乙肝表面抗原ELISA法定量分析方法學驗證

乙肝表面抗原的ELISA法定量解析方法學考據(jù)大綱目的：對福州宏圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量解析試劑盒進行方法學考據(jù)，以判斷可否能用于臨床樣本解析。方法：ELISA法定量解析，應用試劑盒HBsAg標準品從濃度為8ng/ml做2倍稀釋的6個濃度梯度做標準曲線，以6，3，個濃度梯度5復孔做正確度，精美度和檢測限等方法學考據(jù)。結(jié)果：標準曲線，正確度97.07%的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應<15%的要求，檢測限LOD為，低濃度樣品（）的檢測在正確性和精美度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測。結(jié)論：該HBsAg的ELISA法定量解析試劑盒不能夠用于臨床標本的解析。要點詞：乙肝表面抗原ELISA定量解析方法學考據(jù)、八 、■前言乙肝病毒感染是我國最常有的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清標志物是檢測乙肝病毒感染最主要的病原標志。隨著免疫學技術(shù)的不斷發(fā)展，抗原抗體檢測矯捷度明顯提高，使低水平乙肝病毒得以檢出，對臨床診斷及流行病學有重要意義 [1]。ELISA法擁有較高靈敏度、特異性強、重復性好、可進行定量和半定量測定等優(yōu)點，能夠在酶免疫解析儀上做批量檢測。目前臨床上多傾向于做定量解析，若想知道檢驗結(jié)果可否可靠，實驗室則必定對所用試劑盒進行方法學考據(jù)，本實驗對福州宏圖生物工程有限公司生產(chǎn)的 HBsAg的ELISA法定量解析試劑盒進行正確度，精美度和檢測限等方法學考據(jù)，現(xiàn)報告以下。1.資料與方法試劑盒乙肝表面抗原ELISA法定量解析試劑盒，福州宏圖生物工程有限公司出品。儀器酶標儀：Bio-Rad680；洗板機：Bio-Rad1575；超純水系統(tǒng)：MilliporeElix；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)上海精宏實驗設備有限公司；振蕩器(蘇州管械， KJ-201A)；移液器；Tip頭；EP管。方法1.3.1．溶液配置1XPBS緩沖液的配置： 稱取8gNaCl、0.2gKC1、Na2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)治溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。標準品的配置：原始標準品濃度為8ng/ml。。取6個2mlEP管，分別標志為S1-S6。50ul/well,共1孔需50ul，每孔配置60ul備用，依據(jù)下表稀釋方案進行稀釋。表1標準品的稀釋方案質(zhì)控品的配置：50ul/well,共5復孔需250ul，配置300ul備用，取3個2mlEP管，分別標志為C1,C2,C3，依據(jù)下表稀釋方案進行稀釋。表2質(zhì)控品的稀釋方案1.3.2．鋪板方案取出試劑盒中已包被酶標板，取出板條，依據(jù)下表鋪板方案進行鋪板在相應孔中依次加入系列標準品、質(zhì)控品及空白比較，每孔50ul。空白比較加入1XPBS緩沖液。表3鋪板方案1.3.3．加樣步驟加入酶標抗體，50ul/well ，震蕩。37°C電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min，取出后洗板4次，加入A、B液,50ul/well，37C電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育15min。加入停止液，50ul/well。酶標板放入酶標儀，蓋上蓋子，在電腦上打開 軟件，選擇450nm波長(參照波長630nm)，設置LAYOUT和報告模式，測定各孔吸取值。2.結(jié)果標準曲線與線性范圍標準品理論濃度對應的實測OD值表4實測OD值以HBsAg理論濃度為橫坐標，所測OD值為縱坐標作圖，繪制標準曲線觀察線性關(guān)系，結(jié)果顯示，顯示擁有優(yōu)異的相關(guān)性Absorbance(OD)Conc(ng/ml)圖1線性關(guān)系圖正確度(回收率)的考據(jù)質(zhì)控品理論稀釋濃度對應實測濃度值表5實測濃度值質(zhì)控品做了3個濃度梯度，每個濃度做了5個復孔，下表是對每個濃度梯度進行正確度(回收率)的考據(jù)。表6正確度的考據(jù)結(jié)果顯示HBsAg6ng/ml和3ng/ml的平均回收率為97.58%，113.07%，滿足限度要求在85%-115%的范圍內(nèi)，而的平均回收率為80.56%，滿足方法定量限在80%-120%的范圍內(nèi)3個濃度梯度的平均回收率為97.7%，顯示正確性好。2.3精美度的考據(jù)板內(nèi)精美度的考據(jù)上表中RSD(%)這一參數(shù)表示相對標準誤差，也就是變異系數(shù) CV值，HBsAg6ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精美度不高，但是也吻合ng/ml級RSD水平的一般應<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其他孔比較差異較大，可能是由于操作引起比方加樣嚴禁。而3ng/ml,和的變異系數(shù)CV為3.5%，3.7%，吻合顯示孔間重復性好，吻合ng/ml級RSD水平的一般應<15%的要求，精美度高。板間精美度的考據(jù)從同一實驗室中獲得2組同樣的數(shù)據(jù)，做板間精美度的考據(jù)。第一對同一實驗條件下不同樣實驗人員所獲得的數(shù)據(jù)可否可用于板間解析做考據(jù)。表8板間精美度的考據(jù)以HBsAg理論濃度為橫坐標，所測OD值為縱坐標作圖，繪制標準曲線觀察線性關(guān)系。Absorbance(OD)Conc(ng/ml)圖2線性關(guān)系曲線以上標準曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2=0.967，第三組數(shù)據(jù)R2=0.991。第二組數(shù)據(jù)由于有一些孔與標準曲線偏離較大，但考慮到隨機抽樣與均數(shù)存在必然誤差，還是能夠用于統(tǒng)計學解析。下表對3組數(shù)據(jù)做板間解析。從表中3個組的數(shù)據(jù)比較可知，HBsAg6ng/ml和3ng/ml的RSD分別為9.10%，12.06%滿足對ng/ml級水平的RSD一般應<15%的要求，精美度高。而的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應<15%的要求，顯示低濃度的孔間重復性差，精美度不是很高，故以下對HBsAg理論濃度為的三組數(shù)據(jù)做解析。對HBsAg理論濃度為的正確性，精美度解析表9精美度解析從上表可知第一組數(shù)據(jù)和第三組數(shù)據(jù)正確性差，精美度高。而第二組數(shù)據(jù)正確性高，而精美度有對于第一組和第三組數(shù)據(jù)要好。綜上對于HBsAg理論濃度為的這一低濃度梯度的板內(nèi)正確性和板間精美度有對于高濃度的線性要差一些。檢測限（LOD）計算LOD為取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標準差。表10空白孔的OD值由上表可知，LOD為0.172。檢測限（LOD）表示解析方法檢測低濃度樣品的能力，也稱為方法的矯捷度，LOD平時為標準曲線上的最低濃度點，要求標準曲線上的最低濃度點應>LOD，此標準曲線上最低濃度點為0.25，大于LOD（0.172），故此標準曲線線性好。3.談論乙肝表面抗原定量解析的意義乙肝表面抗原是乙肝兩對半的其中一項，乙肝兩對半定性檢測對乙肝疾病的診斷，病情監(jiān)測，療效觀察起到了必然的作用。但隨著臨床醫(yī)學的發(fā)展，乙肝兩對半定性檢測已經(jīng)遠遠不能夠滿足臨床及患者的要求，特別是在療效觀察以及乙肝疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上有明顯的不足。隨著檢驗醫(yī)學的發(fā)展，乙肝兩對半定量測定成為可行，大大填充了乙肝兩對半定性檢測的不足。而且乙肝兩對半定量檢測可與HBVDNA熒光測定相互補充，綜合談論患者病情與藥物療效，為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者供應了正確判斷病情的依據(jù)。這在目前的臨床治療中應用十分寬泛。常用定量解析方法此次實驗可是對一種試劑盒的可用性進行方法學考據(jù)，而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又稱解離增強鑭系熒光免疫解析，是近十年發(fā)展起來的一種微量解析方法。此技術(shù)集酶標志、同位素標志技術(shù)的優(yōu)點于一身，擁有矯捷度高、特異性強、穩(wěn)定性好，且測定范圍更寬，試劑盒貨架壽命長，操作簡略和非放射性等特點，成為最有潛力的一種標志免疫解析方法【3】。全自動酶免解析儀目前也寬泛應有，自動化、標準化的操作手段使實驗達到了全過程控制和全過程標準化解析，大大提高了實驗的精美度【4】，使檢測結(jié)果更趨牢固，從而保證了實驗結(jié)果的可靠性。方法歸納目前寬泛使用的HBsAg試劑盡管在制備時采用了高親和力的單克隆抗體，而且使包被

抗體、酶標抗體的結(jié)合位點盡可能的遠。以防備競爭控制，最大程度地解決鉤狀效應（HOOK）的問題【5】。本次實驗是對實驗室的一種試劑盒，即福州宏圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量解析試劑盒進行方法學考據(jù)，以判斷可否能用于臨床樣本解析。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗。往起初包被 HBsAg捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本，標準品，HRP標志的檢測抗體，經(jīng)過溫育并完整沖洗。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物的催化下轉(zhuǎn)變成藍色，并在酸的作用下最后轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。顏色的深淺和樣品中得HBsaAg呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度OD值，計算樣品濃度。應用試劑盒HBsAg標準品從濃度為8，4，2，1,0.5，個濃度梯度做標準曲線，以6，3，個濃度梯度5復孔做質(zhì)控，進行正確度，精美度和檢測限等方法學考據(jù)。選擇最低濃度為的原因是由于，絕大多數(shù)HBV感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量在5ng/ml?600ug/ml之間，高者可達2000ug／ml以上【6】，滿足了現(xiàn)階段文件報道的最低濃度值。方法學考據(jù)內(nèi)容方法學考據(jù)內(nèi)容一般包括標準曲線，正確度，精美度和檢測限。標準曲線亦稱校正曲線，系指生物樣品中所測定的樣品濃度與響應的相關(guān)性，平時用回歸解析方法所得的回歸方程來評件，此實驗所用了6個濃度點建立標準曲線。方法正確度指待測濃度與真實濃度的湊近值了，一般用相對回收率表示，限度要求在85%—115%的范圍內(nèi)。精美度則表示解析方法的可重復性，是對同同樣品每次測定結(jié)果的一致性，用標準誤差和相對標準誤差表示，可做板內(nèi)和板間的考據(jù)，對于ug/ml級水平的相對標準誤差一般應<10%,ng/ml級水平的相對標準誤差一般應<15%。檢測限則表示解析低濃度樣品的能力，平時又稱為矯捷度。結(jié)果解析及應用談論第一組數(shù)據(jù)標準曲線，顯示擁有優(yōu)異的相關(guān)性，HBsAg濃度為6ng/ml和3ng/ml的回收率分別為為97.58%，吻合113.07%，吻合限度要求在85%—115%的范圍內(nèi)。但是HBsAg濃度為.5ng/ml的回收率為80.56%，顯示此試劑盒對于低濃度樣品的檢測正確度差。在精美度方面，6，3，變異系數(shù)CV分別為12.73%，3.69%，3.50%，而HBsAg6ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精美度不高，但是也吻合ng/ml級RSD水平的一般應<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其他孔比較差異較大，可能是由于操作引起比方加樣嚴禁不屬于試劑盒的問題，故能夠認為此試劑盒對于批內(nèi)高、低濃度樣品的檢測精美度還是能夠的。在做3個組數(shù)據(jù)的批間的精美度解析時，發(fā)現(xiàn)6，3，變異系數(shù)CV分別9.10%，12.06%，16.78%，分布方式從低到高，前2個濃度滿足對ng/ml級水平的RSD一般應<15%的要求。的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應<15%的要求，顯示低濃度的孔間重復性差，精美度不是很高。綜上解析，該試劑盒對于高濃度樣品的檢測擁有優(yōu)異的正確性和較高的精美度，而對于低濃度樣品()的檢測在正確性和精美度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測。目前絕大多數(shù)HBV感染者外周血HBsAg濃度很低，該試劑盒不能夠全面檢測出此類人群，故該試劑盒不能夠用于臨床標本的檢測。參照文件參照文件【1】魏來，陶其敏．努力規(guī)范肝臟疾病的免疫學診斷．中華檢驗雜志， 2003，26：69—71【2】劉曉梅，張世蘭．HBsAg陰性結(jié)果的慢性乙型肝炎患者病毒血癥水平與臨床的關(guān)系[J】．臨床檢驗雜志，2004，22(5)：381-382．

【3】李輝霞，王德志，楊朋，乙肝兩對半定量檢測及臨床意義，醫(yī)學信息雜志23(9)。【4】WeberB,DenglerT,BergerA.Evaluationoftw