動物細胞融合

醫(yī)學細胞生物學設(shè)計型實驗

實驗項目:動物細胞融合

小組成員：覃科（1310750171）張?zhí)煲悖?310750175）袁建俠（1310750179）吳金寶（1310750180）目錄1、實驗?zāi)康?、實驗原理3、實驗步聚4、實驗預期結(jié)果5、融合過程觀察以及融合率的計算6、實驗試劑及材料7、注意事項一、實驗?zāi)康?、了解PEG誘導雞血細胞融合的原理2、初步掌握細胞融合技術(shù)及融合率的計算方法。動物細胞融合細胞融合又稱細胞雜交，是兩個或多個細胞合并形成一個雙核或多核細胞的過程。用人工方法誘導細胞融合是20世紀60年代發(fā)展起來的新興技術(shù)，發(fā)展速度非?？欤瑧?yīng)用范圍極為廣泛，已成為廣泛，已成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤及生物新品種培育的重要手段。二、實驗原理人工合成形成的融合細胞有兩類：

由不同親本細胞融合而來由同一親本細胞融合而來異核體同核體3、誘導方式物理法：化學法：生物法：滅活的病毒電激、振動、離心聚乙二醇（PEG）例如：仙臺病毒目前應(yīng)用最廣泛的是PEG，因為PEG易得、簡便，且融合性效果好。PEG可借氫鍵與H2O結(jié)合，高濃度的PEG溶液易使細胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)變化，導致細胞融合。滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜種細胞（細胞膜具有一定的流動性）4.生物法：滅活的病毒（喪失感染性、保留抗原結(jié)構(gòu)）過程：細胞融合的應(yīng)用搞科研三、實驗步驟（一）、50%PEG液的制備根據(jù)實驗需要，稱取一定量的PEG（MV=4000）放入刻度離心管內(nèi)，用試管夾夾住，在酒精燈焰上加熱，使其溶化，冷卻至50~60°C時，加入預熱的等體積Hanks液混勻，置之37℃水浴箱中保溫待用。實驗操作流程（一）50%PEG液的制備取一定量PEG放入刻度離心管內(nèi)在酒精燈火焰上加熱使其溶化待降至50~60°C時加入預熱的等體積Hanks液混勻置于37℃水浴箱中保溫待用（二）、融合方法：10%雞血細胞的制備

1、用肝素鈉處理后的注射器，在公雞翼下抽取2ml靜脈血，加入盛有8mlAlsever液的試管中，使血液：Alsever液的比例為1:4，混均后可在冰箱中存放一周。2、取雞血細胞懸液1ml到10ml離心管，加入9ml

0.85%生理鹽水混勻，1000r/min離心5min，棄上清液，再按照上述條件離心洗滌2次。3、收集沉淀細胞，加入8ml~10mlHanks液配置成10%的雞血細胞懸液。取10%的雞血細胞懸液1ml加入離心管中加入8—10mlHanks液傾去上清液，將離心管倒置于濾紙上取50%PEG

0.5ml加入5mlHanks液混勻放入離心機中

1000r/min離心5min傾去上清液再次懸浮細胞離心洗滌一次手指輕彈離心管在37℃水浴中于1min內(nèi)逐滴入離心管加入9mlHanks在37℃水浴中靜置5min稀釋PEG齊去上清液在37℃水浴中溫浴20~30min加2-3mlHanks液在5min10min20min30min去懸液制片用0.2%亞甲基藍染色觀察四、預期結(jié)果：

（一）融合過程觀察：分別于溫育5min、10min、15min、20min、30min取細胞懸液一滴制成臨時裝片，以0.2%次甲基藍染液染色，在顯微鏡下觀察細胞融合的不同階段，通?？砂讶诤线^程大致分為5個階段：細胞融合過程圖五個階段兩個細胞的膜相互接觸，粘連。相接的兩細胞膜破口粘合形成細胞膜通道。兩細胞之間細胞質(zhì)相遇，形成細胞質(zhì)通道。通道擴大，兩細胞連成一體。細胞合并完成，形成一個含有兩個或多個核的圓形細胞。

（注：上述階段可在不同時期觀察）五、融合率的計算：

融合率是指在顯微鏡視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細胞，其細胞核的總數(shù)與視野內(nèi)所有細胞（包括已融合和未融合細胞）的細胞核總數(shù)之比。對孵育30min時制備的臨時裝片計算融合率。通常以百分數(shù)表示，進行多個視野測定值的平均統(tǒng)計更加準確。

融合率=（融合的細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)）×100%六、實驗試劑及材料1、材料：成年健康公雞。2、試劑：聚乙二醇（PEG，Mr=4000）、0.2%亞甲基藍染液、Alsever液、0.85%生理鹽水、Hanks液。3、儀器設(shè)備：顯微鏡、恒溫水浴箱、離心機、電子天平、刻度離心管、試管、試管架、酒精燈、量筒、吸管、載玻片、蓋玻片、注射器、燒杯。七、注意事項：

1、1.在離心管中加PEG之前，一定要將離心管倒置濾紙上，流盡