分子標記及基因芯片技術與應用

10分子標記及基因芯片技術及應用10.1分子標記技術和應用10.2基因芯片技術及應用10.1分子標記技術和應用概述RFLPAFLPRAPDSSR和ISSRSSCPSNPA分子標記概述遺傳標記的種類：形態(tài)標記細胞標記生化標記

分子標記形態(tài)標記是指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的外觀性狀。細胞標記是指明確顯示遺傳多態(tài)性的細胞學特征。生化標記是指明確顯示生物大分子或生物化合物多態(tài)性的生化特征。同功酶：具有相同催化功能而結構及理化性質不同的一類酶分子標記廣義的分子標記：可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白。包括蛋白質標記和DNA標記。狹義的分子標記只是指DNA標記。具有高的多態(tài)性共顯性遺傳；能明確辨別等位基因；遍布整個基因組；選擇中性，即無基因多效性；檢測手段簡單快速；開發(fā)和使用成本低；重復性好。理想的分子標記目前已開發(fā)的分子標記技術1.以電泳和分子雜交技術為核心的分子標記

RFLP，VNTR2.以電泳和PCR技術為核心的分子標記

SSR，RAPD，AFLP，SSCP，ISSR3.以DNA序列為核心的分子標記SNP，ITS各種分子標記的特點（1）直接以DNA的形式表現，不受季節(jié)、環(huán)境限制；（2）數量多，遍布整個基因組；（3）存在共顯性分子標記；（4）選擇中性，不影響目標性狀的表達；（5）檢測手段簡單迅速，可分析微量樣品B.RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)

限制性片段長度多態(tài)性

DNA某一位點上的變異有可能引起該位點特異性的限制性內切酶識別位點的改變，包括原有位點的消失或出現新的酶切位點，致使酶切片段長度隨之發(fā)生變化。RFLP

操作RFLP與性狀的連鎖RFLP帶譜的分析RFLP特點共顯性（能夠區(qū)分雜合子和純合子）；無組織特異性，不受環(huán)境影響；數量豐富需要儀器設備多，試驗操作復雜；DNA需要量大；大多數RFLP表現為二態(tài)性，提供信息量低；需要選用恰當的限制酶，才能表現較好的多態(tài)性。C.AFLP（amplifiedfragmentslengthpolymorphism

）

擴增片段長度多態(tài)性集合了RFLP和PCR技術的優(yōu)點。AFLP的特點標記豐富：使用少量引物得到大量標記；高分辨率；兩步PCR擴增，高效，高靈敏度，重復性好；不需要事先知道DNA序列，也具有通用性。費用高，操作復雜；絕大多數顯性標記，不能區(qū)分雜合子和純合子對DNA模板質量、內切酶質量要求高（酶切充分）。D.RAPD

(randomamplifiedpolymorphicDNA)

隨機擴增多態(tài)性DNA

以基因組DNA為模板，采用隨機設計的單個寡核甘酸序列（6-12bp）為引物，通過PCR擴增，產生不連續(xù)的DNA產物，用于檢測DNA序列的多態(tài)性。RAPD的數據分析RAPD的特點不需要探針，不需要已知DNA信息；對DNA需要量少，對質量要求不高；技術簡單，分析自動化，成本低；操作簡單，無放射性物質，檢測速度快，成本較低；可以轉化為SCAR（SequenceCharacterizedAmplifiedRegion）標記。顯性遺傳，不能區(qū)分純合子和雜合子;PCR敏感，重復性差；存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但堿基序列組成不同的片段;需要篩選多態(tài)性高的引物。E.SSR和ISSRSSR（simplesequencerepeat）：簡單重復序列多態(tài)性，又稱微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串聯重復的拷貝數目不等而出現的多態(tài)現象。ISSR(inter-simplesequencerepeat)：:用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2-4個隨機核昔酸，在PCR反應中，錨定引物可引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA片段進行PCR擴增。SSRGATGACCAACCAAGAGGCTGTTGATGAGATCAAAGACATCAAGGACGCACAGGCAGCTGCGAAGCATCTGACGGAGCATATATATATATATATAGGCGGTGAACAGGAAGAGCAAAGACGACATCTCCTGCGTCGTCGTAAACTTCCACTGCTAGCAGAGCTTGAAGCTGCTAGCCCCTCAAGTGTACAATTGCTTISSR檢測手段：

PAGE—高分辨率SSRISSRSSR和ISSR的特點多態(tài)性豐富，所需DNA量少共顯性,故可鑒別雜合子和純合子；操作簡單，穩(wěn)定可靠.一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點.開發(fā)成本高，或需要對目標生物具有一定的前期研究基礎.結合了RAPD標記技術和SSR標記技術的優(yōu)點，模板DNA用量少；標記為顯性標記，符合孟德爾遺傳規(guī)律。易操作。檢測兩個隨機存在的微衛(wèi)星位點。無需知道任何耙序列的SSR背景信息。SSRISSRSSR資源的挖掘構建基因組或cDNA文庫EST數據庫搜尋法利用物種保守性微衛(wèi)星富集文庫F.SSCP(Single-StrandConformationPolymorphism)單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內部堿基配對等分子內相互作用力來維持的，當有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構象，使構象發(fā)生改變，空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.電泳檢測SSCP測序檢測SSCPSSCP特點原理及操作簡便,周期短。成本低,所用試劑價格相對低廉。適用于大樣本篩選,常規(guī)方法在研究基因突變時需DNA測序,SSCP技術在測序前對DNA樣本進行篩選。對DNA原始材料純度要求不高,且所需量較少。

PCR-SSCP技術并不能檢測變異的位置,且隨DNA片段長度增加,檢測的敏感性逐漸降低。E.SNP(singlenucleotidepolymorphism)SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。其比較的