第二章 目的基因(三)

第二章植物基因工程中的目的基因植物基因工程（三）植物抗真、細菌病害、抗逆基因上節(jié)知識點回顧抗植物病毒基因工程中常用的技術(shù)路線。CP基因抗病毒的原理。病毒衛(wèi)星RNA。缺陷干擾顆粒。1.植物抗真菌病害基因植物防衛(wèi)反應：

增強細胞壁結(jié)構(gòu)：

富含羥脯氨酸糖蛋白和富含甘氨酸蛋白；木質(zhì)素

誘導產(chǎn)生或激活抗菌物質(zhì)：

硫堇，植物抗毒素，幾丁質(zhì)酶，PR蛋白小麥銹病

梨黑星病

1.1幾丁質(zhì)酶基因

幾丁質(zhì)酶抑菌機制

植物病原真菌的細胞壁主要成分之一是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)酶通過破壞菌絲尖端新合成的幾丁質(zhì)而抑制病原菌的生長。病原真菌細胞壁中幾丁質(zhì)的降解不僅破壞細胞新物質(zhì)的沉積，使病原體死亡，而且產(chǎn)生的細胞壁碎片可以刺激寄主植物產(chǎn)生抗病反應。

幾丁質(zhì)酶屬于PR蛋白，在植物中含量低，受病原菌誘導，沒有病原特異性，是由宿主的反應類型決定的，在進化上相對保守。幾丁質(zhì)酶的利用策略直接應用，將酶直接施與農(nóng)田，以保護植物免受土壤真菌的侵染將幾丁質(zhì)酶基因引入根圍細菌，使該工程菌表達分泌幾丁質(zhì)酶將基因?qū)胫参?，使轉(zhuǎn)基因植物表達幾丁質(zhì)酶。

現(xiàn)在已經(jīng)對許多微生物和植物的幾丁質(zhì)酶基因進行了分離，克隆，測序和轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株中幾丁質(zhì)酶增加，抗病性增加。1.2植物抗毒素基因

植物抗毒素：亦稱植保素，是植物受侵染后產(chǎn)生的一類低分子抗菌化合物，具有種屬特異性。

現(xiàn)已鑒定的植保素達200多種，以類黃酮與類萜類植保素研究最多。植保素的產(chǎn)生速度、累積含量與植物的抗病性有著密切的關(guān)系。1.3過氧化物酶基因苯丙烷代謝是一條和多種生理功能密切相關(guān)的代謝途徑。該途徑的產(chǎn)物在植物抗病反應中起著重要作用。（預防性抗菌物質(zhì)、誘導性抗病物質(zhì)、防御屏障）

過氧化物酶催化苯基類丙烷醇脫氫聚合最終形成木質(zhì)素，將該酶的編碼基因和35s啟動子連接轉(zhuǎn)入煙草，顯著提高了煙草對霜霉病的抗性。1.4SAR抗病基因SAR概念：系統(tǒng)獲得抗病系統(tǒng)，由病原侵染激發(fā)，可持續(xù)及對隨后同種病原體甚至不同種的其他病原體的侵染均能表現(xiàn)出系統(tǒng)性的抗病性。水楊酸（SA）：一種信號分子，SA介導植物保護反應是由于一組復雜的植物保護機制被SA激活所致。（足夠的SA含量+有效的信號感知和轉(zhuǎn)導途徑）。過氧化氫酶：在病原菌與寄主識別反應的早期就會積累的過氧化氫酶是SA的結(jié)合蛋白，該酶基因的過表達能夠增加馬鈴薯抵抗病原菌的能力。2.抗植物細菌病害基因全世界馬鈴薯每年因細菌病害減產(chǎn)25%，約40億美元。

1845-1860年馬鈴薯晚疫病導致愛爾蘭饑荒。

1970年玉米大斑病再次引起全球驚慌。2.1病原菌自身的抗性基因

原理：將病原菌基因?qū)胫参锛毎?，使其過量表達，或表達失去原有功能的蛋白，或表達失去原有的時空性，從而干擾病原菌的正常生理代謝，以致寄主植物表現(xiàn)出抗性。

菜豆毒素是菜豆假單胞菌中重要的治病因子，作用機制是抑制植物鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（OCTase）的活性。菌體本身存在抗菜豆毒素的OCTase，將編碼該酶的基因?qū)霟煵莺?，獲得的煙草轉(zhuǎn)基因植株在接種菜豆毒素后不表現(xiàn)系統(tǒng)病癥。轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯2.2溶菌酶基因及其應用溶菌酶（lysozyme）存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化細菌細胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖與N-乙酰胞壁酸之間的1，4-β-糖苷鍵水解的酶。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。3.抗非生物脅迫基因脅迫：指對植物生存和生長不利的各種環(huán)境因素的總和。分為生物脅迫和非生物脅迫。風、雨、雪、聲、磁、電化學因素鹽類、離子、氣體、除草劑等輻射紅外光可見光紫外光離子輻射水澇干旱溫度低溫高溫冷害凍害蘇鐵凍害農(nóng)田雜草叢生香蕉除草劑藥害農(nóng)田雜草叢生玉米除草劑藥害限制除草劑應用的重要因素：除草劑藥害3.1耐除草劑基因

主要為轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花、油菜，5860萬hm2，約占全世界轉(zhuǎn)基因作物的72%解決除草劑對農(nóng)作物傷害的途徑（二）育種

1.雜交育種：將野草植物的除草劑的抗性引入栽培品種中；

2.遺傳工程育種：組培或細胞培養(yǎng)結(jié)合理化誘變

基因工程手段（一）應用對農(nóng)作物傷害小的除草劑耐除草劑基因工程策略：靶蛋白改造；引入酶系統(tǒng)3.1.1靶蛋白抗性基因及其應用（1）抗EPSPS抑制劑基因及其應用EPSPS：草甘膦（glyphosate）是一種施用于葉片的廣譜、非選擇性的有機磷類除草劑。草甘膦特異性地抑制植物和細菌中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途徑中的一個酶，對植物正常發(fā)育起著重要作用。EPSPS過量表達EPSPS靶蛋白突變（2）抗ALS抑制劑基因及其應用ALS：乙酰乳酸合成酶?；酋ｋ孱惓輨┩ㄟ^抑制支鏈氨基酸合成過程中的一個關(guān)鍵酶ALS來表現(xiàn)其除草劑作用。植物中ALS對磺酰脲類除草劑的抑制作用相當敏感。

ALS的靶點突變體在自然界普遍存在，ALS基因上許多位點可以產(chǎn)生突變體并賦予抗性。將擬南芥中的抗除草劑基因（ALS基因突變基因）導入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草對磺酰脲類除草劑敏感性下降了約1000倍。3.1.1靶蛋白抗性基因及其應用

有許多不同的酶系統(tǒng)對除草劑有降解的作用，這些酶系統(tǒng)存在于作物、雜草和微生物中。

降解抗性可能涉及多于一種基因或物質(zhì)參與，分離對除草劑有降解作用的基因較困難。但是降解系統(tǒng)產(chǎn)生的對除草劑的抗性的專一性強、效率高、負效應小。3.1.2除草劑的降解和解毒基因及其應用

（1）乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶基因及其應用

乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶具有使除草劑草丁膦失活的作用。在CoA存在的情況下，乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶催化乙酰CoA與草丁膦的游離氨基酸結(jié)合，使L-草丁膦轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴?L-草丁膦，從而失去除草劑活性。

從鏈霉菌中分離到乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因（bar）轉(zhuǎn)入煙草、馬鈴薯和番茄中，獲得抗Basta的植株，而且產(chǎn)量不受影響。3.1.2除草劑的降解和解毒基因及其應用（2）超氧化物酶歧化酶基因許多除草劑（百草枯）在植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧并氧化植物細胞質(zhì)膜而導致植物死亡。把高效啟動子控制下的SOD基因?qū)胫参?，可以提高植物的抗逆性?.1.2除草劑的降解和解毒基因及其應用降解或解毒策略可以作為修飾或過表達靶蛋白的一個有價值的替代方法。解毒酶基因還可能賦予植物對多種除草劑的耐性。

抑制植物對除草劑的吸收和轉(zhuǎn)運具有很大前景，但是還是一種設(shè)想。3.2抗其他非生物脅迫的基因第一類基因編碼產(chǎn)物是在植物的抗性中直接起保護作用的蛋白質(zhì)。1.合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的關(guān)鍵酶類，2.具有解毒作用的酶，3.保護生物大分子及膜結(jié)構(gòu)的蛋白，4.具保護作用的蛋白酶，5.水通道蛋白。第二類基因編碼的產(chǎn)物是在信號轉(zhuǎn)導和逆激基因表達過程中起調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)因子。1.傳遞信號和調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，2.感應和轉(zhuǎn)導脅迫信號的蛋白激酶，3.與第二信使生成有關(guān)的酶。3.2.1滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)：植物在高鹽或干旱條件下，為了消除脅迫所造成的傷害，維持滲透平衡和體內(nèi)水分，在細胞中產(chǎn)生和積累的一些小分子化合物。氨基酸衍生物，脯氨酸、甜菜堿；糖類，海藻糖、果聚糖，多醇類。其中海藻糖、甜菜堿是次生代謝產(chǎn)物。3.2.2保護生物大分子及膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基因（1）抗凍蛋白基因抗凍蛋白（antifreezeprotein，AFP）：指能降低冰點和減少冰晶生長速度的蛋白質(zhì)。

用魚類AFP處理植物組織細胞，可以減少細胞冰晶生長，降低冰凍溫度。

表達黃蓋鰈AFP基因的番茄和煙草的轉(zhuǎn)基因植株抗凍性增加。熒光抗凍蛋白裝飾的冰晶體（2）胚胎發(fā)生后期富集蛋白基因3.2.2保護生物大分子及膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基因

胚胎發(fā)生后期富集蛋白（lateembryogenesisabundantprotein，LEA）：出現(xiàn)在胚發(fā)后期，隨種子脫水成熟其含量增加，具有高度的親水性，是植物能夠在水分虧缺時，保持膜系統(tǒng)及生物大分