第2章-色譜基本理論

第二章色譜法原理

（PrinciplesofChromatography）2-1概述

色譜法早在1903年由俄國(guó)植物學(xué)家M.Tswett（茨維特）提出，成為十分重要的分離分析手段。實(shí)驗(yàn)：葉綠素分離：石油醚浸提葉片——碳酸鈣填充拄——純凈石油醚淋洗———葉綠素分離（a，b，葉黃素，胡蘿卜素）“色譜”（Chromatography層析法）概念的產(chǎn)生色譜法共同的基本特點(diǎn)色譜法共同的基本特點(diǎn)是具備兩個(gè)相：不動(dòng)的一相，稱為固定相(色譜柱)；另一相是攜帶樣品流過固定相的流動(dòng)體，稱為流動(dòng)相（載氣或流動(dòng)相）。當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出（洗脫）。與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。

兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)主要色譜儀器及基本工作流程氣相色譜儀：氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)（色譜柱）、溫控系統(tǒng)（柱溫箱）、檢測(cè)系統(tǒng)（檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）組成。液相色譜儀：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)色譜法分類

2.2.1按兩相狀態(tài)分類

氣體為流動(dòng)相的色譜稱為氣相色譜（GC），根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體），又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）．液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（LC）。同理，液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）．超臨界流體為流動(dòng)相的色譜稱為超臨界流體色譜（SFC）。其中，在色譜柱制作技術(shù)中通過化學(xué)反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜（CBPC）。

2.2.2按分離機(jī)理分類

利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為離子交換色譜法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為凝膠色譜法或排阻色譜法。利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進(jìn)行分離的技術(shù)稱為親和色譜法，常用于蛋白質(zhì)的分離。固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜。

固定相呈平板狀的色譜法，稱為平板色譜，它又可分為薄層色譜和紙色譜。

根據(jù)以上所述，將色譜法的分類總結(jié)于表2-l中。2.2.3按固定相的外形分類

2-12-2色譜流出曲線及有關(guān)色譜術(shù)語(yǔ)2.2.1流出曲線和色譜峰

2-1試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，以此流出色譜柱，經(jīng)檢測(cè)器轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，然后用數(shù)據(jù)記錄裝置將各組分的濃度變化記錄下來，即得色譜圖。色譜圖是以組分的濃度變化引起的的電信號(hào)作為縱坐標(biāo)，流出時(shí)間作為橫坐標(biāo)的，這種曲線稱為色譜流出曲線。其它色譜術(shù)語(yǔ)基線(Baseline)、基線噪聲(Baselinenoise)基線漂移(Baselinedrift)死時(shí)間(Deadtime)、死體積(Deadvolume)保留值(Retentionvalue):

Retentiontime&Retentionvolume調(diào)整保留值(Adjustedretentionvalue)：Adjustedretentiontime&Adjustedretentionvolume相對(duì)保留值(Relativeretentionvalue)區(qū)域?qū)挾?Peakwidth)

標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standarddeviation)

半峰寬度(Peakwidthathalf-height)

峰底寬度(Peakwidthatpeakbase)

峰高（Peakheight）2.2.2基線

柱中僅有流動(dòng)相通過時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)的記錄值，即圖2-1中O—t線．理想的基線應(yīng)該是一條水平直線?；€噪聲，基線漂移

2-12.2.3峰高

色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖2-1中B′A

2.2.4保留值（1）死時(shí)間tM

不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，如圖2-1中O′A′。

因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相的流動(dòng)速度相近．測(cè)定流動(dòng)相平均線速ū時(shí)，可用柱長(zhǎng)L與tM的比值計(jì)算。

（2）保留時(shí)間tR

試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如圖2-1O′B．它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端的檢測(cè)器所需的時(shí)間．

圖2-1色譜流出曲線（3）調(diào)整保留時(shí)間tR′

某組份的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后稱為該組份的調(diào)整保留時(shí)間，即

tR′=tR-tM

由于組份在色譜柱中的保留時(shí)間tR包含了組份隨流動(dòng)相通過柱子所需的時(shí)間和組份在固定相中滯留所需的時(shí)間，所以tR′實(shí)際上是組份在固定相中停留的總時(shí)間．保留時(shí)間可用時(shí)間單位（如s）或距離單位（如cm）表示。保留時(shí)間是色譜法定性的基本依據(jù)。但同一組份的保留時(shí)間常受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積等進(jìn)行定性檢定。

（4）死體積VM

色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和．當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速F0（L／min）計(jì)算：

VM=tM·F0

（5）保留體積VR

從進(jìn)樣開始到被測(cè)組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相體積。保留體積與保留時(shí)間t。的關(guān)系如下：

VR=tR·F0

（6）調(diào)整保留體積VR′

某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整保留體積，即VR′=VR-VM

（7）相對(duì)保留值γ2.1

某組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比，稱為相對(duì)保留值：

由于相對(duì)保留值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù)．

必須注意，相對(duì)保留值絕對(duì)不是兩個(gè)組份保留時(shí)間或保留體積之比.*選擇因子

式中tR2′為后出峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以這時(shí)α總是大于1的。在定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（s），然后再求其它峰（i）對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)保留值．在多元混合物分析中，通常選擇一對(duì)最難分離的物質(zhì)對(duì)，將它們的相對(duì)保留值作為重要參數(shù)．在這種特殊情況下，可用符號(hào)α表示：2.2.5區(qū)域?qū)挾?/p>

色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法：

（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：0.607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖2-1中EF距離的一半。（2）半峰寬Y1/2：峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，如圖2-1中GH間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差σ的關(guān)系是：

Y1/2=2.354σ2-1

（3）基線寬度（W或Y）

即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，如圖2-1中IJ的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是：

Y=4σ

色譜流出曲線可以得到許多重要信息：

（l）根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個(gè)數(shù)。（2）根據(jù)色譜峰的保留值(位置），可以進(jìn)行定性分析。（3）根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析。（4）色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)。（5）色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相和流動(dòng)相選擇是否合適的依據(jù)。

2-3色譜法分析的基本原理

色譜分析根本目的：將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn).

兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來研究色譜行為。

2.3.1分配系數(shù)K和分配比k（1）分配系數(shù)K

色譜分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)多次地分配或吸附--脫附過程（溶解）。分配系數(shù)是描述分離過程中樣品分子在兩相間分配的參數(shù)，它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值（2）分配比k

分配比又稱容量因子：它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對(duì)被分離組分保留能力的重要參數(shù)。k值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)，不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。

式中CS、Cm分別為組分在固定相和流動(dòng)相的濃度；Vm為柱中流動(dòng)相的體積，近似等于死體積。Vs為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。分配比k值的計(jì)算（直接從色譜圖測(cè)得）

滯留因子(保留比)Rs設(shè)流動(dòng)相在柱內(nèi)的線速度為u，組分在柱內(nèi)線速度為us，由于固定相對(duì)組分有保留作用，所以u(píng)s＜u．此兩速度之比稱為滯留因子Rs。

對(duì)組分和流動(dòng)相通過長(zhǎng)度為L(zhǎng)的色譜柱，其所需時(shí)間分別為Rs若用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，即整理式上述公式，可得

通過色譜流出曲線,就可求得分配比k.2-1（3）分配系數(shù)K與分配比k的關(guān)系

其中β稱為相比率，它是反映各種色譜柱型特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。例如：填充柱：6～35；毛細(xì)管柱：60～600。

分配系數(shù)是組分在兩相中的濃度比,分配比是組分在兩相中分配總量之比.熱力學(xué)性質(zhì)(拄溫,柱壓)分配系數(shù)只取決與組分和兩相性質(zhì),與兩相體積無(wú)關(guān),而分配比不僅取決與組分和兩相性質(zhì),還與相比有關(guān).一定的色譜體系中,組分分離決定于組分在每相中的相對(duì)量,而不是相對(duì)濃度,因此,分配比是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的重要參數(shù).k越大,保留時(shí)間越長(zhǎng),k為0,保留時(shí)間為死時(shí)間.（4）分配系數(shù)K及分配比k與選擇因子α的關(guān)系

對(duì)A、B兩組分的選擇因子，用下式表示

上述公式表明：通過選擇因子α把實(shí)驗(yàn)測(cè)量值k與熱力學(xué)性質(zhì)的分配系數(shù)K直接聯(lián)系起來，α對(duì)固定相的選擇具有實(shí)際意義。如果兩組分的K或k值相等，則α=1，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。2.3.2塔板理論最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時(shí)引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。

（i）在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度H。（ii）以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（ΔVm）。（iii）所有組分開始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。（iv）分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。理論假定：

為簡(jiǎn)單起見，設(shè)色譜往由5塊塔板（n＝5，n為柱子的塔板數(shù)）組成，并以r表示塔板編號(hào)，r=1，2…，n－l；某組分的分配比k=1根據(jù)上述假定，在色譜分離過程中，該組分的分布可計(jì)算如下：開始時(shí)，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1μg）的該組分加到第0號(hào)塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。當(dāng)一個(gè)板體積（lΔV）的載氣以脈動(dòng)形式進(jìn)入0號(hào)板時(shí)，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂?shù)?號(hào)板上，此時(shí)0號(hào)板液相（或固相）中ns部分組分及1號(hào)板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號(hào)板上所含組分總量為0．5，其中氣液（或氣固）兩相各為0．25而1號(hào)板上所含總量同樣為0．5．氣液（或氣固）相亦各為0．25。以后每當(dāng)一個(gè)新的板體積載氣以脈動(dòng)式進(jìn)入色譜柱時(shí)，上述過程就重復(fù)一次(見下表)。

表2-1組分在任一板上的分配情況由塔板理論可建流出曲線方程：m為組分質(zhì)量，Vr為保留體積，n為理論塔板數(shù)。當(dāng)V=Vr時(shí)，C值最大，即由流出曲線方程可推出：

而理論塔板高度（H）即：

從上兩式可以看出，色譜峰Y越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指標(biāo)。通常填充色譜柱的n＞103，H＜1mm。而毛細(xì)管柱n=105--106，H＜0.5mm由于死時(shí)tm包括在tr中,而實(shí)際的tm不參與柱內(nèi)分配,所計(jì)算的n值盡大,H很小,但與實(shí)際柱效能相差甚遠(yuǎn).所以,提出把tm扣除,采用有效理論塔板數(shù)neff和有效塔板高Heff評(píng)價(jià)柱效能。注意:同一色譜柱對(duì)不同物質(zhì)的柱效能是不一樣的,當(dāng)用這些指標(biāo)表示柱效能時(shí),必須說明是對(duì)什么物質(zhì)而言.塔板理論基本公式的意義成功之處：塔板理論用熱力學(xué)觀點(diǎn)形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的分配平衡和分離過程，導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型，并成功地解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)。

局限：由于它的某些基本假設(shè)并不完全符合柱內(nèi)實(shí)際發(fā)生的分離過程，例如，縱向擴(kuò)能解釋造成譜帶擴(kuò)張的原因和影響板高的各種因素，也不能說明為什么在不同流速下可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)，這就限制了它的應(yīng)用色譜柱n越大,表明組分在色譜柱中達(dá)到分配平衡的次數(shù)就越多,固定相的作用就越顯著,對(duì)分離就越有利!但還不能預(yù)言并確定各組分能否被分離(能否分離決定于試樣混合物中在固定相中的分配系數(shù)的差異,而不是分配次數(shù)差異),因此不能把n有效作為能否實(shí)現(xiàn)分離可能的依據(jù),而只能看作是一定條件下柱分離能力發(fā)揮程度的標(biāo)志.本節(jié)主要概念和重要公式調(diào)整保留時(shí)間tR′=保留時(shí)間tR-死時(shí)間tM

相對(duì)保留值γ2.1（選擇因子α）分配系數(shù)K與分配比k

與選擇因子α的關(guān)系理論塔板數(shù)n與保留時(shí)間tR和半峰寬Y1/2、峰寬Y的關(guān)系理論塔板高度H2.3.3速率理論

1956年荷蘭學(xué)者vanDeemter等在研究氣液色譜時(shí)，提出了色譜過程動(dòng)力學(xué)理論——速率理論。吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，從而在動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對(duì)氣相、液相色譜都適用。

VanDeemter方程的數(shù)學(xué)簡(jiǎn)化式為

式中u為流動(dòng)相的線速度；A，B，C為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。(1)渦流擴(kuò)散項(xiàng)A

在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動(dòng)相向柱出口遷移時(shí)，流動(dòng)相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動(dòng)方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類似“渦流”的流動(dòng)，故稱渦流擴(kuò)散，形象地如圖18S1所示。

A＝2λdp上式表明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動(dòng)相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無(wú)關(guān)。為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對(duì)于空心毛細(xì)管，不存在渦流擴(kuò)散。因此A＝0。

(2).分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u(縱向擴(kuò)散項(xiàng))

縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。如圖所示。它隨著流動(dòng)相向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)地向前和向后擴(kuò)散，造成譜帶展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)為

B＝2γDg式中γ是填充柱內(nèi)流動(dòng)相擴(kuò)散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對(duì)自由分子擴(kuò)散的阻礙情況,Dg為組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）。I氣相色譜中影響B(tài)項(xiàng)的因素（1）組分保留時(shí)間：保留時(shí)間長(zhǎng)，色譜峰擴(kuò)張就越顯著（2）載氣性質(zhì)：載氣分子質(zhì)量大，Dg小，Dg反比于載氣密度的平方根或載氣相對(duì)分子質(zhì)量的平方根。采用相對(duì)分子量較大的載氣（氮?dú)猓?，可使B項(xiàng)降低，Dg隨柱溫增加而增加，反比于柱壓。（3）彎曲因子γ

γ：填充物的存在造成擴(kuò)散阻礙而引入的的校正系數(shù)。λ：是填充物的不均勻性造成的。II液相色譜的縱向擴(kuò)散項(xiàng)當(dāng)試樣分子在色譜柱中被流動(dòng)相攜帶前進(jìn)時(shí)，由分子本身運(yùn)動(dòng)所引起的縱向擴(kuò)散項(xiàng)同樣引起色譜峰的擴(kuò)展。它與分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm成正比，與流動(dòng)相的線速u成反比。

由于分子在液體中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體中要小4-5個(gè)數(shù)量級(jí)，因此在液相色譜法中當(dāng)流動(dòng)相線速度大于0.5cm.s-1。可忽略縱向擴(kuò)散項(xiàng)的影響。(3)傳質(zhì)阻力項(xiàng)C·u

由于氣相色譜以氣體為流動(dòng)相，液相色譜以液體為流動(dòng)相，它們的傳質(zhì)過程不完全相同.傳質(zhì)阻力系數(shù)C包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg和液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl兩項(xiàng)，即C＝Cg＋Cl

I氣液色譜這一過程中試樣組分將在兩相間進(jìn)行質(zhì)量交換，即進(jìn)行濃度分配。有的分子還來不及進(jìn)入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進(jìn)入兩相界面又來不及返回氣相。使得試樣在兩相界面上不能瞬間達(dá)到分配平衡，引起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。氣相傳質(zhì)過程是指試樣組分從氣相移動(dòng)到固定相表面的過程.對(duì)于填充柱，氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg為

式中k為容量因子。由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度則的平方成正比、與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)成反比。采用粒度小的填充物相對(duì)分子質(zhì)量小的氣體（如氫氣）做載氣，可使Cg減小，提高柱效。液相(氣液色譜的固定相)傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl為

由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴(kuò)散系數(shù)Dl大，則液相傳質(zhì)阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值隨之變小，又會(huì)使C1增大。當(dāng)固定液含量一定時(shí)，液膜厚度隨載體的比表面積增加而降低，因此，一般采用比表面積較大的載體來降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分離。雖然提高柱溫可增大Dl，但會(huì)使k值減小，為了保持適當(dāng)?shù)腃l值，應(yīng)控制適宜的柱溫。

將上式總結(jié)，即可得氣液色譜速率板高方程

這一方程對(duì)選擇色譜分離條件具有實(shí)際指導(dǎo)意義，它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動(dòng)相的種類及流速，固定相的液膜厚度等對(duì)柱效的影響。

傳質(zhì)阻力系數(shù)（C）包含流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cm）和固定相傳質(zhì)系數(shù)（Cs），即

C＝Cm＋Cs

II液液分配色譜Cm又包含流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力和滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力，即

式中右邊第一項(xiàng)為流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力。當(dāng)流動(dòng)相流過色譜柱內(nèi)的填充物時(shí)，靠近填充物顆粒的流動(dòng)相流速比在流路中間的稍慢一些，故柱內(nèi)流動(dòng)相的流速是不均勻.ωm是由柱和填充的性質(zhì)決定的因子。ωsm是常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。

液液色譜中固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（Cs）可用下式表示：上式可見，對(duì)固定相的傳質(zhì)所引起的峰擴(kuò)展，主要從改善傳質(zhì)，加快溶質(zhì)分子在固定相上的解吸過程，著手加以解決。對(duì)液液分配色譜法，可使用薄的固定相層，而對(duì)吸附、排阻和離子交換色譜，則可使用小的顆粒填料來解決，使用具有擴(kuò)散系數(shù)大的固定液，亦可改善傳質(zhì)。

該式與氣液色譜速率方程的形式基本一致，主要區(qū)別在液液色譜中縱向擴(kuò)散項(xiàng)可忽略不計(jì)，影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)。綜上所述，對(duì)液液色譜的VanDeemter方程式可表達(dá)為：

（4）流動(dòng)相線速度u對(duì)板高的影響

LC和GC的H－u圖表明，對(duì)于一定長(zhǎng)度的柱子，柱效越高，理論塔板數(shù)越大，板高越小。

但究竟控制怎樣的線速度，才能達(dá)到最小板高呢？

根據(jù)vanDeemter公式分別作LC和GC的H－u圖由圖a不難看出：LC和GC的H－u圖十分相似，對(duì)應(yīng)某一流速都有一個(gè)板高的極小值，這個(gè)極小值就是柱效最高點(diǎn)；LC板高極小值比GC的極小值小一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，說明液相色譜的柱效比氣相色譜高得多;LC的板高最低點(diǎn)相應(yīng)流速比起GC的流速亦小一個(gè)數(shù)量級(jí)，說明對(duì)于LC，為了取得良好的柱效，流速不一定要很高。分子擴(kuò)散項(xiàng)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)對(duì)板高的貢獻(xiàn)

（5）固定相粒度大小對(duì)板高的影響

固定相粒度對(duì)板高的影響是至關(guān)重要的。實(shí)驗(yàn)表明不同粒度，H－u曲線也不同（見右圖）：

粒度越細(xì)，板高越小，并且受線速度影響亦小。這就是為什么在HPLC中采用細(xì)顆粒作固定相的根據(jù)。當(dāng)然，固定相顆粒愈細(xì)，柱流速愈慢。只有采取高壓技術(shù)，流動(dòng)相流速才能符合實(shí)驗(yàn)要求。小結(jié)？課后思考：如何利用速率理論公式闡述提高色譜分離效率的方法（H減?。庖荷V速率板高方程液液色譜速率板高方程2-4色譜分析條件的選擇2.4.1分離度一個(gè)混合物能否為色譜柱所分離，取決于固定相與混合物中各組分分子間的相互作用的大小是否有區(qū)別。但在色譜分離過程中各種操作因素的選擇是否合適對(duì)于實(shí)現(xiàn)分離的可能也有很大的影響。因此在色譜分離過程中，不但要根據(jù)所分離的對(duì)象選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ?，使其中各組分有可能被分離，而且還要?jiǎng)?chuàng)造一定的條件，使這種可能性得以實(shí)現(xiàn)，并達(dá)到最佳的分離效果。圖中（a）兩色譜峰距離近并且峰形寬。兩峰嚴(yán)重相疊，這表示選擇性和柱效都很差。圖中（b）雖然兩峰距離拉開了，但峰形仍很寬，說明選擇性好，但柱效低。圖中（c）分離最理想，說明選擇性好，柱效也高。柱效和選擇性對(duì)分離的影響由此可見，單獨(dú)用柱效或選擇性不能真實(shí)反映組分在色譜柱中分離情況，故需引入一個(gè)綜合性指標(biāo)——分離度R。分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標(biāo)，稱總分離效能指標(biāo)。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般定義為當(dāng)R＜1時(shí)，兩峰有部分重疊；當(dāng)R＝1時(shí)，分離程度可達(dá)98％；當(dāng)R＝1.5時(shí)，分離程度可達(dá)99.7％。

通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標(biāo)志。

不同分離度時(shí)色譜峰分離的程度。例題從色譜圖上測(cè)得組分x和y的保留時(shí)間分別為10.52min和11.36min,兩峰的峰底寬為0.38min和0.48min,判斷兩峰是否達(dá)到完全分離?解：根據(jù)色譜分析中分離度（R）定義及計(jì)算公式：由于1.95>1.5，故x,y兩組份能分離。

2.4.2色譜分離基本方程

分離度R的定義并沒有反映影響分離度的諸因素。實(shí)際上，分離度受柱效（n）、選擇因子(α)和容量因子（k）三個(gè)參數(shù)的控制。對(duì)于難分離物質(zhì)對(duì)，由于它們的分配系數(shù)差別小，可合理地假設(shè)k1≈k2=k,Y1≈Y2＝Y(jié)。由塔板理論公式和上式，得（PP:18）后式即為基本色譜分離方程式

在實(shí)際應(yīng)用中，往往用neff。代替n,處理上式可得

可以看出，后者為基本色譜分離方程式又一表達(dá)式。

2.4.3分離操作條件的選擇（1）分離度與柱效的關(guān)系

由分離方程式看出，具有一定相對(duì)保留值α的物質(zhì)對(duì)，分離度直接和有效塔板數(shù)有關(guān)，說明有效塔板數(shù)能正確地代表柱效能。而分離方程式表明分離度與理論塔板數(shù)的關(guān)系還受熱力學(xué)性質(zhì)的影響。當(dāng)固定相確定，被分離物質(zhì)對(duì)的α確定后，分離度將取決于n。這時(shí)，對(duì)于一定理論板高的柱子，分離度的平方與柱長(zhǎng)成正比，即雖說用較長(zhǎng)的柱可以提高分離度，但延長(zhǎng)了分析時(shí)間。因此提高分離度的好方法是制備出一根性能優(yōu)良的柱子，通過降低板高，以提高分離度。

由基本色譜方程式判斷，當(dāng)α=1時(shí)，R=0，這時(shí)，無(wú)論怎樣提高柱效也無(wú)法使兩組分分離。顯然，α大，選擇性好。研究證明，α的微小變化，就能引起分離度的顯著變化。一般通過改變固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)和組成或降低柱溫，可有效增大α值。

（2）分離度與選擇因子的關(guān)系（3）分離度與容量因子(k)的關(guān)系如果設(shè)：則分離方程式寫成

由R/Q－k的曲線圖看出：當(dāng)k＞1O時(shí)，隨容量因子增大，分離度的增長(zhǎng)是微乎其微的。一般取k為2～10最宜。對(duì)于GC，通過提高溫度，可選擇合適的k值，以改進(jìn)分離度。對(duì)于LC，只要改變流動(dòng)相的組成，就能有效地控制k值。它對(duì)LC的分離能起到立竿見影的效果（見圖18d4）。

液相色譜分析通過改變流動(dòng)相組成改變分離度

（4）分離度與分析時(shí)間的關(guān)系

下式表示了分析時(shí)間與分離度及其他因素的關(guān)系。分析時(shí)間與分離度呈正相關(guān)關(guān)系，且為指數(shù)關(guān)系，分離度越大，所需分析時(shí)間越長(zhǎng)。（5）基本色譜分離方程式的應(yīng)用

在實(shí)際中，基本色譜分離方程式是很有用的公式，它將柱效、選擇因子、分離度三者的關(guān)系聯(lián)系起來了，知道其中兩個(gè)指標(biāo)，就可計(jì)算出第三個(gè)指標(biāo)。

［例2-1］有一根lm長(zhǎng)的柱子，分離組分1和2得到如圖18d5的色譜圖。圖中橫坐標(biāo)l為記錄筆走紙距離。若欲得到R=1.2的分離度，有效塔板數(shù)應(yīng)為多少？色譜柱要加到多長(zhǎng)？解：先求出組分2對(duì)組分1的相對(duì)保留值r2，1（即α值）求有效塔板數(shù)neff

neff＝16×（0.8）2[1.1/(1.1-1)]2＝1239若使R=1.2,所需塔板數(shù)可計(jì)算,即因此,欲使分離度達(dá)到1.2,需有效塔板數(shù)為2788塊,則所需柱長(zhǎng)為L(zhǎng)=2788/1329×1m=2.25m[例2-2]已知某色譜柱的理論塔板數(shù)為3600,組分A和B在該柱上的保留時(shí)間為27mm和30mm,求兩峰的半峰寬和分離度.

解:∵w1/2=w/1.7w1=27/(3600/16)1/2=1.8mm(w1)1/2＝1.8/1.7＝1.06mmw2=30/(3600/16)1/2=2.0mm(w2)1/2＝2.0/1.7＝1.18mmR＝2(30-27)/(1.8+2)＝6/3.8＝1.6[例2-3]已知物質(zhì)A和B在一個(gè)30.0cm柱上的保留時(shí)間分別為16.40和17.63分鐘.不被保留組分通過該柱的時(shí)間為1.30分鐘.峰寬為1.11和1.21mm,計(jì)算:

(1)

柱分辨本領(lǐng)(R);

(2)

柱的平均塔板數(shù)目(n理論);

(3)

塔板高度(H);

(4)

達(dá)到1.5分離度所需的柱長(zhǎng)度;

(5)在較長(zhǎng)柱上把物質(zhì)B洗脫所需要的時(shí)間.

解:(1)R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06(2)nA=16(16.40/1.11)2=3493nB=16(17.63/1.21)2=3397nav=(3493+3397)/2=3445=3.44×103(3)H=L/n=30.0/3445=8.708×10-3cm=8.71×10-3cm(4)n2=3445×2.25/1.124=6.90×103

源于n1/n2=(R1/R2)2L=nH=6.90×103×8.71×10-3=60.1cm(5)tr2=tr1(R2/R1)2=17.63×1.52/1.062

=35.3分鐘2-5色譜的定性分析與定量分析

2.5.1色譜定性分析色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種定性指標(biāo)。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。但是不同物質(zhì)在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非專屬的。僅根據(jù)保留值對(duì)一個(gè)完全未知的樣品定性是困難的。如果在了解樣品的來源、性質(zhì)、分析目的的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品組成作初步的判斷，再結(jié)合下列的方法則可確定色譜峰所代表的化合物。（1）用已知純物質(zhì)對(duì)照定性

這是色譜定性分析中最方便，最可靠的方法。這個(gè)方法基于在一定操作條件下，各組分的保留時(shí)間是一定值的原理。

如果未知樣品較復(fù)雜，可采用在未知混合物中加入已知物，通過未知物中哪個(gè)峰增大，來確定未知物中成分。純物質(zhì)對(duì)照法定性只適用于組分性質(zhì)已有所了解，組成比較簡(jiǎn)單，且有純物質(zhì)的未知物。（2）用經(jīng)驗(yàn)規(guī)律和文獻(xiàn)值進(jìn)行定性分析

當(dāng)沒有待測(cè)組分的純標(biāo)準(zhǔn)樣時(shí)，可用文獻(xiàn)值定性，或用氣相色譜中的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律定性。

①碳數(shù)規(guī)律大量實(shí)驗(yàn)證明，在一定溫度下，同系物的調(diào)整保留時(shí)間的對(duì)數(shù)與分子中碳原子數(shù)成線性關(guān)系，即式中A1和C1是常數(shù)，n為分子中的碳原子數(shù)（n≥3）。該式說明，如果知道某一同系物中兩個(gè)或更多組分的調(diào)整保留值，則可根據(jù)上式推知同系物中其它組分的調(diào)整保留值。

例：菜籽油或動(dòng)物脂肪中脂肪酸的測(cè)定（甲酯化后）

②沸點(diǎn)規(guī)律

同族具有相同碳數(shù)碳鏈的異構(gòu)體化合物，其調(diào)整保留時(shí)間的對(duì)數(shù)和它們的沸點(diǎn)呈線性關(guān)系，即式中A2和C2均為常數(shù)，Tb為組分的沸點(diǎn)（K）。由此可見，根據(jù)同族同碳數(shù)碳鏈異構(gòu)體中幾個(gè)已知組分的調(diào)整保留時(shí)間的對(duì)數(shù)值，可求得同族中具有相同碳數(shù)的其他異構(gòu)體的調(diào)整保留時(shí)間。例：666，DDT氣相色譜圖（3）根據(jù)相對(duì)保留值定性有時(shí)利用相對(duì)保留值定性比用保留值定性更為方便、可靠。在用保留值定性時(shí)，必須使兩次分析條件完全一致，有時(shí)不易做到。而用相對(duì)保留值定性時(shí)，只要保持柱溫不變即可。這種方法要求找一個(gè)基準(zhǔn)物質(zhì)，通常選容易得到純品的，而且與被分析組分相近的物質(zhì)作基準(zhǔn)物質(zhì)，如正丁烷、環(huán)己烷、正戊烷、苯、對(duì)二甲苯、環(huán)己醇、環(huán)己酮等。（4）根據(jù)保留指數(shù)定性

保留指數(shù)又稱Kováts指數(shù)，是一種重現(xiàn)性較其他保留數(shù)據(jù)都好的定性參數(shù)，可根據(jù)所用固定相和柱溫直接與文獻(xiàn)值對(duì)照，而不需標(biāo)準(zhǔn)樣品。

保留指數(shù)也是一種相對(duì)保留值，它是把正構(gòu)烷烴中某兩個(gè)組分的調(diào)整保留值的對(duì)數(shù)作為相對(duì)的尺度，并假定正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為n100。被測(cè)物的保留指數(shù)值可用內(nèi)插法計(jì)算。

內(nèi)插法求IiX示意圖信號(hào)tR(Z)

tR(i)

tR(Z+1)

t進(jìn)樣［例3-4］圖2-19為乙酸正丁酯在阿皮松L柱上的流出曲線（柱溫100℃）。由圖中測(cè)得調(diào)整保留距離為：乙酸正丁酯310.0mm，正庚烷174.0mm，正辛烷373.4mm，求乙酸正丁酯的保留指數(shù)。

即乙酸正丁酯的保留指數(shù)為775.6。在與文獻(xiàn)值對(duì)照時(shí)，一定要重現(xiàn)文獻(xiàn)值的實(shí)驗(yàn)條件，如固定液、柱溫等。而且要用幾個(gè)已知組分進(jìn)行驗(yàn)證。解：已知n=7（5）雙柱、多柱定性

對(duì)于復(fù)雜樣品的分析，利用雙柱或多柱法更有效、可靠，使原來一根柱子上可能出現(xiàn)相同保留值的兩種組分，在另一柱上就有可能出現(xiàn)不同的保留值。

（6）與其他方法結(jié)合

色譜與質(zhì)譜、Fourier紅外光譜、發(fā)射光譜等儀器聯(lián)用是目前解決復(fù)雜樣品定性分析最有效工具之一。2.5.2定量分析

色譜定量分析是根據(jù)檢測(cè)器對(duì)溶質(zhì)產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)與溶質(zhì)的量成正比的原理，通過色譜圖上的面積或峰高，計(jì)算樣品中溶質(zhì)的含量。

（1）峰面積測(cè)量方法

峰面積是色譜圖提供的基本定量數(shù)據(jù)，峰面積測(cè)量的準(zhǔn)確與否直接影響定量結(jié)果。對(duì)于不同峰形的色譜峰采用不同的測(cè)量方法。①對(duì)稱形峰面積的測(cè)量--峰高乘半峰寬法理論上可以證明，對(duì)稱峰的面積

A=1.065×h×W1／2

②不對(duì)稱峰面積的測(cè)量--峰高乘平均峰寬法對(duì)于不對(duì)稱峰的測(cè)量如仍用峰高乘半峰寬，誤差就較大，因此采用峰高乘平均峰寬法。

A=1/2h（W0.15＋W0.85）

式中W0.15和W0.85分別為峰高0.15倍和0.85倍處的峰寬。③最佳方法--積分法

應(yīng)用色譜工作站，即計(jì)算機(jī)及其相關(guān)軟件對(duì)色譜峰進(jìn)行積分。積分法自動(dòng)化，速度快，計(jì)算準(zhǔn)確，現(xiàn)在的色譜儀幾乎都采用此法。

當(dāng)色譜峰峰型好的時(shí)候，有時(shí)也采用峰高來進(jìn)行定量計(jì)算（2）定量校正因子

①

定量校正因子

色譜定量分析是基于峰面積與組分的量成正比關(guān)系。但由于同一檢測(cè)器對(duì)不同物質(zhì)具有不同的響應(yīng)值，即對(duì)不同物質(zhì)，檢測(cè)器的靈敏度不同，所以兩個(gè)相等量的物質(zhì)得不出相等峰面積?；蛘哒f，相同的峰面積并不意味著相等物質(zhì)的量。因此，在計(jì)算時(shí)需將面積乘上一個(gè)換算系數(shù)，使組分的面積轉(zhuǎn)換成相應(yīng)物質(zhì)的量，即

wi=fi′Ai式中Wi為組分i的量，它可以是質(zhì)量，也可以是摩爾或體積（對(duì)氣體）；Ai為峰面積，fi′為換算系數(shù)，稱為定量校正因子。它可表示為

fi′=Wi/Ai定量校正因子定義為：?jiǎn)挝环迕娣e的組分的量。檢測(cè)器靈敏度Si與定量校正因子有以下關(guān)系式