第三章常壓柱分離技術(shù)

第三章常壓柱分離技術(shù)

一．柱色譜分離技術(shù)分類二．層析柱的制備三．樣品的制備與上樣

四．洗脫與分離五．注意問題一．柱色譜分離技術(shù)分類

柱色譜分離與薄層色譜類似，是靠洗脫劑把分離的各組分逐個洗脫下來的過程，故也稱洗脫色譜。由于色譜柱填充的吸附劑的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于薄層板，因而柱色譜可用于分離量比較大（克數(shù)量級）的物質(zhì)，而薄層制備色譜分離量比較小，一般在毫克數(shù)量級。所以作為較大量制備分離，柱色譜優(yōu)于薄層色譜。在柱色譜分離過程中,一般利用薄層色譜摸索柱色譜的分離條件;利用薄層色譜鑒定、分析和分段收集洗脫出的洗脫液中的成分。

柱色譜分離技術(shù)按色譜原理可分為下列類型：—吸附柱色譜—分配色譜，—離子交換色譜，—分子排阻色譜—親和柱色譜，等。

柱色譜分離原理利用欲分離的混合物中各組分分配在吸附劑和洗脫劑之間，被吸附、分配、交換的性質(zhì)不同，而相互得以分離?；衔锉晃?、分配、交換的這種作用越強(qiáng)，該化合物溶解在洗脫劑中越少，沿洗脫劑移動的距離則越小。反之，越多。實(shí)驗(yàn)室常用的柱色譜有：—以硅膠和氧化鋁為吸附劑的吸附柱色譜；—以硅膠、纖維素和聚酰胺為載體（支持劑），以其吸收較大量的液體作為固定相的分配色譜（這里支持劑本身不起分離作用）?！云暇厶悄z為固定相的分子排阻柱色譜；—以離子交換樹脂為固定相的離子交換柱色譜等。主要介紹以硅膠和氧化鋁等為吸附劑的吸附柱色譜二．層析柱的制備

色譜柱的大小，取決于被分離樣品的量和吸附劑的性質(zhì)，要根據(jù)實(shí)際應(yīng)用而定

1．玻璃色譜柱

用前洗凈，干燥。柱子底鋪一層玻璃絲或者脫脂棉（有沙芯者可不用），然后放一層(0.5-1cm)海沙（seasand）（也稱石英沙）。

2．裝柱常壓柱層析裝柱方法有兩種(1)干法裝柱(2)濕法裝柱

所用吸附固定相一般為硅膠，氧化鋁，粒度要求100-160目或160目以上。吸附劑粒度越小，分離度越大，但洗脫速度，越慢。Rf值相差較大時，應(yīng)用硅膠100-160目，可上樣30mg/g硅膠，更多的情況下硅膠量為10mg/g硅膠（即分離1g樣品需要100g硅膠）。應(yīng)用氧化鋁時，粒度要求100－150目，分離1g樣品需要20－50g氧化鋁。

(1)干法裝柱干法—在柱子上端放一漏斗，直接加入硅膠，輕輕敲打?qū)游鲋?，或上下震動層析柱，使填裝均勻，再加一層海沙，然后加入洗脫劑，使硅膠潤濕（溶劑化）.必要時加壓或減壓以除去氣泡，加速溶劑化速度。溶劑化后的硅膠柱，均勻透明.

(2)濕法裝柱濕法—將吸附劑硅膠與一定量溶劑調(diào)成懸漿狀，快速倒入柱管中，打開活塞，使溶劑慢慢流出，吸附劑慢慢下降而均勻沉入色譜柱底。吸附劑填料完畢,一般在上面再覆蓋0.5cm厚的海沙。無論干法或濕法裝柱都要均勻，不能使柱子干了.應(yīng)使溶劑與海沙平面相齊。否則將會出現(xiàn)氣泡或裂縫。三．樣品的制備與上樣1．被分離混合物為液體

將其中極性溶劑盡可能的用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除后，加入少許流動相稀釋。待將吸附劑上面的多余洗脫劑放出，直到柱內(nèi)液體表面降至吸附劑表面時，停止放出洗脫劑。將樣品溶液用滴管或漏斗沿柱子內(nèi)壁直接加入柱中。樣品稀釋要盡可能用少的洗脫劑，然后用最少量洗脫劑洗滌器皿與層析柱內(nèi)壁，洗滌完畢，開放活塞，使液體漸漸放出，液面降至吸附劑上端時，開始加入流動相洗脫。

2．被分離混合物樣品為極性較小的固體

A.盡可能使其溶于流動相溶劑中。但應(yīng)注意，樣品在流動相中的溶解度一般較小。如果樣品體積太大，分辨能力就會降低。另一方面，如果樣品濃度過濃，就可能在柱頂部形成沉淀。B.可選擇極性較小的溶劑溶解后上柱.可選用的溶劑:CH2Cl2,CCl4,甲苯，環(huán)己烷，石油醚。總之溶劑極性不能比洗脫劑極性太大，否則將影響層析行為和分離效果或分不開。極性小的溶劑一般指在溶劑極性順序中,極性小于二氯甲烷的溶劑;另外溶劑量不能太多，以近飽和為宜。3．被分離混合物樣品為難溶性固體a.可選擇極性大的溶劑溶解。如氯仿，丙酮，乙醇，甲醇，四氫呋喃，吡啶，免用DMSO,DMF沸點(diǎn)較高溶劑。b.再加入適量的硅膠于溶劑中（一份樣品+約5份柱填料），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸去溶劑至干，讓樣品均勻地涂布在固定相表面上，然后通過漏斗裝于柱子上端。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時，一定要加防爆球，以防樣品硅膠爆沸。四．洗脫與分離

1．洗脫劑的選擇應(yīng)以TLC檢測為依據(jù)。被分離物質(zhì)的最佳Rf值應(yīng)在0.2-0.5內(nèi)。被分離的2個點(diǎn)之間△Rf值應(yīng)盡可能的大，越大越好。最小應(yīng)不小于0.1。否則分離效果差或難以分離。

2．洗脫劑應(yīng)不斷加入，保持一定高度。或加一儲液燒瓶，以免流干。

3．洗脫液收集洗脫液采用等份法收集，例如5，10，20，30或50ml為一份。根據(jù)分離樣品多寡而定。用小試管或小容量瓶收集。4．控制洗脫液流出速度。不能太快，太快柱中交換來不及平衡，從而影響分離效果。一般以1-2滴/秒為宜。5．洗脫液TLC檢測與合并。將每一個小容量瓶按編號點(diǎn)樣展開，將Rf值相同者合并，濃縮-蒸干，最后進(jìn)一步純化（蒸餾或重結(jié)晶等）。五．注意問題1．吸附劑表面加入海沙的目的是使加料時不致把吸附劑沖起，影響分離效果。若無沙子，也可用玻璃纖維。2．層析法中最關(guān)鍵性的操作之一就是裝柱（向柱內(nèi)充填吸附樹）操作。固體吸附劑如硅膠、氧能鋁等柱填充料，柱子在充填時必須裝得非常均勻，決不可裝得不整齊、出現(xiàn)空氣泡、存在隙縫等。因?yàn)橐粋€化合物沿著柱子下行時，這些情況可能會出現(xiàn)在前沿域譜帶的異常。（1）化合物譜帶的最前面的邊緣或稱前沿應(yīng)是水平的，或者說應(yīng)是垂于柱的長軸的。如果填充料填充不水平，或柱子末被夾持在兩個平面中(即前—后，左—右兩個平面)完全垂直的位置，第二條譜帶的最前面的邊緣在第一條譜帶洗脫完畢之前就將開始洗脫出來了．那么想分離每一組分是不可能的。（2）若