人類(lèi)EGFR 基因突變檢測(cè)

人類(lèi)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）操作規(guī)范【產(chǎn)品名稱(chēng)】通用名：人類(lèi)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）英文名：DiagnostickitforMutationsofHumanEGFRGene（FluorescencePCRAnalysis）【包裝規(guī)格】20測(cè)試/盒【預(yù)期用途】表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）屬于I型酪氨酸激酶受體，定位于細(xì)胞膜上。EGFR被表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等配體激活后，將信號(hào)傳導(dǎo)至胞內(nèi)，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)化等生理過(guò)程。EGFR位于染色體7pll.2，由原癌基因C-erbB-1編碼，包含28個(gè)外顯子，其中外顯子18?24編碼受體酪氨酸激酶功能區(qū)。研究表明該區(qū)域內(nèi)發(fā)生基因突變與吉非替尼等靶向藥物的反應(yīng)性相關(guān)。這類(lèi)藥物的作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制EGFR胞內(nèi)磷酸化而阻滯傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，實(shí)現(xiàn)靶向治療。EGFR基因突變主要是19外顯子的缺失突變和21外顯子的L858R點(diǎn)突變，占突變總數(shù)的90%以上。19外顯子的缺失突變集中于746-753位密碼子，其中2種E746_A750del（2235_2249del15和2236_2250del15）最常見(jiàn)。19，21外顯子的這些突變?cè)斐蒃GFR胞內(nèi)酪氨酸激酶功能區(qū)的結(jié)構(gòu)改變，提高EGFR與靶向藥物的結(jié)合能力，使靶向藥物療效更好。據(jù)中國(guó)2010版《腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南》數(shù)據(jù)，亞洲人非小細(xì)胞癌EGFR突變率高達(dá)30~40%,回顧性研究報(bào)道顯示，使用厄洛替尼或吉非替尼后腫瘤緩解的非小細(xì)胞肺癌患者大約90%攜帶突變，而未緩解者則無(wú)突變。本試劑盒以人非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌腫瘤組織切片提取的基因組DNA為檢測(cè)樣本，用于EGFR基因19、21外顯子多種突變的定性檢測(cè)，因此本試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅用于輔助臨床醫(yī)生對(duì)非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌腫瘤患者制定用藥方案?！緳z驗(yàn)原理】本試劑盒基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)，結(jié)合等位基因特異性擴(kuò)增（ARMS）技術(shù)、野生型基因擴(kuò)增抑制技術(shù)和多重PCR技術(shù)檢測(cè)EGFR基因19、21外顯子的14種突變（表1）。ARMS技術(shù)是指PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性ARMS引物組（共6條ARMS上游引物，包括5條檢測(cè)19外顯子突變和1條檢測(cè)21外顯子突變的引物）和2條下游引物，對(duì)存在突變的EGFR基因19、21外顯子的靶序列進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，并利用分別標(biāo)記有HEX熒光基團(tuán)——BHQ1淬滅基團(tuán)和FAM熒光基團(tuán)——BHQ1淬滅基團(tuán)的兩條Taqman探針?lè)謩e實(shí)現(xiàn)對(duì)19,21突變外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)槿祟?lèi)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）說(shuō)明書(shū)采用了野生型基因擴(kuò)增抑制劑，使ARMS體系能夠耐受更高濃度的背景野生型EGFR基因，降低了試劑盒對(duì)基因組樣本的DNA濃度要求，提高了檢測(cè)靈敏度。為質(zhì)控?cái)U(kuò)增體系的有效性，試劑盒設(shè)置了內(nèi)質(zhì)控和外質(zhì)控，內(nèi)質(zhì)控基因是人類(lèi)基因組的一個(gè)保守片段，長(zhǎng)度與EGFR目標(biāo)片段相似，均為100bp左右，內(nèi)控探針采用標(biāo)記ROX熒光基團(tuán)——BHQ2淬滅基團(tuán)的Taqman探針對(duì)內(nèi)控基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。內(nèi)控引物、探針及內(nèi)控基因?qū)RMS體系的擴(kuò)增效率無(wú)影響。陽(yáng)性對(duì)照品是一種擴(kuò)增效率最低的EGFR基因19外顯子L747_P753>S突變質(zhì)粒與野生型人類(lèi)基因組DNA的混合物，用于PCR擴(kuò)增的外質(zhì)控。本試劑盒包含PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II和對(duì)照品等3管試劑。PCR反應(yīng)液I包含外顯子19突變擴(kuò)增用5+1條引物對(duì)和1條探針（HEX標(biāo)記），濃度20~100pM，19外顯子野生型基因擴(kuò)增抑制劑，濃度1200pM；外顯子21L858R突變擴(kuò)增用1對(duì)引物、1條探針（FAM標(biāo)記），濃度20~100pM，和21外顯子野生型基因擴(kuò)增抑制劑，濃度800pM；內(nèi)控基因擴(kuò)增用1對(duì)引物和1條探針（ROX標(biāo)記），濃度20~100pM。PCR反應(yīng)液II包含0.1U/口lTaq酶和50nMdNTP、750nMMg2+等。陽(yáng)性對(duì)照品包含21外顯子L858R突變質(zhì)粒（300copies/口1）、19外顯子L747_P753>S突變質(zhì)粒（300copies/口1）和10ng/口1野生型人類(lèi)基因組DNA（3000copies/口1）。檢測(cè)必須但試劑盒中不包含的組分：1.5ml離心管（用于配制PCR反應(yīng)液和DNA提?。?；0.2mlPCR管或8聯(lián)PCR管或96孔PCR板；帶濾塞的吸頭（1ml、200U1和10口1）；DNA提取試劑盒ReliaPrep?FFPEgDNAMiniprepSystem（貨號(hào)：A2352）【貯存條件及有效期】置于-20°C條件下儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月。4-10°C避光條件下儲(chǔ)存或運(yùn)輸不得超過(guò)7天?！具m用儀器】適用于ABI7500、LinegeneFQD-96型號(hào)的Real-timePCR擴(kuò)增儀。【樣本要求】適用樣本為非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌石蠟包埋病理組織切片，切片厚度10um，數(shù)量1片，所用切片樣品保存不超過(guò)3年。由于腫瘤的復(fù)雜性，所采集的臨床樣品往往會(huì)混有正常組織細(xì)胞，石蠟包埋病理切片樣品腫瘤病變細(xì)胞應(yīng)不低于10%，所取部分應(yīng)盡量在蠟塊中部；使用商業(yè)化的試劑盒來(lái)提取人類(lèi)基因組DNA，推薦使用Promega公司的ReliaPrep?FFPEgDNAMiniprepSystem（A2352）提取石蠟包埋組織切片樣品，所提DNA需用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，其DNA0D260/0D280的值應(yīng)在1.8~2.0，濃度應(yīng)在3~300ng/口1之間，樣本DNA質(zhì)量不合格者不得用于檢測(cè)，建議重新取切片進(jìn)行核酸提取，提取完的DNA建議立即進(jìn)行檢測(cè)，否則請(qǐng)于-20C以下保存，保存時(shí)間不要超過(guò)6個(gè)月?！緳z驗(yàn)方法】一、核酸提?。颖咎幚硎遥┦褂肦eliaPrep?FFPEgDNAMiniprepSystem進(jìn)行核酸提取，提取步驟如下。用礦物油去除石蠟加礦物油500^1到裝有組織切片樣本的1.5ml離心管內(nèi)，80°C孵育lmin,振蕩混勻；組織樣本裂解，消化組織蛋白質(zhì)1） 離心管內(nèi)加入200U1裂解液，室溫10,000g離心15s，形成水油兩相溶液，下層為水相，上層為油相；2） 向離心管水相加入20口1蛋白酶K,用移液槍吸打混勻；3） 56C孵育1h；4） 80C孵育1h；5） 冷卻到室溫，離心15s；去除RNA向離心管水相加入10口1RNaseA,吸打混勻。室溫（20-25C）孵育5min；用核酸提取柱提取基因組DNA1） 加入220口1BLBuffer到含裂解樣品的離心管中，再加入240^1乙醇（95-100%）,震蕩混勻，室溫10,000g離心15s,形成水油兩相溶液，下層為水相，上層為油相；2） 將結(jié)合柱置于收集管內(nèi)，小心吸取離心管下層水相（包括可能形成的沉淀）轉(zhuǎn)移到結(jié)合柱內(nèi)，蓋上管蓋，將離心管丟棄。3） 收集管室溫10,000g離心30s，棄去管中的濾出液。4） 把柱子重新裝入收集管中，加入500U11 洗滌液至柱內(nèi)，室溫10,000g離心30s,棄去濾出的洗滌液。5） 重復(fù)步驟4）再洗滌一次；6） 打開(kāi)結(jié)合柱蓋子，室溫條件下16,000g離心3min以甩干柱內(nèi)殘余的液體；7） 把柱子轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的自備 1.5m1離心管中，向柱內(nèi)加入50口1E1utionBuffer，室溫16,000g離心1min洗脫基因組DNA，丟棄提取柱。\I■■ \ 『—r-*-.注意事項(xiàng)：操作提取柱和收集管時(shí)應(yīng)戴好一次性手套；收集基因組DNA前的16,000g離心3min操作必須開(kāi)蓋，以除凈乙醇，乙醇?xì)埩暨^(guò)量將嚴(yán)重影響基因組的收集質(zhì)量。二、 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備室）將試劑從冰箱取出，室溫融化，混勻，lOOOrpm快速離心20秒，備用；三、 反應(yīng)體系配制（試劑準(zhǔn)備室）根據(jù)檢測(cè)樣本數(shù)計(jì)算所需反應(yīng)數(shù)，如樣本數(shù)為n則需做n+2個(gè)反應(yīng)（包含一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)無(wú)模板對(duì)照反應(yīng)）；根據(jù)表3計(jì)算所需各反應(yīng)液的體積，并配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系混勻后3000rpm快速離心30秒，分裝至PCR管中，每管18口1；表3加樣表組分1反應(yīng)3）N個(gè)反應(yīng)（pl）PCR反應(yīng)液I14PCR反冋液1[44XN總體積181SXN四、 加樣（樣本處理室）取2口1提取的樣品DNA加入PCR反應(yīng)管，蓋上管蓋，1000rpm離心或輕甩，排除管底氣泡；陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)所用模板為試劑盒中對(duì)照品，空白對(duì)照反應(yīng)所用模板為超純水（自備）。五、 上機(jī)檢測(cè)（擴(kuò)增室）將PCR管按順序放入PCR儀，按表4設(shè)置反應(yīng)程序；表4反應(yīng)理序階段溫度時(shí)間檢測(cè)熒光循環(huán)數(shù)95TC2mm循環(huán)段15sec1052X?SQscc72r15sec循環(huán)囪2931C3sec3556TC30&ecJ60L130sec注：在循環(huán)段2的56°C時(shí)檢測(cè)FAM、HEX、ROX三個(gè)通道的熒光。運(yùn)行PCR反應(yīng)程序，保存文件。六、 結(jié)果獲取熒光定量PCR儀運(yùn)行結(jié)束后，使用配套軟件對(duì)本次試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析?！緟⒖寂R界值】以擴(kuò)增過(guò)程前3-15循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，以熒光值超過(guò)閾值的循環(huán)數(shù)為閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）?！緳z驗(yàn)結(jié)果的解釋】空白對(duì)照應(yīng)在FAM、HEX和ROX通道均無(wú)Ct值或無(wú)典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)升起；若空白對(duì)照管在至少一個(gè)通道有典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)升起，可能為試劑受到污染或操作過(guò)程中的污染，請(qǐng)排除污染源后重新檢測(cè)；陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)在FAM、HEX和ROX通道均有典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)升起，且Ct值12?25間;若對(duì)照品有至少一個(gè)通道無(wú)典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)升起或Ct值<12或Ct值±25，該批次樣本需重新檢測(cè)，請(qǐng)確認(rèn)所使用的試劑是否仍在有效期內(nèi)，確定操作是否嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;若滿(mǎn)足1和2要求，表明此次實(shí)驗(yàn)成功，對(duì)樣品管進(jìn)行分析：（1）內(nèi)控（ROX通道）應(yīng)有典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)升起，且Ct值10~22之間，表明所加樣本DNA質(zhì)量正常；若Ct值<10，表明所加樣本過(guò)量，請(qǐng)將樣本稀釋后再次檢測(cè);若Ct±22或無(wú)擴(kuò)增，表明所加樣本DNA含有PCR抑制劑或DNA量不夠，可能影響低突變率樣本的檢測(cè)結(jié)果，請(qǐng)重新提取DNA后檢測(cè);（2） 樣本突變信號(hào)（FAM通道）有典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)升起，且Ct值W32，則判定該樣本EGFR基因21外顯子L858R突變陽(yáng)性；（3） 樣本突變信號(hào)（FAM通道）無(wú)典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)升起，或Ct值大于32，則判定該樣本EGFR基因21外顯子L858R突變陰性；（4） 樣本突變信號(hào)（HEX通道）有典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)升起，且Ct值W32，則判定該樣本EGFR基因19外顯子缺失突變陽(yáng)性；（5） 樣本突變信號(hào)（HEX通道）有典型的S型擴(kuò)增曲線(xiàn)升起，或Ct值大于32，則判定該樣本EGFR基因19外顯子缺失突變陰性。【檢驗(yàn)方法的局限性】本試劑盒僅適用于規(guī)定的儀器和檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診治的唯一依據(jù)。本試劑盒尚無(wú)臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)EGFR基因突變與靶向藥物用藥的相關(guān)性，其相關(guān)性主要來(lái)自文獻(xiàn)報(bào)道?！井a(chǎn)品性能指標(biāo)】經(jīng)1050例非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌腫瘤組織樣本臨床試驗(yàn)，本品與測(cè)序法作對(duì)照，陽(yáng)性符合率為99.0%，陰性符合率為96.6%，總符合率為97.5%。試劑盒應(yīng)外觀(guān)清潔、無(wú)泄漏、無(wú)破損，標(biāo)志、標(biāo)簽字跡清楚；各組分融化后應(yīng)澄清透明，無(wú)色，無(wú)沉淀。檢測(cè)20份陽(yáng)性參考品，陽(yáng)性參考品符合率應(yīng)為100%。檢測(cè)10份陰性參考品，陰性參考品符合率應(yīng)為100%?？梢詸z出10ng野生型基因組DNA背景下，含量低至1%的EGFR基因的14種突變。用4份企業(yè)內(nèi)部精密性參考品分別作10次平行檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性且Ct值變異系數(shù)CVW5%。【注意事項(xiàng)】本試劑盒僅用于體外研究。實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。PCR檢測(cè)應(yīng)在有資質(zhì)的臨床PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照衛(wèi)生部《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)文件