3、根據(jù)抗生素的作用機制分類
4、根據(jù)抗生素的作用對象分類
二、醫(yī)療用抗生素的基本要求1.差異毒力大2、生物活性強3、有不同的抗菌譜4、不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性
三、尋找新抗生素的基本程序絕大多數(shù)抗生素的原始產(chǎn)生菌是從自然界分離篩選獲得,以傳統(tǒng)的分離土壤放線菌為例,說明新抗生素產(chǎn)生菌的常規(guī)分離和篩選過程。
(一)土壤微生物的分離
1、采土以春、秋兩季采土為宜。去除表土,采取5-10cm深處的土壤,裝入無菌容器。
2、分離菌株將2-4克土壤均勻散布水中待其沉降,上清部分經(jīng)適當稀釋后(一般為10-3-104),涂布于適宜培養(yǎng)基中,并培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn),挑取單個菌落移種純培養(yǎng),根據(jù)菌落的特征,初步排除相同菌。
(二)篩選是指從大量待篩選微生物中,盡快地鑒別出有實用價值的抗生素產(chǎn)生菌的實驗過程。
1、篩選模型:
是指篩選工作中所使用的實驗菌。為了避免感染病原菌的危險,盡可能選用非致病的、且能代表某些類型致病菌的微生物作為實驗菌。
表17-1常用的實驗菌和代表的致病微生物
實驗菌代表的致病微生物
金黃色葡萄球菌革蘭陽性球菌枯草芽孢桿菌革蘭陽性桿菌恥垢分支桿菌結核分枝桿菌大腸埃希菌革蘭陰性桿菌白假絲酵母菌酵母狀真菌曲霉絲狀真菌噬菌體病毒、腫瘤細胞
2、篩選方法
抗菌抗生素一般采用瓊脂擴散法。先制備含實驗菌的平板,然后以無菌濾紙片蘸取各放線菌的搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液或切取一定大小的放線菌瓊脂培養(yǎng)塊,置于含菌平板上,培養(yǎng)后觀察有無抑菌圈產(chǎn)生。
(三)早期鑒別
經(jīng)過篩選的陽性菌應進一步做抗菌譜和抗藥譜的測定,對有價值的產(chǎn)生菌必須從產(chǎn)生菌及自該菌產(chǎn)生的抗生素兩方面進行鑒定。
1、抗生素產(chǎn)生菌的鑒別
通過形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應等實驗對抗生素產(chǎn)生菌進行初步的分類鑒定。
2、抗生素的鑒別常用理化方法如:紙層析法測定抗生素的極性和在各種溶媒中的溶解度。紙電泳法判斷抗生素是酸性、堿性、中性或兩性。
薄層層析法、高效液相層析法、紫外分光光度法等方法測定新抗生素的理化性質和結構。
(四)分離精制將可能產(chǎn)生新抗生素的放線菌進行擴大培養(yǎng),然后選擇合適的方法從培養(yǎng)液中提取有效抗生素,進一步精制純化。在此過程中,須跟綜測定抗生素的生物活性。
(五)臨床前實驗研究如:進行動物毒性實驗(急性、亞急性、慢性)動物治療保護性實驗臨床前藥效實驗和藥理實驗(抗生素在體內吸收、分布、排泄),經(jīng)系列實驗認為確有前途的新抗生素經(jīng)有關部門審查合格后方可進行臨床實驗。國家制定了《藥品臨床前研究質量管理規(guī)范》,(簡稱GLP)。
(六)臨床實驗
《藥品臨床實驗管理規(guī)范》簡稱GCP,是臨床實驗的全過程,包括方案設計、組織實施、監(jiān)視、審核、記錄、分析、總結和報告的標準。四、抗生素的制備概況
抗生素的制備分為發(fā)酵和提取兩個階段。
抗生素的發(fā)酵:是指抗生素產(chǎn)生菌在一定培養(yǎng)基條件下生物合成抗生素的過程,該過程又分為菌體生長和抗生素生物合成兩個部分。發(fā)酵后存在于發(fā)酵液中的抗生素需用一系列物理和化學方法進行提取和精制,得到抗生素成品??股厣a(chǎn)大致分為二個階段:發(fā)酵和提取一般流程如下:
菌種→孢子制備→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預處理及壓濾→提取及精制→成品檢驗→成品包裝
一、發(fā)酵階段
(一)現(xiàn)代抗生素發(fā)酵的一般特點
1、需氧發(fā)酵抗生素產(chǎn)生菌多為需氧菌,需要在發(fā)酵的過程中不斷通入無菌空氣,并進行機械攪拌,以提供足夠氧來進行生物代謝和生物合成。
2、深層發(fā)酵(或為沉沒發(fā)酵),在大型發(fā)酵罐內進行,可進行較大規(guī)模的生產(chǎn)。
3、純種發(fā)酵在純種培養(yǎng)的抗生素發(fā)酵工業(yè)中,應防止雜菌及噬菌體污染。(二)一般生產(chǎn)流程
抗生素發(fā)酵階段一般主要包括:孢子制備、種子制備和發(fā)酵,這是進行微生物逐步擴大培養(yǎng)過程。
1、孢子制備目的是將沙土管保存的菌種進行培養(yǎng),以制備大量孢子供下一步種子制備之用,一般于試管、扁瓶或搖瓶內進行。
2、種子制備目的是使有限數(shù)量的孢子發(fā)芽繁殖,獲得足夠菌絲體以供發(fā)酵之用。在種子罐內進行。通過種子制備,可以縮短發(fā)酵罐內菌絲體繁殖生長的時間,增加抗生素合成的時間。一般通過種子罐1-3次,再移種到發(fā)酵罐中,分別為二級、三級和四級發(fā)酵。
3、發(fā)酵關鍵階段目的是在人工培養(yǎng)條件下使菌絲體產(chǎn)生大量的抗生素。在發(fā)酵罐內進行。發(fā)酵注意事項:
1)無菌操作污染雜菌主要是種子和空氣過濾系統(tǒng)污染,各部件滲漏及操作。在發(fā)酵的各階段應取樣進行雜菌檢查。
2)營養(yǎng)需要發(fā)酵培養(yǎng)基應供給微生物生產(chǎn)繁殖以及生物合成所需的營養(yǎng),其原料應盡可能價廉,來源要廣。
3)pH值:加入使培養(yǎng)基pH值恒定的化合物:硫酸銨、硝酸鈉。
4)溫度酶的催化需要合適的溫度??赏ㄟ^罐的夾套或蛇管導入冷水或熱水以控制罐溫。
5)前體前體→是抗生素分子的前身或其組成的一部分,直接參與抗生素的生物合成而自身無顯著變化。在一定條件下,加入前體可控制抗生素的合成方向,并增加產(chǎn)量。如:在青霉素G的生產(chǎn)中常加入苯乙酸或苯乙酰胺作為前體;在紅霉素生產(chǎn)中添加丙酸、丙醇鹽作為前體。但前體一般對產(chǎn)生菌有一定的毒性。
6)通氣、攪拌及消沫發(fā)酵過程中利用溶解氧,因此必須不斷經(jīng)空氣過濾系統(tǒng)輸入無菌空氣,同時在發(fā)酵罐內設置攪拌和擋板以增加通氣效果。為防止泡沫造成的逃液和滲漏,需用消沫漿或消沫劑。7)發(fā)酵終點判斷定期取樣,測定抗生素含量、發(fā)酵液的pH值、含糖量和含氮量、菌絲含量及形態(tài)觀察。放罐應在產(chǎn)量的高峰期,過早或過遲都會影響抗生素含量。二、發(fā)酵液預處理及提取階段
預處理時應盡可能使抗生素轉入以后要處理的相中(多數(shù)是液相),可用調節(jié)pH值呈酸性或堿性的方法。預處理的主要任務是除去發(fā)酵液內的雜質(Ca、Mg、Fe)及蛋白質,并經(jīng)過過濾,使菌絲與濾液分開,便于進一步提取。常用的提取方法主要有四類:
1、溶媒萃取法是用一種溶劑將物質從另一種溶劑中提取出來的方法,這兩種溶劑不能互溶或只部分互溶,能形成便于分離的兩相。目前微生物制藥生產(chǎn)中常用的提取方法。先進的萃取設備:ABE-216萃取機
2、離子交換法離子樹脂交換法是應用離子交換樹脂作為吸附劑,將發(fā)酵液中物質選擇性地吸附至離子交換樹脂上,然后用合適的洗脫劑將抗生素從樹脂上洗脫下來,達到分離、濃縮、提純的目的。由于費用較低,成為提取主要方法。如:鏈霉素和卡那霉素的生產(chǎn)。
3、沉淀法是利用等電點或能與酸、堿、金屬鹽類形成不溶性或溶解度極小的復鹽沉淀出抗生素。此法簡便、經(jīng)濟。如:四環(huán)素4、吸附法是利用適當?shù)奈絼?,在一定的PH條件下,使發(fā)酵液中抗生素被吸附劑吸附,然后再以適當?shù)南疵搫⑽降目股貜奈絼┥舷疵撓聛?,達到濃縮和提純目的。隨著大網(wǎng)格聚合物吸附劑的合成成功,吸附法得到新的發(fā)展。
抗生素提取得到粗品后應加以精制,上述方法均可使用。一般用多級溶劑萃取或多級吸附、洗脫或薄層層析、柱層法、葡聚糖凝膠過濾等。因一般抗生素的穩(wěn)定性差,應避免常壓蒸餾、升華、過酸或過堿等方法。五、抗生素的效價和單位
一、抗生素的效價和單位抗生素是一種生物活性物質,可以利用抗生素對生物所起作用的強弱來判定抗生素的含量。含量通常用效價或單位表示。有時二者合稱效價單位。
效價(potency):指在同一條件下比較抗生素的檢品和標準品的抗菌活性,從而得出檢品的效價。即效價是檢品的實際單位數(shù)與其標準量的比值。常用百分數(shù)表示。
單位(unit,u)是衡量抗生素有效成分的具體尺度。有以下幾種:
1、重量單位以抗生素的生物活性部分的重量作為單位。1mg=1000單位(u),對于不同鹽類的同一抗生素,只要它們的單位相同,即使鹽類重量不同,其實際有效含量是一致的。如:鏈霉素硫酸鹽、土霉素鹽酸鹽、新霉素鈉(鉀)鹽等以重量單位表示。
2、類似重量單位是以特定的抗生素鹽類純品的重量為單位,包括非活性部分重量如:純金霉素鹽酸鹽及四環(huán)素鹽酸鹽,1微克=1單位。
3、重量折算單位以原始的生物活性單位相當?shù)膶嶋H重量為1單位加以折算。
如:青霉素最初確定一個青霉素單位系指在50ml肉湯培養(yǎng)基內完全抑制金黃色葡萄球菌生長的最小青霉素量為1單位。青霉素純化后,這個量相當于青霉素G鈉鹽0.5988微克,因而國際上一致規(guī)定:0.5988微克為1單位,則1mg=1670單位。
4、特定單位以特定的一批抗生素樣品的某一重量作為一定單位,經(jīng)有關的國家機構認可而定。如:特定的一批菌肽1mg=3000單位標準品與國際單位(internationalunit,IU)
標準品:是指與商品同質的、純度較高的抗生素,每毫克含有一定量的單位,可供作測定效價的標準。經(jīng)國際協(xié)議,每毫克含一定量的標準品稱為國際標準品,其單位即為國際單位。
抗生素的國際標準品是在聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織的生物檢定專家委員會的主持下,委托指定的機構(主要是英國國立生物標準檢定所)組織標定、保管和分發(fā).
我國的國家標準品由衛(wèi)生部藥品生物檢定所檢定和分發(fā)。
標示量:抗生素制劑標簽上的標示量原則上以重量表示(指重量單位),但少數(shù)成分不清的抗生素(如制霉菌素),或照顧用藥習慣(如青霉素),仍沿用單位表示.六、細菌的抗藥性常見的臨床致病菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、大腸埃希菌、志霍菌屬等抗藥情況突出。所引起的各種感染已成為臨床治療上的一大難題。
(一)抗藥性的基本概念
抗藥性(drugresistance):
指在微生物或腫瘤細胞多次與藥物接觸發(fā)生敏感性降低的現(xiàn)象,是微生物對藥物所具有的相對抗性??顾幮缘某潭纫话阋栽撍帉δ撤N微生物的最小抑菌濃度來衡量。
有些微生物由于具有一些獨特的結構或代謝,天生對藥物不敏感,根據(jù)抗藥性的概念,就不能稱之為抗藥性,這種現(xiàn)象可稱為天然不敏感性(過去稱為固有抗藥性)。如:銅綠假單胞菌對多種藥物不敏感。
微生物個體對原來敏感的抗生素通過遺傳性的改變而獲得了抗藥性,可稱之為獲得抗藥性,常常是臨床上不合理用藥或長期用藥之后表現(xiàn)出的抗藥性。
多重抗藥性:
指某一些微生物可同時對兩種以上作用機制不同的藥物所產(chǎn)生的抗藥性,也稱為多劑抗藥性,這是由于多重抗藥性菌株的遺傳物質上帶有多種抗藥性基因。
交叉抗藥性:有些微生物對結構類似或作用機制類似的抗生素均有抗藥性的現(xiàn)象。賴藥性:由于基因突變而致的抗藥性,不僅對該藥具有抗性,而且需要該藥物作為特殊營養(yǎng)因素,這種現(xiàn)象稱為賴藥性。
耐受性(tolerance):有一些微生物對藥物抑菌作用的敏感性未改變,而對藥物的殺菌作用具有相對抗性,即該菌在最低抑菌濃度時仍受到抑制,但最小殺菌濃度提高,抗生素此時表現(xiàn)的是抑菌,而不是殺菌作用,這種現(xiàn)象稱為耐受性。(二)抗藥性產(chǎn)生的遺傳學機制
微生物對藥物的抗藥性可由染色體或質粒,或兩者兼有介導。大多數(shù)抗藥性由質粒編碼,少數(shù)由染色體編碼。產(chǎn)生抗藥性的原因可能是染色體或質粒上帶有與抗藥性有關的基因。如:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,帶有一種與抗藥性相關的mecA基因。有些具有多重抗藥性的菌株,可能含有兩個以上的抗藥質粒,或其抗藥質粒上可能含有多個抗藥基因。
1、自發(fā)突變加藥物選擇一般認為,抗藥菌所含的抗藥基因是由敏感菌的遺傳物質自發(fā)突變產(chǎn)生的,但突變率極低,在10-10-10-6。極少量的抗藥菌存在于大量的敏感菌不足為害,但經(jīng)臨床頻繁使用抗生素后,藥物殺死或抑制敏感菌的生長,而抗藥性細菌繼續(xù)生長繁殖,無形中對抗藥菌起了選擇作用,造成抗藥菌株的大量增殖,形成抗藥菌系。許多實驗證明,抗藥性的產(chǎn)生不是由于微生物與藥物接觸而產(chǎn)生的,而是自發(fā)突變加上藥物選擇的結果。
2、細胞間抗藥性的基因轉移染色體上的抗藥性可以通過三種機制由一個細菌傳遞到另一個細菌:
1)接合帶有抗藥性基因的質粒可自行復制,代代相傳,并在不同種屬間(特別是腸道)進行轉移,而導致抗藥性的廣泛散播。如:1958年日本爆發(fā)痢疾大流行發(fā)現(xiàn):攜帶黃胺、四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素等抗藥基因的大腸埃希菌在腸道內通過接合將多種抗藥性基因轉移給痢疾桿菌,從而抗藥性的散播。
2)轉導通過噬菌體將細菌染色體片段由供體菌株向受體菌株轉移。當轉導片段中含有抗藥性的遺傳因子時,轉導將導致抗藥性的傳播。但頻率不高。
3)轉化不重要
4)一些微生態(tài)制劑的活菌細胞中可能攜帶有一定的抗藥性基因,由于廣泛大量地被服用,也可能造成抗藥性的傳播。
5)轉座子在細胞間抗藥性的基因轉移中,起重要作用。(三)抗藥性產(chǎn)生的生物化學機制
是指抗藥菌遺傳學上的改變在生物化學上的表現(xiàn)。主要有三方面:
1、產(chǎn)生使抗生素結構改變的酶(即鈍化酶)
2、抗生素作用靶位的修飾
3、細胞膜通透性改變
(四)抗藥性的控制
1、合理使用抗生素不必使用抗生素時盡可能不用,防止交叉抗藥性。同時注意聯(lián)合用藥,因每一種藥物在代謝過程中發(fā)生作用的部位不同,聯(lián)合服用兩種藥物可起到協(xié)同作用。
2、尋找新藥尋找具有新的化學結構的新抗生素以及新的酶抑制劑,改造現(xiàn)有的抗生素(包括對現(xiàn)有的產(chǎn)生菌和抗生素的改造)。目前半合成抗生素的使用己成為克服抗藥性的主要途徑。
3、加強抗藥機制的研究研究抗藥機制,有助于了解細菌抗藥性的本質,有效地控制細菌感染。第二節(jié)維生素
一、維生素C
維生素c的生產(chǎn)方法有化學合成法、化學合成與生物轉化并用的半合成法。
20世紀70年代,我國為簡化工藝,研究成功了采用微生物法使L—山梨醇轉化生成2—酮
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