第二章 目的基因(三)

第二章植物基因工程中的目的基因植物基因工程（三）植物抗真、細(xì)菌病害、抗逆基因上節(jié)知識(shí)點(diǎn)回顧抗植物病毒基因工程中常用的技術(shù)路線。CP基因抗病毒的原理。病毒衛(wèi)星RNA。缺陷干擾顆粒。1.植物抗真菌病害基因植物防衛(wèi)反應(yīng)：

增強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)：

富含羥脯氨酸糖蛋白和富含甘氨酸蛋白；木質(zhì)素

誘導(dǎo)產(chǎn)生或激活抗菌物質(zhì)：

硫堇，植物抗毒素，幾丁質(zhì)酶，PR蛋白小麥銹病

梨黑星病

1.1幾丁質(zhì)酶基因

幾丁質(zhì)酶抑菌機(jī)制

植物病原真菌的細(xì)胞壁主要成分之一是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)酶通過(guò)破壞菌絲尖端新合成的幾丁質(zhì)而抑制病原菌的生長(zhǎng)。病原真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的降解不僅破壞細(xì)胞新物質(zhì)的沉積，使病原體死亡，而且產(chǎn)生的細(xì)胞壁碎片可以刺激寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。

幾丁質(zhì)酶屬于PR蛋白，在植物中含量低，受病原菌誘導(dǎo)，沒(méi)有病原特異性，是由宿主的反應(yīng)類(lèi)型決定的，在進(jìn)化上相對(duì)保守。幾丁質(zhì)酶的利用策略直接應(yīng)用，將酶直接施與農(nóng)田，以保護(hù)植物免受土壤真菌的侵染將幾丁質(zhì)酶基因引入根圍細(xì)菌，使該工程菌表達(dá)分泌幾丁質(zhì)酶將基因?qū)胫参?，使轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)幾丁質(zhì)酶。

現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)許多微生物和植物的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了分離，克隆，測(cè)序和轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株中幾丁質(zhì)酶增加，抗病性增加。1.2植物抗毒素基因

植物抗毒素：亦稱植保素，是植物受侵染后產(chǎn)生的一類(lèi)低分子抗菌化合物，具有種屬特異性。

現(xiàn)已鑒定的植保素達(dá)200多種，以類(lèi)黃酮與類(lèi)萜類(lèi)植保素研究最多。植保素的產(chǎn)生速度、累積含量與植物的抗病性有著密切的關(guān)系。1.3過(guò)氧化物酶基因苯丙烷代謝是一條和多種生理功能密切相關(guān)的代謝途徑。該途徑的產(chǎn)物在植物抗病反應(yīng)中起著重要作用。（預(yù)防性抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)性抗病物質(zhì)、防御屏障）

過(guò)氧化物酶催化苯基類(lèi)丙烷醇脫氫聚合最終形成木質(zhì)素，將該酶的編碼基因和35s啟動(dòng)子連接轉(zhuǎn)入煙草，顯著提高了煙草對(duì)霜霉病的抗性。1.4SAR抗病基因SAR概念：系統(tǒng)獲得抗病系統(tǒng)，由病原侵染激發(fā)，可持續(xù)及對(duì)隨后同種病原體甚至不同種的其他病原體的侵染均能表現(xiàn)出系統(tǒng)性的抗病性。水楊酸（SA）：一種信號(hào)分子，SA介導(dǎo)植物保護(hù)反應(yīng)是由于一組復(fù)雜的植物保護(hù)機(jī)制被SA激活所致。（足夠的SA含量+有效的信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑）。過(guò)氧化氫酶：在病原菌與寄主識(shí)別反應(yīng)的早期就會(huì)積累的過(guò)氧化氫酶是SA的結(jié)合蛋白，該酶基因的過(guò)表達(dá)能夠增加馬鈴薯抵抗病原菌的能力。2.抗植物細(xì)菌病害基因全世界馬鈴薯每年因細(xì)菌病害減產(chǎn)25%，約40億美元。

1845-1860年馬鈴薯晚疫病導(dǎo)致愛(ài)爾蘭饑荒。

1970年玉米大斑病再次引起全球驚慌。2.1病原菌自身的抗性基因

原理：將病原菌基因?qū)胫参锛?xì)胞，使其過(guò)量表達(dá)，或表達(dá)失去原有功能的蛋白，或表達(dá)失去原有的時(shí)空性，從而干擾病原菌的正常生理代謝，以致寄主植物表現(xiàn)出抗性。

菜豆毒素是菜豆假單胞菌中重要的治病因子，作用機(jī)制是抑制植物鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶（OCTase）的活性。菌體本身存在抗菜豆毒素的OCTase，將編碼該酶的基因?qū)霟煵莺螅@得的煙草轉(zhuǎn)基因植株在接種菜豆毒素后不表現(xiàn)系統(tǒng)病癥。轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯2.2溶菌酶基因及其應(yīng)用溶菌酶（lysozyme）存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖與N-乙酰胞壁酸之間的1，4-β-糖苷鍵水解的酶。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。3.抗非生物脅迫基因脅迫：指對(duì)植物生存和生長(zhǎng)不利的各種環(huán)境因素的總和。分為生物脅迫和非生物脅迫。風(fēng)、雨、雪、聲、磁、電化學(xué)因素鹽類(lèi)、離子、氣體、除草劑等輻射紅外光可見(jiàn)光紫外光離子輻射水澇干旱溫度低溫高溫冷害凍害蘇鐵凍害農(nóng)田雜草叢生香蕉除草劑藥害農(nóng)田雜草叢生玉米除草劑藥害限制除草劑應(yīng)用的重要因素：除草劑藥害3.1耐除草劑基因

主要為轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花、油菜，5860萬(wàn)hm2，約占全世界轉(zhuǎn)基因作物的72%解決除草劑對(duì)農(nóng)作物傷害的途徑（二）育種

1.雜交育種：將野草植物的除草劑的抗性引入栽培品種中；

2.遺傳工程育種：組培或細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合理化誘變

基因工程手段（一）應(yīng)用對(duì)農(nóng)作物傷害小的除草劑耐除草劑基因工程策略：靶蛋白改造；引入酶系統(tǒng)3.1.1靶蛋白抗性基因及其應(yīng)用（1）抗EPSPS抑制劑基因及其應(yīng)用EPSPS：草甘膦（glyphosate）是一種施用于葉片的廣譜、非選擇性的有機(jī)磷類(lèi)除草劑。草甘膦特異性地抑制植物和細(xì)菌中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途徑中的一個(gè)酶，對(duì)植物正常發(fā)育起著重要作用。EPSPS過(guò)量表達(dá)EPSPS靶蛋白突變（2）抗ALS抑制劑基因及其應(yīng)用ALS：乙酰乳酸合成酶?；酋ｋ孱?lèi)除草劑通過(guò)抑制支鏈氨基酸合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶ALS來(lái)表現(xiàn)其除草劑作用。植物中ALS對(duì)磺酰脲類(lèi)除草劑的抑制作用相當(dāng)敏感。

ALS的靶點(diǎn)突變體在自然界普遍存在，ALS基因上許多位點(diǎn)可以產(chǎn)生突變體并賦予抗性。將擬南芥中的抗除草劑基因（ALS基因突變基因）導(dǎo)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)磺酰脲類(lèi)除草劑敏感性下降了約1000倍。3.1.1靶蛋白抗性基因及其應(yīng)用

有許多不同的酶系統(tǒng)對(duì)除草劑有降解的作用，這些酶系統(tǒng)存在于作物、雜草和微生物中。

降解抗性可能涉及多于一種基因或物質(zhì)參與，分離對(duì)除草劑有降解作用的基因較困難。但是降解系統(tǒng)產(chǎn)生的對(duì)除草劑的抗性的專一性強(qiáng)、效率高、負(fù)效應(yīng)小。3.1.2除草劑的降解和解毒基因及其應(yīng)用

（1）乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用

乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶具有使除草劑草丁膦失活的作用。在CoA存在的情況下，乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶催化乙酰CoA與草丁膦的游離氨基酸結(jié)合，使L-草丁膦轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴?L-草丁膦，從而失去除草劑活性。

從鏈霉菌中分離到乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因（bar）轉(zhuǎn)入煙草、馬鈴薯和番茄中，獲得抗Basta的植株，而且產(chǎn)量不受影響。3.1.2除草劑的降解和解毒基因及其應(yīng)用（2）超氧化物酶歧化酶基因許多除草劑（百草枯）在植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧并氧化植物細(xì)胞質(zhì)膜而導(dǎo)致植物死亡。把高效啟動(dòng)子控制下的SOD基因?qū)胫参铮梢蕴岣咧参锏目鼓嫘浴?.1.2除草劑的降解和解毒基因及其應(yīng)用降解或解毒策略可以作為修飾或過(guò)表達(dá)靶蛋白的一個(gè)有價(jià)值的替代方法。解毒酶基因還可能賦予植物對(duì)多種除草劑的耐性。

抑制植物對(duì)除草劑的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)具有很大前景，但是還是一種設(shè)想。3.2抗其他非生物脅迫的基因第一類(lèi)基因編碼產(chǎn)物是在植物的抗性中直接起保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。1.合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的關(guān)鍵酶類(lèi)，2.具有解毒作用的酶，3.保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)的蛋白，4.具保護(hù)作用的蛋白酶，5.水通道蛋白。第二類(lèi)基因編碼的產(chǎn)物是在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆激基因表達(dá)過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)因子。1.傳遞信號(hào)和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，2.感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號(hào)的蛋白激酶，3.與第二信使生成有關(guān)的酶。3.2.1滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)：植物在高鹽或干旱條件下，為了消除脅迫所造成的傷害，維持滲透平衡和體內(nèi)水分，在細(xì)胞中產(chǎn)生和積累的一些小分子化合物。氨基酸衍生物，脯氨酸、甜菜堿；糖類(lèi)，海藻糖、果聚糖，多醇類(lèi)。其中海藻糖、甜菜堿是次生代謝產(chǎn)物。3.2.2保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基因（1）抗凍蛋白基因抗凍蛋白（antifreezeprotein，AFP）：指能降低冰點(diǎn)和減少冰晶生長(zhǎng)速度的蛋白質(zhì)。

用魚(yú)類(lèi)AFP處理植物組織細(xì)胞，可以減少細(xì)胞冰晶生長(zhǎng)，降低冰凍溫度。

表達(dá)黃蓋鰈AFP基因的番茄和煙草的轉(zhuǎn)基因植株抗凍性增加。熒光抗凍蛋白裝飾的冰晶體（2）胚胎發(fā)生后期富集蛋白基因3.2.2保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基因

胚胎發(fā)生后期富集蛋白（lateembryogenesisabundantprotein，LEA）：出現(xiàn)在胚發(fā)后期，隨種子脫水成熟其含量增加，具有高度的親水性，是植物能夠在水分虧缺時(shí)，保持膜系統(tǒng)及生物大分