第二章-分子克隆工具酶

2分子克隆工具酶概述限制性內(nèi)切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNApolymeraseⅠ）其他分子克隆工具酶工具酶的定義o在生物技術(shù)中常用的各種工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)稱為工具酶。o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對(duì)基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。o工具酶是對(duì)野生菌株（或真核生物如酵母）進(jìn)行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。o自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類(lèi)。這些酶類(lèi)參與微生物的核酸代謝，在核酸復(fù)制和修復(fù)等反應(yīng)中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNA進(jìn)而降解非己DNA的防御工具。o本章主要介紹用于基因工程的各種工具酶。常用的工具酶o工具酶名稱主要功能限制性核酸內(nèi)切酶restrictionendonucleasesDNA連接酶DNAligase

在DNA分子內(nèi)部的特異性的 堿基序列內(nèi)部進(jìn)行切割將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個(gè)整體通過(guò)向3’端逐一增加核苷酸以填補(bǔ)雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性與3’→5’及5’→3’外切酶活性 催化將把一個(gè)磷酸分子加到多核苷酸鏈的

5’－OH末端上 以RNA或DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈 將寡聚物尾巴加到了線性雙鏈 或單鏈DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端DNA聚合酶IDNApolymeraseI多核苷酸激酶DNApolymerasekinease反轉(zhuǎn)錄酶reversetranscriptaseDNA末端轉(zhuǎn)移酶DNAterminalDeoxynucleatidy

transferase

(接下表格)o常用的工具酶(續(xù)上表格)工具酶名稱主要功能

去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基團(tuán) 降解DNA3’－OH末端的核苷酸殘基降解單鏈DNA或RNA,產(chǎn)生帶5’磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸，同時(shí)也可切割雙鏈核酸分子的單鏈降解雙鏈DNA,RNA的5’及3’末端，高專(zhuān)一性單鏈核苷酸 能在高溫（72℃）下的單鏈DNA為模板， 從5’→3’方向合成新生的互補(bǔ)鏈

專(zhuān)一性降解RNA

內(nèi)切核酸酶，水解單鏈或雙鏈DNA堿性磷酸酶BAPorCIP核酸外切酶IIIexonucleaseIII降解酶S1nucleaseS1核酸酶Bal31nucleaseBal31TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase核糖核酸酶RNase脫氧核糖核酸酶DNase2.1限制性內(nèi)切酶(restrictionenzyme)ooooooooooo限制與修飾（Restrictionandmodification）限制酶識(shí)別的序列限制酶產(chǎn)生的末端DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響位點(diǎn)偏愛(ài)（Sitepreference）酶切反應(yīng)條件星星活性（staractivity）單鏈DNA的切割酶切位點(diǎn)的引入影響酶活性的因素酶切位點(diǎn)在基因組中分布的不均一性Phageλ(k)（K菌株上生長(zhǎng)的Phageλ）感染感染頻率下降許多

E.colikE.coliB【E.coliB限制λ(k)】2.1.1限制與修飾（Restrictionandmodification）

1.限制與修飾現(xiàn)象

①50年代后Luria和Human(1952),Bertani

和

Weigle(1953)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的“限制”現(xiàn)象：E.coliB修飾λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)細(xì)菌如何對(duì)λ噬菌體進(jìn)行限制和修飾?②仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB

對(duì)這些λ(K)進(jìn)行了修飾。E.coli

菌株λ噬菌體感染率λKλBλCE.coli

K1

-410

-410E.coli

B

-4101

-410E.coli

C111表2-1λ噬菌體不同感染株對(duì)E.coli

不同菌株的感染率細(xì)菌的限制--修飾系統(tǒng)①1962年W.Arber(瑞士)發(fā)現(xiàn)，寄主對(duì)噬菌體的修飾是在λPhage的DNA上。②1965年，Arber發(fā)現(xiàn)修飾與λ的降解有關(guān)，提 出：細(xì)胞中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細(xì)胞中有限制-修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modificationsystem)。甲基化是常見(jiàn)的修飾作用，可使腺嘌呤A成為N6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成為5’-甲基胞嘧啶。R-M系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。2.限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)???1968年，Meselson從E.coli

K株中分離出了第一個(gè)限制酶EcoK，同年Linn和Aeber從E.coli

B株中分離到限制酶EcoB。1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種限制性酶HindⅡ，這是第一個(gè)分離到的Ⅱ類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶。HindⅡ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)如下：

5'…GTPy↓PuAC…3' 3'…CAPu↑PyTG…5'由宿主控制的限制與修飾作用

由修飾甲基轉(zhuǎn)移酶和限制性核酸內(nèi)切酶兩種酶活性配合進(jìn)行的

5’---------------GAATTC--------------3’

3’---------------CTTAAG---------------5’

EcoR

I限制作用

MEcoR

I修飾作用---G3’---CTTAA5’5’AATTC---3’

3’G----5’5’---GAATTC---3’3’---CTTAAG---5’

+EcoRIEcoRI與MEcoRI的限制與修飾作用機(jī)理限制性內(nèi)切酶的命名o限制性酶采用三字母的命名原則，即屬名+種名+株名的1個(gè)首字母，再加上序號(hào)，將限制性內(nèi)切核酸酶的命名要點(diǎn)列于表。3-4個(gè)字母組成,方式是:屬名+種名+株名+序號(hào)取屬名的第1個(gè)字母,且大寫(xiě)取種名的第1個(gè)字母,小寫(xiě)①取種名的第2個(gè)字母,小寫(xiě);②若種名有詞頭,且已命名過(guò)內(nèi)切酶,則取詞頭后的第一字母代替若有株名,株名則作為第4字母,是否大小寫(xiě),根據(jù)原來(lái)的情況而定若在同一菌株中分離了幾個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶,則按先后順序冠以I、II、III,.....等基本原則首字母第2字母第3字母第4字母順序號(hào)限制性內(nèi)切核酸酶的命名要點(diǎn)

要點(diǎn)

表?xiàng)l目Escherichia

ColiEcoRⅠRy13屬名種類(lèi)株系編號(hào)3.限制與修飾系統(tǒng)的種類(lèi)o根據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類(lèi)和是否需要輔助因子，限制與修飾系統(tǒng)至少可分為四類(lèi)。o在已純化分類(lèi)的3000多種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過(guò)250種的特異識(shí)別序列。ⅡⅠⅢ酶分子內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起三亞基雙功能酶(R，M，S亞基)二亞基雙功能酶識(shí)別位點(diǎn)4-6bp,大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)非對(duì)稱5-7bp非對(duì)稱切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn)無(wú)特異性，至少在識(shí)別位點(diǎn)外1000bp在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)分開(kāi)的反應(yīng)互斥同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)限制作用是否需用ATPNoYesYes表2-2各種限制與修飾系統(tǒng)的比較Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)o限制酶：一般是同源二聚體（homodimer

），由兩個(gè)彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個(gè)亞單位作用在DNA鏈的兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)上。o修飾酶：?jiǎn)误w，修飾作用一般由兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。o它們識(shí)別回文對(duì)稱序列（palindromesequence），在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA，產(chǎn)生帶3'-羥基和5'-磷酸基團(tuán)的DNA產(chǎn)物，需Mg2+，相應(yīng)的修飾酶只需SAM。識(shí)別序列主要為4-6bp，或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列，切割位置因酶而異。oⅡs型（typeⅡs）限制與修飾系統(tǒng)，占5%，與Ⅱ型具有相似的輔因子要求，但識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱，也是非間斷的，長(zhǎng)度為4-7bp，切割位點(diǎn)可能在識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的20bp范圍內(nèi)。o其限制酶和甲基化酶（即R亞基和M亞基）各作為一個(gè)亞基存在于酶分子中，另外還有負(fù)責(zé)識(shí)別DNA序列的S亞基，分別由hsdR、hsdM

和hsdS

基因編碼，屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）。如EcoK

編碼基因的結(jié)構(gòu)為R2M2S,EcoB編碼基因的結(jié)構(gòu)為R2M4S2。oEcoB酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的A*為甲基化位點(diǎn)，N表示任意堿基。TGA*（N）8TGCToEcoK酶的識(shí)別位點(diǎn)如下，其中兩條鏈中的A°為可能的甲基化位點(diǎn)。AA°C（N）6GTGCo但是EcoB酶和EcoK酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)1000bp以外，且無(wú)特異性。Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)hsd:hostspecificityforDNArestrictionI類(lèi)酶的作用方式(引自Lewin,1997)o在一定序列上識(shí)別DNA分子,并能同DNA分子作用,因其識(shí)別DNA后,要朝一個(gè)方向或兩個(gè)方向移動(dòng)一段距離(通常為1000個(gè)堿基左右)，并且要形成一個(gè)環(huán)才能切割DNA,所以識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，產(chǎn)生的片段較大。Ⅲ型（typeⅢ）限制與修飾系統(tǒng)o種類(lèi)更少，所占比例不到1%，如EcoP1和EcoP15。它們的識(shí)別位點(diǎn)分別是AGACC和CAGCAG，切割位點(diǎn)則在下游24-26bp處。oEcoP1是由兩個(gè)亞基組成，一個(gè)亞基(M亞基)負(fù)責(zé)位點(diǎn)識(shí)別和修飾。另一個(gè)亞基(R亞基)具有核酸酶的活性。切割DNA時(shí)需要ATP，Mg2+，也能被SAM激活，但并非必需。oⅢ類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶(引自Lewin,1997)2.1.2限制酶識(shí)別的序列1．限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度o限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為4-8個(gè)堿基，最常見(jiàn)的為6個(gè)堿基。o當(dāng)識(shí)別序列為4個(gè)和6個(gè)堿基時(shí)，它們可識(shí)別的序列在完

全隨機(jī)的情況下，平均每256個(gè)和4096個(gè)堿基中會(huì)出現(xiàn) 一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)（44

=256，46

=4096）。o注意：識(shí)別位點(diǎn)存在的概率不同！2．限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)o限制酶識(shí)別的序列大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在

DNA兩條鏈相對(duì)稱的位置。o特例：（見(jiàn)下頁(yè)舉例）識(shí)別序列不是對(duì)稱的識(shí)別多種序列識(shí)別的序列呈間斷對(duì)稱，對(duì)稱序列之間含有若干個(gè)任意堿基。EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTT

CTTAA↑GTTCGA↑A識(shí)別序列不是對(duì)稱的AccBSⅠCCG↓CTCBssSⅠC↓TCGTG

GGC↑GAGGAGCA↑C識(shí)別多種序列AccⅠGT↓MKAC，M=A或C,K=G或T識(shí)別的序列呈間斷對(duì)稱AlwNⅠCAGNNNC↓TGDdeⅠC↓TNAGGT↑CNNNGACGANT↑C3．限制酶切割的位置o限制酶對(duì)DNA的切割位置大多數(shù)在內(nèi)部，但也有在外部的。在外部的，又有兩端、兩側(cè)和單側(cè)之別。

2.1.3限制酶產(chǎn)生的末端1．限制酶產(chǎn)生匹配粘端（matchedend）o識(shí)別位點(diǎn)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生 的末端為匹配黏端，亦即黏性末端（cohesiveend）。o若在對(duì)稱軸5′側(cè)切割底物，DNA雙鏈交錯(cuò)斷開(kāi)產(chǎn)生5′

突出黏性末端；o若在3′側(cè)切割，則產(chǎn)生3′突出黏性末端。NNG↓AATTCNNNNCTTAA↑GNNEcoRⅠ＋NNGNNCTTAAAATTCNN GNNPstI5’----NCTGCA↓GN----3’3’----NG↑ACGTCN----5’5’----NCTGCA3’----NG

GN----3’ACGTCN----5’＋2．限制酶產(chǎn)生平末端（Bluntend）o在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈，則產(chǎn)生 平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV

（GAT↓ATC）。5’----NCCC↓GGGN----3’SmaI5’----NCCC+3’----NGGG↑CCCN----5’ CCCN----5’ GGGN----3’

3’----NGGG平末端o產(chǎn)生平末端的DNA可任意連接，但連接效率較黏 性末端低。3．限制酶產(chǎn)生非對(duì)稱突出末端o當(dāng)識(shí)別序列為非對(duì)稱序列時(shí)，切割的DNA產(chǎn)物的末端是不同的，如BbvCⅠ，它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下：CC↓TCAGCGGAGT↑CGo有些限制酶識(shí)別簡(jiǎn)并序列，其識(shí)別的序列中有幾種是非對(duì)稱的。如AccⅠ，它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下:GT↓AT/CGACCATA/GC↑TGo有些限制酶識(shí)別間隔序列，間隔區(qū)域的序列是任意的，如DraⅢ，識(shí)別切割位點(diǎn)是CAC↑NNN↓GTG。

4．同裂酶（isoschizomer）o識(shí)別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)可 能不同。①同序同切酶識(shí)別序列和切割位置都相同，如HpaⅡ與

MapⅠ識(shí)別切割位點(diǎn)為C↓CGG。②同序異切酶KpnⅠ和Acc65Ⅰ識(shí)別的序列是相同的，但切

割位點(diǎn)不同，分別為GGTAC↓C和G↓GTACC。③“同功多位”許多識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶包含了另一種限 制酶的功能。如EcoRⅠ為G↓AATTC，ApoⅠ為R↓AATTY， 后者可識(shí)別前者的序列。④其他有些限制酶識(shí)別的序列有交叉，如在pUC系列質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsite,MCS）中有一個(gè)SalⅠ位點(diǎn)（G↓TCGAC），該位點(diǎn)也可被AccⅠ（GT↓MKAC）和Hinc

Ⅱ（GTY↓RAC）切割。R=A,GY=C,T5．同尾酶o許多不同的限制酶切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的，且 是對(duì)稱的，即它們可產(chǎn)生相同的黏性突出末端。這些 酶統(tǒng)稱為同尾酶（isocaudarner）。這些酶切割DNA

得到的產(chǎn)物可進(jìn)行互補(bǔ)連接。oEcoRⅠG↓AATTCMfeⅠC↓AATTCoSpeⅠA↓CTAGTNheⅠG↓CTAGCXbaⅠT↓CTAGAoBamHⅠG↓GATCCBglⅡA↓GATCTSau3AⅠ/MboⅠ↓GATC

MunI：5`-CAATTG-3` 3`-GTTAAC-5`EcoRI：5`-GAATTC-3` 3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新連接后的序列：5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`同尾酶（isocaudamer

）用途6．歸位內(nèi)切酶(了解）o有些線粒體、葉綠體、核DNA、T偶數(shù)噬菌體含 有一些編碼內(nèi)切酶的內(nèi)含子，有些內(nèi)含肽 （intein，蛋白質(zhì)剪切的產(chǎn)物）也有內(nèi)切酶的 活性。o這兩類(lèi)內(nèi)切核酸酶稱為I-prefix和PI-prefix系 列內(nèi)切酶，它們識(shí)別的序列很長(zhǎng)。I-prefix系 列酶是由在RNA水平上剪切的產(chǎn)物編碼的，PI- prefix系列酶是在蛋白質(zhì)水平上剪切的產(chǎn)物。o這類(lèi)內(nèi)切酶也稱為歸位內(nèi)切酶（homing

endonuclease）。2.1.4DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響o限制酶切割

DNA時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是說(shuō)在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。o不同的酶對(duì)識(shí)別序列兩端的長(zhǎng)度有不同的要求,見(jiàn)表2-4。o在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。限制酶待測(cè)的寡核苷酸序列酶切活性2h20hAccⅠCCGGTCGACCGG00Hin

dⅢCAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG1075EcoRⅠGGAATTCC＞90＞90PstⅠGCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAG（N）14＞90＞90CTGCAG（N）2000表2-4靠近DNA片段末端的切割效率（%）限制性內(nèi)切酶的活性單位o可用酶單位（unit）來(lái)描述其量的多少。o1個(gè)單位酶是指在建議使用的緩沖液及溫度下，在20μl

反應(yīng)液中反應(yīng)1h，使1μgDNA完全消化所需的酶量。應(yīng)該記的縮寫(xiě)：Tris:三羥甲基氨基甲烷BSA:牛血清白蛋白DTT:二硫蘇糖醇DMSO:二甲基亞砜o在雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇酶切秩序。o在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。2.1.5位點(diǎn)偏愛(ài)某些限制酶對(duì)同一底物中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛(ài)性切割，即對(duì) 不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率，這種 現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛(ài)（sitepreference）。oEcoRⅠ酶切割λ噬菌體DNA中的5個(gè)位點(diǎn)時(shí)并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快10倍；2.1.6酶切反應(yīng)條件1．緩沖液o常規(guī)緩沖液一般包括提供穩(wěn)定pH值的緩沖劑、Mg2+、DTT（二硫蘇糖醇）以及BSA（牛血清白蛋白）。opH7.0-7.9（在25℃時(shí)）；oMg2+作為酶的活性中心，由MgCl

2或乙酸鎂提供；濃度常為10mmol/L；DTT濃度常為1mmol/L。o有時(shí)緩沖液中還要加入100μg/mlBSA。o不同的酶對(duì)離子強(qiáng)度的要求差異很大，據(jù)此可將將限制酶緩沖液按離子強(qiáng)度的差異分為高、中、低3種類(lèi)型，離子強(qiáng)度以NaCl來(lái)滿足，濃度分別為100mmol/L、50mmol/L和0mmol/L。酶標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中的NaCl濃度 ／（mmol／L）限制酶的活性0.5×1×2×EcoRⅠ10050-7575-100100HindⅢ5025-50100100HincⅡ100100100100KpnⅠ010010025-50PstⅠ10075100100SAlⅠ100﹤25﹤25100ApaⅠ010010025-50表2-5標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中的NaCl濃度和限制酶的活性2．反應(yīng)溫度o反應(yīng)溫度大多數(shù)為37℃，一部分為50-65℃，少數(shù)25-30℃。o高溫作用酶在37℃下的活性會(huì)下降，多數(shù)僅為最適條件下的10-50%。如TaqⅠ限制酶（正常反應(yīng)溫度為65℃），在37℃只有在65℃活性的10%；ApoⅠ（正常反應(yīng)溫度為50℃），37℃只有在50℃時(shí)活性的50%。o銷(xiāo)售商在產(chǎn)品說(shuō)明中都會(huì)標(biāo)明最佳反應(yīng)溫度。3．反應(yīng)時(shí)間o反應(yīng)時(shí)間通常為1h或更多，許多酶延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可減少酶的用量。oEcoRⅠ若反應(yīng)16h，所需酶量為正常酶切時(shí)間的1/8，即若反應(yīng)時(shí)間為16h，則所用酶量為只切1h的1/8。o其他一些酶也有類(lèi)似情況，如HindⅢ為1/8；KpnⅠ為1/4；BamHⅠ為1/2。4．終止酶切的方法oEDTA可螯合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng)，終止?jié)舛葹?0mmol/L；o加熱是常用的方法，對(duì)于最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶，在65℃或80℃處理20min可使酶活性大部分喪失。o對(duì)于在80℃作用20min也有不失活的酶，如最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶BglⅡ、HpaⅠ和PvuⅡ，65℃酶Tth111Ⅰ和TspRⅠ，以及50℃酶Bc1Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用試劑盒純化DNA。Ⅱ型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：

(1)使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解；(2)低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切；(3)一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切。2.2甲基化酶（Methylase）2.2.1甲基化酶的種類(lèi)o在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶（methylase）。o原核生物甲基化酶作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。1．Dam甲基化酶oDam可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。o有些限制酶對(duì)Dam甲基化的DNA敏感，不能切割相應(yīng)的序列，如BclⅠ、ClaⅠ和XbaⅠ等。o對(duì)甲基化不敏感的有BamHⅠ、Sau3AⅠ、BalⅡ和PvuⅠ等。MboⅠ和Sau3AⅠ識(shí)別和切割位點(diǎn)相同，但其差異就在于前者對(duì)甲基化敏感。2．Dcm甲基化酶oDcm識(shí)別CCAGG或CCTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。o受Dcm甲基化作用影響的酶有Acc65Ⅰ、AlwNⅠ、ApaⅠ、EcoRⅡ和EaeⅠ等。o不受此甲基化影響酶有BanⅡ、Bg1Ⅰ、BstNⅠ、KpnⅠ和NarⅠ等。3．EcoKⅠ甲基化酶oEcoKⅠ甲基化酶的識(shí)別位點(diǎn)少，識(shí)別AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中A的N6位置。4．SssⅠ甲基化酶oSssⅠ甲基化酶來(lái)自原核生物（Spiroplasmasp.），可使CG序列中的C在C5位置上甲基化。o甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化鏈（新合成鏈）的DNA鏈。o許多酶對(duì)此甲基化敏感，如AatⅡ、ClaⅠ、XhoⅠ、SalⅠ等，也有不敏感的，如BamHⅠ、EcoRⅠ、SphⅠ和KpnⅠ。2.2.2依賴于甲基化的限制系統(tǒng)oE.coli有3種依賴于甲基化的限制系統(tǒng)McrA、McrBC和Mrr，只識(shí)別經(jīng)過(guò)甲基化的序列，都限制由CG甲基化酶（M.SssⅠ）作用的DNA（限制即消化降解）。oMrr限制m6A；McrA限制HpaⅡ甲基化修飾的位點(diǎn)；McrBC切割（G/A）m5C；o大多數(shù)常用的E.coli都含這三個(gè)限制系統(tǒng)中的1個(gè)或幾個(gè)。2.2.3甲基化對(duì)限制酶切的影響1．修飾酶切位點(diǎn)oHincⅡ可識(shí)別四個(gè)位點(diǎn)（GTCGAC、GTCAAC、GTTGAC和GTTAAC），甲基化酶M.TaqⅠ可甲基化TCGA中的A，所以M.TaqⅠ處理DNA后，GTCGAC將不受HincⅡ切割。oM.MspⅠ修飾的產(chǎn)物為m5CCGG，在BamHⅠ識(shí)別位點(diǎn)（GGATCC）前面如果為CC或后面為GG，那么經(jīng)M.MspⅠ處理的DNA（GGATm5CCGG）對(duì)BamHⅠ不敏感（即抵抗切割）。2．產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)o通過(guò)甲基化修飾可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。DpnⅠ是依賴甲基化的限制酶，TCGATCGA受M.TaqⅠ處理后形成甲基化（A）產(chǎn)物TCG*ATCG*A，其中G*ATC即為DpnⅠ位點(diǎn)。3．對(duì)基因組作圖的影響o利用限制酶對(duì)甲基化的敏感性差異研究哺乳動(dòng)物m5CG、植物m5CG和m5CNG、腸道細(xì)胞Gm6ATC的甲基化水平和分布。TCGA甲基化TCGAm6

TCGA+TCGA

或DNA中的TCGATCGA序列連接酶

TCGATCGA

M.TaqITCGAm6TCGAm6DpnI切點(diǎn)③構(gòu)建新的酶切位點(diǎn)① ②DpnI是唯一識(shí)別GAm6TC的限制酶，而不降解GATC。

M.TaqI可使M.RECH3RERERERERERECH3與載體相連RE

甲基 化酶

RERE

人工 接頭CH3RE

RE用于基因組文庫(kù)的建立用于cDNA

的連接

RERE

RE CH3CH3RECH32.3DNA聚合酶（DNApolymeraseⅠ）o主要活性是催化DNA的合成（在有模板，引物，dNTP等的情況下）及其相輔的活性。o原核細(xì)胞有3種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長(zhǎng)有關(guān)。聚合酶Ⅰ是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA的延長(zhǎng)；聚合酶Ⅱ則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長(zhǎng)有關(guān)；聚合酶Ⅲ在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長(zhǎng)的主要酶。基因工程研究中常用的聚合酶聚合酶類(lèi)：大腸桿菌DNA聚合酶I

大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow酶

T4DNA聚合酶

T7DNA聚合酶修飾的T7DNA聚合酶TaqDNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶作用：在DNA模板鏈上將dNMP連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化合成以模板互補(bǔ)的DNA序列共同特點(diǎn)：具有催化核苷酸聚合能力，但在外切酶活性，聚合速率等方面各有差別。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)合成能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無(wú)中低T4DNA聚合酶高無(wú)中低T7DNA聚合酶高無(wú)快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶無(wú)無(wú)快高逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)無(wú)低中TaqDNA聚合酶無(wú)有快高常用DNA聚合酶的特性比較2.3.1大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolymeraseⅠ）1．E.coli

DNA聚合酶Ⅰ的活性oE.coli

DNA聚合酶Ⅰ為單鏈多肽（109kDa），有3種活性。①5‘--3’DNA聚合酶活性反應(yīng)底物為單鏈DNA及引物（帶3‘-OH基）或5’突出的雙鏈DNA。Mg++,dNTPDNA聚合酶Ⅰ②5‘--3'外切核酸酶活性o反應(yīng)底物是雙鏈DNA或DNA:RNA雜交體，它可從5‘端降解雙鏈DNA，也降解RNA:DNA中的RNA（RNaseH活性）。Mg++,dNTPDNA聚合酶Ⅰ

③3'--5'外切酶活性o反應(yīng)底物是帶3‘-OH的雙鏈DNA或單鏈DNA，其活性從

3’-OH端降解DNA，可被5‘--3’聚合活性封閉，也可被 帶5‘磷酸的dNMP所抑制。

Mg++DNA聚合酶ⅠMg++,dNTP DNA聚合酶Ⅰo3’-5’外切酶活性與DNA聚合酶的校正功能有關(guān)。④交換（置換）反應(yīng)o如果只有一種dNTP存在，3‘--5’外切活性將從3‘-OH端

降解DNA，然后在該位置發(fā)生一系列連續(xù)的合成和外切反 應(yīng)，直到露出與該dNTP互補(bǔ)的堿基。o總之，在沒(méi)有dNTP

的情況下，外切活性占主導(dǎo)地位，而 當(dāng)存在足夠的dNTP

時(shí)，外切活性和合成活性將處在動(dòng)態(tài) 平衡中，結(jié)果使得雙鏈DNA成為平末端。2．E.coli

DNA聚合酶Ⅰ的用途①切口平移法（nicktranslation）標(biāo)記DNA②用于cDNA

克隆中的第二鏈，即單純的DNA聚合活性。但由于具有5‘--3’外切活性，現(xiàn)在已不再使用，而改用Klenow

酶和反轉(zhuǎn)錄酶（詳見(jiàn)后文）。③對(duì)3'突出端的DNA作末端標(biāo)記（交換或置換反 應(yīng)），但是此反應(yīng)用T4或T7DNA聚合酶效果會(huì)更好 （詳見(jiàn)后文）。交換或置換反應(yīng)2.3.2KlenowDNA聚合酶oKlenowDNA聚合酶是從全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影響。也稱為Klenow片段（Klenow

frgment），或E.coli

DNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coli

DNApolymeraseⅠlargefragment）。o它也可以通過(guò)基因工程得到，分子量為76kDa。o由于沒(méi)有5′―3′外切活性，使用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。用途①補(bǔ)平3′凹端DNA使用單純的DNA合成活性。注意要 加足夠的dNTP；如果使用帶標(biāo)記的dNTP，則可對(duì)DNA

進(jìn)行末端標(biāo)記。②抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性作用下，可切除突出的3′凸端。③通過(guò)置換反應(yīng)對(duì)DNA進(jìn)行末端標(biāo)記該作用已經(jīng)被T4

或T7DNA聚合酶代替；它還可以在補(bǔ)平3′凹端的過(guò) 程中進(jìn)行標(biāo)記。④在cDNA克隆中合成第二鏈⑤隨機(jī)引物標(biāo)記⑥應(yīng)用于Sanger雙脫氧鏈末端終止法的DNA測(cè)序（被T7DNA聚合酶取代）⑦應(yīng)用于PCR反應(yīng)，被Taq

DNA聚合酶等取代⑧在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈DNA2.3.3T4噬菌體DNA聚合酶（T4phageDNApolymerase）oT4噬菌體DNA聚合酶來(lái)源于T4噬菌體感染的E.coli，分子量為114kDa。o與Klenow酶活性相比有如下幾個(gè)特點(diǎn)：①外切酶活性對(duì)單鏈比對(duì)雙鏈更強(qiáng)，比Klenow強(qiáng)100-1000倍。酶活性.可用替代/置換合成法標(biāo)記探針。③補(bǔ)平或標(biāo)記3’末端凹陷的DNA分子DNA片段的同位素末端標(biāo)記5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’

5’G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’T4-DNApolMg2+5’ppp

dN

5’pppdA（a-32P-dATP）T4-DNApol5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’2.3.4T7噬菌體DNA聚合酶（T7phageDNApolymerae）蛋白質(zhì)復(fù)合體，一種是噬菌體基因5蛋白，另一個(gè)是宿主蛋白的硫氧還蛋白。o是所有DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)的一個(gè)，產(chǎn)物平均長(zhǎng)度大，在測(cè)定核苷酸序列時(shí)有優(yōu)勢(shì)。o活性與T4噬菌體DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶類(lèi)

似，但3′―5′外切活性為Klenow的1000倍。o可替代T4的功能并可用于長(zhǎng)模板的引物延伸。商品化的測(cè)序酶oSequenase（測(cè)序酶）：美國(guó)UnitedStatesBiochemical公司改造的T7噬菌體DNA聚合酶，切除了99%以上的3′―5′外切活性。oSequenaseVersion2：切除了所有的3′―5′外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對(duì)長(zhǎng)片段進(jìn)行測(cè)序的理想用酶。2.3.5耐熱DNA聚合酶o耐熱DNA聚合酶在高溫下有DNA聚合活性，來(lái)自噬高溫的細(xì)菌，主要用于PCR反應(yīng)，如Taq

DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、Pfu

DNA聚合酶、Pwo

DNA聚合酶和Tth

DNA聚合酶等。oAMV逆轉(zhuǎn)錄酶分子量為1.6×105dal,由α、β兩種亞基組成，具有5’→3’聚合作用的反轉(zhuǎn)錄酶活性和

RNaseH活性，這種酶又稱依賴于RNA的DNA聚合酶。oM-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶是單鏈多肽，84kDa，其RNAseH活性弱，有利于合成較長(zhǎng)cDNA。其基因工程產(chǎn)品純度高。2.3.6反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）有兩種反轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)商品化：一種來(lái)自禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)；另一種是鼠白血病病毒(Mo-MLV)基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+

dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’DNA3’5’3’RNA5’DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’DNA3’o用途:1.可以mRNA為模板合成單鏈cDNA；2.也可以單鏈cDNA為模板合成雙鏈DNA；3.還可利用單鏈DNA或RNA作模板合成分子探針。這是分離真核生物基因制備cDNA文庫(kù)常用的方法。探針可用于檢測(cè)DNA或RNA。2.3.7末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）o是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。①合成方向5’→3’②合成時(shí)不要模板，但底物至少要3個(gè)核苷酸，③對(duì)dNTP非特異性，任一種都可以作底物，④可催化3’－OH末端單鏈或3’－OH突出的雙鏈，需要Mg++或Mn++，⑤用Co++代替Mg++作輔助因子，可在平末端DNA分子上進(jìn)行末端轉(zhuǎn)移。pmol3′-OH:μM

dNTPdAdCdGdT1:0.11～101～51～51～101:1.510～3010～3010～2010～351:3.0100～

200100～

20015～35200～

2501:15400～

500400～

50015～35300～

400表2-6末端轉(zhuǎn)移酶形成的同聚尾的長(zhǎng)度①給載體或cDNA加上互補(bǔ)同聚物尾，

②標(biāo)記DNA片段的3’－OH端，可用α－32P－dNTP也可催化非放射性標(biāo)記物參入DNA3’－末端，③合成多聚脫氧核苷酸同聚物。用途2.4其他分子克隆工具酶2.4.1依賴于DNA的RNA聚合酶（DNA dependentRNApolymerase）o依賴于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌體RNA聚合酶和T4

或T7噬菌體RNA聚合酶。1．活性o轉(zhuǎn)錄中的RNA合成酶，識(shí)別DNA中各自特異的啟動(dòng)子序 列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。它與DNA聚合酶 不同，無(wú)需引物，但需識(shí)別特異性位點(diǎn)。2．用途①體外合成RNA分子。②用于表達(dá)外源基因。2.4.2連接酶（ligase

）DNA連接酶的基本反應(yīng)特性o催化雙鏈DNA切口處的5'-磷酸和3'-羥基生成磷酸二酯鍵o連接反應(yīng)需要供給能量。大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來(lái)源。DNA連接酶的作用機(jī)理1．T4DNA連接酶（T4DNAligase）oT4DNA連接酶的分子量為68kDa，催化DNA5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵。反應(yīng)底物為粘端、切口、平端的RNA（但效率低）或DNA。低濃度的聚乙二醇PEG（一般為10%）和單價(jià)陽(yáng)離子（150-200mM

NaCl）可以提高平端連接速率。o連接反應(yīng)條件需要ATP，若在16℃反應(yīng)，大約需4小時(shí)；若在4℃反應(yīng)，則需反應(yīng)過(guò)夜。2．E.coliDNA連接酶（E.coli

DNAligase）o與T4DNAligase活性相似，但需NAD+參與，且其平端連接效率低，常用于置換合成法合成cDNA。作cDNA克隆時(shí)，不會(huì)將RNA連接到DNA，不連接RNA。3．Taq

DNA連接酶oTaq

DNA連接酶可在兩個(gè)寡核苷酸之間進(jìn)行連接反應(yīng)，同時(shí)必須與另一DNA鏈形成雜交體，相當(dāng)于連接dsDNA中的缺口，作用在45℃-65℃，需NAD+。TDNAligase

4E.coliDNA

ligase來(lái)源T噬菌體

4大腸桿菌分子量68,00075,000輔助因子ATP

+NAD底物1.雙鏈DNA分子的粘,平端2.RNA-DNA雜和體,RNA鏈缺口3.雙鏈DNA中的單鏈缺口同源互補(bǔ)粘端 雙鏈分子中的單鏈 缺口應(yīng)用范圍廣泛，效率高窄影響連接反應(yīng)的因素1．反應(yīng)時(shí)間與溫度：連接酶最適的反應(yīng)溫度應(yīng)是37℃，但 在這一溫度下粘性末端的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，因此連接反 應(yīng)常采用的最佳溫度一般在4-16℃間，通常多選用12- 16℃30分鐘到16小時(shí)。2．連接酶的用量：粘性末端DNA連接的酶用量在0.1單位時(shí) 就可以達(dá)到最佳的連接效果，而平端DNA連接所需酶的 至少需要提高10-20倍。3．DNA底物的濃度：一般情況下對(duì)于連接200-500bp的外源DNA連接體積在0.1-0.3ug/10ul。插入片段:載體分子的摩爾比為3:1為較好。4．其他干擾因素：EDTA，雜蛋白質(zhì)，存留有活性的酶等影響酶切的因素也影響連接。4．T4RNA連接酶oT4RNA連接酶可以催化單鏈DNA或RNA的5′-磷酸與另一單鏈DNA或RNA的3′羥基之間形成共價(jià)連接。o可用于標(biāo)記RNA的3′末端、單鏈DNA或RNA的連接、增強(qiáng)T4DNA連接酶的連接活性以及合成寡核苷酸。2.4.3T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）o該酶催化γ－磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或RNA分子的5’－OH末端。o可分為正向反應(yīng)和交換反應(yīng)標(biāo)記法。o用途:該酶主要用于對(duì)缺乏5′-磷酸的DNA或合成接頭進(jìn)行磷酸化,同時(shí)可對(duì)末端進(jìn)行標(biāo)記。正向反應(yīng)：+r-32P-ATP+ADP5’OHDNA---- or5’OHRNA----

Mg++T4kinase5’[32P]DNA or 5’[32P]RNA交換反應(yīng)：反應(yīng)物中r-32P-ATP和ADP超量時(shí)，該酶就會(huì)催化DNA分子末端發(fā) 生交換+r-32P-ATP+ADP5’PDNA or5’PRNA

Mg++T4Kinase5’[32P]DNA or5’[32P]RNA+ATP+ADP2.4.4堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）o來(lái)源:牛小腸堿性磷酸酶（Calfintestnalalkalinephosphatase），簡(jiǎn)稱CIP或CIAP， 細(xì)菌的堿性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase,BAP）蝦的堿性磷酸酶（shrimpalkalinephosphatase,SAP）。o均能催化除去DNA或RNA5′磷酸的反應(yīng)。o通過(guò)去除5′磷酸基團(tuán)，可用于防止DNA片段自身連接，或標(biāo)記（5′端）前除DNA或RNA5′磷酸。堿性磷酸酶活性2.4.5核酸酶（nuclease）1．BAL31核酸酶（BAL31nuclease）o來(lái)源:交替單胞菌（alteromonas

espejiana）BAL31o主要活性:3′外切核酸酶活性，可從線性DNA

兩條鏈的3′端迅速去除單核苷酸，隨后可從單 鏈DNA內(nèi)部發(fā)揮緩慢的內(nèi)切酶活性，形成截短 了的平端雙鏈DNA分子（約占10-20%）以及帶 有約5個(gè)核苷酸突出單鏈的截短分子（約占80- 90%）。對(duì)于所形成的單鏈突出，可用DNA聚 合酶補(bǔ)平。2．Sl核酸酶（S1nuclease）o來(lái)源:米曲霉（

aspergillus

oryzae）o作用方式:降解單鏈DNA和RNA，包括雙鏈分 子中的單鏈區(qū)，產(chǎn)生5’－磷酸化單核苷酸或寡核苷酸。

對(duì)于雙鏈DNA或RNA以及DNA：RNA雜合鏈 的作用相對(duì)較低但大大提高酶量也可降解雙鏈

DNA，特別對(duì)是有切口或缺口的雙鏈DNA。o用途:用于分析DNA:RNA雜交體的結(jié)構(gòu)，給

RNA分子定位，證明基因內(nèi)部?jī)?nèi)含子的存在;

去掉雙鏈核酸中突出的單鏈尾從而產(chǎn)生平末端;打開(kāi)雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)莢環(huán)。3．綠豆核酸酶（mungbeannuclease）o來(lái)源于綠豆芽，與Sl酶相似，但比Sl酶更溫和。在大切口上才切割，更容易使雙鏈DNA突出端變成平端。4．核糖核酸酶A（ribonucleaseA或RNaseA）o來(lái)源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3′端。可除去DNA:RNA中未雜交的RNA區(qū)，可用來(lái)確定DNA或RNA中單堿基突變的位置。廣泛用來(lái)去除DNA樣品中的RNA。5．脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）o來(lái)源:牛胰，是內(nèi)切核酸酶，可優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA。在Mg2+存在下，獨(dú)立作用于每條DNA鏈，且切割位點(diǎn)隨機(jī)。在Mn2+存在下，它可在兩條鏈的大致同一位置切割dsDNA，產(chǎn)生平端或1-2個(gè)核苷酸突出的DNA片段。o用途:切口平移標(biāo)記時(shí)在dsDNA上隨機(jī)產(chǎn)生切口；在閉環(huán)DNA上引入單切口，以將分子截短（在亞硫酸氧鹽介導(dǎo)的誘變前）；建立隨機(jī)缺失的嵌套缺失體，用于功能分析或測(cè)序；在DNA酶足跡法（DNAfootprinting）中分析蛋白:DNA復(fù)合物；除去RNA樣品中的DNA。6．外切核酸酶Ⅲ（exonuleaseⅢ）o大腸桿菌外切核酸酶Ⅲ催化從dsDNA3′-OH逐一去除單

核苷酸的反應(yīng)，底物為dsDNA或線狀和帶切口或缺口的 環(huán)狀DNA，反應(yīng)結(jié)果是在dsDNA上產(chǎn)生長(zhǎng)長(zhǎng)的單鏈區(qū)。o該酶還有對(duì)無(wú)嘌呤DNA特異性內(nèi)切核酸酶活性、RNaseH活性和3′-磷酸酶活性（去磷酸）。o但不降解核酸內(nèi)的磷酸二酯鍵，也不降解單鏈DNA及帶3′突出的dsDNA。o該酶持續(xù)作用能力不強(qiáng)，產(chǎn)物為切割程度不相上下的群體，有利于分離長(zhǎng)短不等的DNA。7．核糖核酸酶H（ribonucleaseH或RNaseH）o性質(zhì):內(nèi)切核酸酶，特異性水解與DNA雜交的RN