第七章電子克隆的原理和應用

生物信息學Bioinformatics編號名稱第一章生物信息學引論第二章生物信息學的生物學基礎第三章生物信息學數(shù)據(jù)庫資源第四章DNA和蛋白質序列分析第五章系統(tǒng)發(fā)生分析第六章基因表達數(shù)據(jù)分析第七章電子克隆電子克隆

insilicocloning第七章什么是電子克??？電子克隆的條件和特點；電子克隆的思路和具體例子；電子克隆中最常見的問題及解決辦法；電子克隆中常用的生物信息學軟件和網(wǎng)站介紹；電子克隆的應用前景;內(nèi)容提要：更多的有關電子克隆:水稻功能基因的電子克隆策略,中國水稻科學,2002,16:295-298水稻葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的電子克隆,遺傳學報,2002,29:1012-1016?????1.什么是電子克??？電子克?。╥nsilicocloning）是近年來伴隨著基因組和EST計劃發(fā)展起來的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益發(fā)展的生物信息學技術，借助電子計算機的巨大運算能力，通過EST或基因組的序列組裝和拼接，利用RT-PCR的方法快速獲得功能基因?；谠恚何锓N同源蛋白氨基酸序列相似性（保守性）1.什么是電子克??？2.電子克隆的條件和特點：前提條件；研究物種:豐富的核酸序列信息；

比較物種:較多的基因研究；強大的計算機分析軟硬件的支持。2.電子克隆的條件和特點：目前已經(jīng)基本完成基因組測序的常見生物：

人小鼠大鼠線蟲果蠅擬南芥水稻家雞家蠶……各種生物的EST數(shù)目人類基因的電子克?。?/p>

2002年4月16日的第七屆國際人類基因組學大會上，我國唯一的獲Poster獎論文是《人類新基因的電子克隆和實驗確認》。他們發(fā)現(xiàn)電子克隆的4個人類基因中，有3個與相應的GenBank基因組注解不同，經(jīng)過實驗確認確定為GenBank中的注解錯誤。證明了基因組注解中存在著很多問題，需要進行實驗確認。目前發(fā)表的有關人類基因克隆的絕大部分都利用了人類的基因組或EST數(shù)據(jù)。人類2/3的基因需要實驗確認！植物領域才剛剛開始！電子克隆的特點：

投入低； 速度快； 技術要求不高； 針對性強等。2.電子克隆的條件和特點：種子氨基酸序列tBLASTn水稻基因組contig或BAC/PAC外顯子預測RT-PCR，克隆，測序人工計算機3.電子克隆的基本思路及具體實例：EST拼接設計PCR引物水稻幼苗提取總RNA合成cDNA第一鏈RT-PCR克隆測序生物信息學分析種子氨基酸序列tBLASTn水稻基因組contig或BAC/PAC外顯子預測RT-PCR，克隆，測序人工計算機EST拼接3OsG6PDH

的克隆以小麥G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr數(shù)據(jù)庫結果3OsG6PDH

的克隆以小麥G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr數(shù)據(jù)庫結果4OsG6PDH

的克隆以小麥G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr數(shù)據(jù)庫結果3OsG6PDH

的克隆以小麥G6PDH蛋白（BAA97662

）搜索水稻nr數(shù)據(jù)庫結果3.OsG6PDH

的克隆以獲得的包含OsG6PDH的水稻基因組序列為對象，進行基因結構預測:方法一:

通過Softberry網(wǎng)站進行基因結構的預測/berry.phtml方法二:搜索水稻EST數(shù)據(jù)庫，加以驗證（探針序列的選擇？）與玉米6PGDH（AF061837）匹配的部分水稻ESTs3.Os6PGDH的克隆：水稻OsG6PDH的基因組結構

OsG6PDH基因組序列約5kb，包括15個外顯子，14個內(nèi)含子,內(nèi)含子序列完全符合5’GU…AG3’的特征。3.OsG6PDH

的克隆根據(jù)水稻OsG6PDH的基因組結構預測的結果,得到預測的cDNA序列(包含ORF)設計PCR引物.但是選擇什么來源的cDNA模板呢?如何確定?方法一:方法二:最后通過RT-PCR的方法分離該基因,并進行序列測定.3.OsG6PDH

的克隆設計PCR引物水稻各種組織分別提取總RNA合成cDNA第一鏈水稻鋅指蛋白氨基酸序列搜索水稻基因組庫水稻鋅指蛋白基因序列PCR擴增克隆EST拼接OsZFP基因家族的電子克隆流程圖3.OsZFP

基因家族的克?。?.OsZFP

基因家族的克?。篛sZFP家族3.OsZFP

基因家族的克隆：

逐個對每個ZFP基因進行完整性分析(有一定的策略)

基因表達特性分析.

設計引物,PCR擴增.有時難以確定5’端完整性：序列比較

Kozak規(guī)則[A/GNNAUGG]

起始密碼子上游的同閱讀框序列中是否存在終止密碼子

Northern雜交

RACE技術4.電子克隆中最常見的問題及解決辦法有時候難以確定其表達的時期和條件：

EST的表達時期

其他類似基因的表達時期從多組織進行擴增（尤其是基因家族的分離）4.電子克隆中最常見的問題及解決辦法常用的序列數(shù)據(jù)庫--GenBankGenBank

包括了所有已公布的基因組、EST數(shù)據(jù)。

Nr無冗余數(shù)據(jù)庫（包括mRNA,DNA...）

dbEST

數(shù)據(jù)庫GenBank提供的檢索工具——BLAST

Standardnucleotide-nucleotideBLAST[blastn]Standardprotein-proteinBLAST[blastp]Nucleotidequery-Proteindb[blastx]Proteinquery-Translateddb[tblastn]Nucleotidequery-Translateddb[tblastx]

5.電子克隆中常用的生物信息學軟件和網(wǎng)站介紹常用的基因組分析軟件：FGENESH:http://

最好的分析軟件，可以預測多種生物的基因組結構，包括轉錄起始位點，編碼區(qū)以及轉錄終子位點。GenScan:http:///genscan.html

只能進行人、擬南芥和玉米的分析國內(nèi)鏡像：14:8888/RiceGAAS:http://ricegaas.dna.affrc.go.jpRiceHMM:http://rgp.dna.affrc.go.jp/ricehmmSplicePredictor:http://WebGene:http://125.r.it/~webgene/5.電子克隆中常用的生物信息學軟件和網(wǎng)站介紹常用的基因組分析軟件：啟動子預測：http:///

選擇起始密碼子上游2Kb的序列進行啟動子區(qū)域的預測，同時還可以標出轉錄起始位點的位置，可以與softberry的結果進行驗證比較。5.電子克隆中常用的生物信息學軟件和網(wǎng)站介紹電子拼接::9090/clone.html5.電子克隆中常用的生物信息學軟件和網(wǎng)站介紹

毫無疑問，人類的電子克隆將得到進一步的發(fā)展，越來越多的基因將通過電子克隆的方法獲得，功能基因組學的研究將興起。

植物中目前只有擬南芥和水稻公布了基因組序列，將在電子克隆中占據(jù)主要地位。尤其是水稻基因的克隆將越來越多的利用發(fā)布的序列信息資源。6.電子克隆的應用前景

隨著遺傳圖譜與以序列為基礎的物理圖譜的整合，直接將目的基因（或QTL）與連鎖標記的遺傳距離轉換為物理圖距后的電子克隆有可能成為取代傳統(tǒng)的圖位克隆的重要措施(擬南芥)6.電子克隆的應用前景對于采用抑制差減雜交、差異顯示或基因表達系列分析等方法得到的EST采取電子克隆的方法獲得具有完整基因的策略，則可成為取代RACE或cDNA文庫篩選的最佳方案。6.電子克隆的應用前景

將更容易的獲得基因的染色體分布，結構，啟動子、轉錄因子結合位點的信息，基因的鑒定和功能描述更加容易。

植物中除了擬南芥和水稻，很多EST數(shù)目較多的植物也可以利用EST的策略進行電子克隆，同時也可以間接的利用電子克隆的策略（更方便的文庫篩選）。

電子克隆同樣是發(fā)現(xiàn)新基因的重要途徑。6.電子克隆的應用前景誠然，電子克隆的出現(xiàn)可以大大加速基因的分離和鑒定，但功能克?。▓D位克隆、SSH等）的方法仍然是不可替代的，電子克隆可以大大加速和簡化這些傳統(tǒng)的基因分離途徑。對于其他物種中已經(jīng)充分鑒定功能的基因，電子克隆對于功能基因的分離利用，研究基因的結構、起源、分類和進化具有非常重要的意義。對于新基因，電子克隆仍然需要結合轉基因等方法進行功能驗證。小結什么是電子克??？電子克隆的條件和特點；電子克隆的思路和具體例子；電子克隆中最常見的問題及解決辦法；電子克隆中常用的生物信息學軟件和網(wǎng)站介紹；電子克隆的應用前景;內(nèi)容提要：問題:什么是電子克隆?什么是contig?給你一個小麥基因的蛋白序列,希望你能分離水稻的同源基因,