細(xì)胞工程培養(yǎng)基

培養(yǎng)基種類成分配制技術(shù)篩選方法第三講培養(yǎng)基

教學(xué)內(nèi)容

培養(yǎng)基種類

完全培養(yǎng)基

初代培養(yǎng)基

繼代培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基

增殖和生根培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基

◆

1962年由Murashige和Skoog為煙草組培設(shè)計◆無機鹽、離子濃度高，含高K、N，硝酸鹽含量較高，含銨鹽。◆營養(yǎng)豐富

◆加速合作愈傷組織和培養(yǎng)物生長

MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基

◆無機元素用量是MS的1/3－1/2◆微量種類少

◆無肌醇MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基

◆1943年White培養(yǎng)番茄根尖時設(shè)計◆無機鹽量較低◆使用廣泛

◆適合生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)等MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基White培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基

◆1968年Gamborg在大豆根細(xì)胞培養(yǎng)時設(shè)計◆含較低的銨，硝酸鹽和鹽酸硫胺素用量較高。

◆適合雙子葉植物，尤其木本植物組培。MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基

◆特點與B5相似，硫酸銨改用磷酸二氫銨。

◆無機鹽濃度較高。

MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基

◆1974年朱至清等為水稻花藥培養(yǎng)而設(shè)計◆成分簡單◆硝酸鉀和硫酸銨含量高

◆適合花粉、花藥培養(yǎng)MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基

◆1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計◆有機成分復(fù)雜

◆用于原生質(zhì)體培養(yǎng)(包括原生質(zhì)融合的培養(yǎng))MS培養(yǎng)基Miller培養(yǎng)基SH培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基White培養(yǎng)基營養(yǎng)分布均勻，生長發(fā)育整齊一致，但通氣性差。通氣性較好，便于操作，但營養(yǎng)分布不均，生長發(fā)育不一致。固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基配方硝酸銨1650硫酸鋅8.6硝酸鉀1900氯化鈷0.025氯化鈣440硫酸銅0.025硫酸鎂

370鉬酸鈉0.25磷酸二氫鉀170碘化鉀0.83硫酸亞鐵27.8硼酸6.2EDTA-Na237.3煙酸0.5肌醇100鹽酸吡哆素0.5硫酸錳22.3鹽酸硫胺素0.1

甘氨酸2

培養(yǎng)基的成分

植物激素

無機鹽

有機物質(zhì)培養(yǎng)體支持材料

輔助物質(zhì)水

分無機鹽

元素名稱

添加形式

NKNO3,NH4NO3大量

PKH2PO4NaH2PO4元素

KKClKNO3(≥0.5mmol/L)CaCaCl2·2H2OMgMg2SO4·7H2OSMg2SO4·

7H2OFeFeNa2-EDTA微量

BH3BO3元素

MnMnSO4

(≤0.5mmol/L)CuCuSO4

MoNa2MoO4·2H2OClCaCl2·2H2O有機物質(zhì)維生素

氨基酸天然復(fù)合物

椰乳香蕉泥水解酪蛋白碳水化合物

馬鈴薯其

它碳水化合物

種類：蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖等。蔗糖濃度：2-3%，胚培養(yǎng)為4-15%。注意：

高壓滅菌部分糖會分解。大生產(chǎn)時可用白砂糖。功能：

能源；維持滲透壓（1.5－4.1大氣壓）；種類：B族維生素、B1、B6、煙酸、生物素（ＶＨ）、抗壞血酸（ＶＣ）、肌醇、泛酸或泛酸鈣。濃度：0.1－1.0mg/L

功能：參加酶的形成參加蛋白質(zhì)和脂肪代謝等生命活動

VB1促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力

VB6

促根生長

Vpp與代謝和胚發(fā)育有關(guān)

Vc防組織褐變維生素肌醇促進愈傷組織生長、胚狀體和芽的形成對組織細(xì)胞繁殖、分化的促進作用濃度100mg/L

肌醇（50－100％）影響B(tài)1的效應(yīng)。椰乳：促愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)，用量10～20%。使用注意莖尖大小。

天然復(fù)合物香蕉泥：對pH值緩沖大，用量150～

200ml/L，

應(yīng)用在蘭花組培。

水解酪(乳)蛋白：濃度100-200mg/L，多用于微莖尖培養(yǎng)。

天然復(fù)合物馬鈴薯提取液：對pH值緩沖大，用量150-200g/L，使苗壯。其它：

荸薺汁、玉米汁、0.5％酵母提取物、麥芽汁、番茄汁。

氨基酸種類：甘氨酸、酰胺、水解酪蛋白等。功能：蛋白質(zhì)組成成分植物激素1.生長素類（1）種類：

IAA(吲哚乙酸)、NAA（-萘乙酸）、IBA(吲哚丁酸)

2,4－D（2.4-二氯苯氧乙酸）（2）機理：滲入細(xì)胞并與細(xì)胞某種特定受體結(jié)合，發(fā)生特定生化反應(yīng)，產(chǎn)生一定的生長效應(yīng)。（3）作用：誘導(dǎo)愈傷組織和根分化，促進細(xì)胞分裂和伸長。（4）濃度：

0.05－5mg/L植物激素2.細(xì)胞分裂素（CTK）

（1）種類：6－BA（6-芐氨基嘌呤）、KT（激動素）、ZT(玉米素)（2）機理：與細(xì)胞分裂和分化有關(guān)；生長素參與核的有絲分裂但與胞質(zhì)無關(guān)；分裂素則促進核分裂又促進胞質(zhì)分裂，也誘導(dǎo)細(xì)胞擴大；解除頂端優(yōu)勢，促進側(cè)芽生長。（2）作用：誘導(dǎo)不定芽分化和莖、苗增殖。（3）濃度：0.05－10.0mg/L植物激素3.赤霉素（GAs）

（1）種類：GA3(赤霉素)（2）作用：促莖伸長，促胚發(fā)育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。注意：不耐熱。

WTripening-inhibitor(rin)西紅柿的RIN基因突變導(dǎo)致果實不能成熟

便于長距離運輸和延長貨架期Firstgeneticallywholefoodinfoodsupply(1994):FlavrSavr'tomato(U.S.A)“麗春”硬度較對照增加7%，儲藏特性明顯優(yōu)于對照，在28-32度夏季自然條件下存放40天。多聚半乳糖醛酸酶基因的抑制表達

我國的轉(zhuǎn)基因番茄百日鮮---華中農(nóng)大利用基因工程技術(shù)構(gòu)建反義ACC氧化酶（或者稱為乙烯形成酶EFE）基因載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株果實耐貯藏，果實在25℃溫度下，可貯藏40－50天，較對照延長貯藏期20－30天西紅柿果實成熟的分子調(diào)控模式控制果實形狀的關(guān)鍵基因位點-fs8.1果實由傳統(tǒng)的橢球形變?yōu)榻L方體形，便于機器收割培養(yǎng)體支持材料1.瓊脂(1)用量6－10g/L(2)種類瓊脂粉瓊脂條(3)作用固化作用注意：瓊脂使用有優(yōu)缺點；新買應(yīng)試凝固力。2.其它

玻璃纖維濾紙橋海綿等輔助性物質(zhì)抗生素抗氧化物活性炭抗生素鏈霉素青霉素慶大霉素功能防止外植體內(nèi)生菌造成的污染。種類青霉素鏈霉素土霉素四環(huán)素氯霉素利福平卡那霉素慶大霉素等用量

5－20mg/L注意抗生素對組織生長有抑制作用，使用要慎重。

抗氧化物2.用量：50－200mg/L，3.作用：防止氧化4.注意：可用抗氧化劑洗滌外植體傷口表面。1.常用抗氧化劑：半胱氨酸、VC

活性炭1.作用：

吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進新梢增殖（濃度0.1-0.2%）；促進生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）；有利于胚胎培養(yǎng)。2.常用濃度：0.5－10g/L3.注意：活性炭具副作用。植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基（單位：mg／Ｌ）

成分WhiteHellerMSERB5NitschN6

無機物NH4NO3

－－16501200－720－KNO380---190019002527.59502830CaCL2.2H2O---75440440150---166CaCL2---------------166---MgSO4.7H2O750250370370246.5185185KH2PO4------170340---68400(NH4)2SO4------------134---463Ca(NO3)2.4H2O300------------------NaNO3---600---------------Na2SO4200------------------NaH2PO4.H2O19125------150------KCL65750---------------KI0.750.010.83---0.75---0.8WhiteHellerMSERB5NitschN6H3BO31.516.20.633101.6MnSO4.4H2O50.122.32.23---254.4MnSO4.H2O--------10----ZnSO4.7H2O318.6--2101.5Zn.Na2.EDTA------15------Na2MoO4.2H2O----0.250.0250.250.25--MoO30.001------------

CuSO4.5H2O0.010.030.0250.00250.0250.025--CoCL2.6H2O----0.0250.00250.025----ALCL3--0.03----------NiCL2.6H2O--0.03----------FeCL3.6H2O--1----------Fe2(SO4)32.5------------FeSO4.7H2O----27.827.8--27.827.8Na2.EDTA>2H2O----37.337.3--37.337.3NaFe.EDTA--------28----

有機物WhiteHellerMSERB5NitschN6

肌醇----100--100100--

煙酸（B3）0.05－0.50.5150.5B60.01－0.50.510.50.5B10.01－0.10.5100.51

甘氨酸3－22－22

葉酸－－－－－0.5－

生物素－－－－－0.05－

蔗糖2％－3％4％2％2%5%細(xì)胞分裂素與生長素對器官或愈傷組織的影響復(fù)習(xí)思考題：比較固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基的優(yōu)缺點配制MS培養(yǎng)基時，瓊脂和蔗糖的加入量一般為多少？培養(yǎng)基的成分包括哪幾類？各有何作用？在培養(yǎng)基成分中什么決定著外植體發(fā)育方向？抗生素的作用是什么？？

第二節(jié)最佳組培方案的篩選組培方案篩選步驟：文獻檢索預(yù)備試驗參觀咨詢最佳組培方案篩選正交試驗文獻檢索

◆植物的學(xué)名、品種名、商品名◆此種植物組培的相關(guān)報道◆重點收集分析的技術(shù)信息收集、分析的技術(shù)信息◆外植體取樣時間與外植體類型◆誘導(dǎo)、繼代、生根培養(yǎng)基配方◆培養(yǎng)條件（溫度、濕度、pH值等）◆移栽馴化條件及基質(zhì)配比預(yù)備試驗

針對某些關(guān)鍵因素簡單擬定試驗方案，粗略判斷某因素是否有影響及影響程度、劑量的大致范圍。觀察。。。L16(45)正交表

正交試驗L16

(45)正交表正交表的代號試驗方案形成的處理數(shù)試驗因子數(shù)（列號數(shù)）試驗因子的作用劑量水平數(shù)（可容納的水平數(shù)）正交試驗

L16(45)誘導(dǎo)蘋果生根正交試驗結(jié)果L4(23