常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)要點(diǎn)

常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)要點(diǎn)初步掌握基本的無菌操作要領(lǐng)養(yǎng)成良好的無菌操作習(xí)慣形成可持續(xù)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境促進(jìn)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行操作準(zhǔn)備環(huán)境消毒1將實(shí)驗(yàn)所需大中小已高壓滅菌槍盒，移液器，已高壓滅菌鋁制飯盒（內(nèi)裝1.5mlEP管或15ml，50ml離心管，5ml槍頭等）放入無菌操作臺(tái)。2無菌操作臺(tái)及房間實(shí)驗(yàn)前紫外消毒半小時(shí)。3操作時(shí)關(guān)閉房間紫外，通風(fēng)5-10min，關(guān)閉操作臺(tái)紫外，打開風(fēng)機(jī)及照明。操作準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1換上專用實(shí)驗(yàn)服和手套，并用消毒酒精消毒手套2用75%酒精擦拭放置顯微鏡的桌面及顯微鏡載物臺(tái)并打開顯微鏡3打開CO2培養(yǎng)箱取出細(xì)胞置于顯微鏡上觀察，以此決定進(jìn)行何種操作。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染，及時(shí)將其丟棄。（垃圾桶分干濕兩種，帶液體的東西棄于濕桶，請(qǐng)勿混棄）4用75%酒精擦拭無菌操作臺(tái)的臺(tái)面，從冰箱中取出1×PBS1×Trpysin以及合適的培養(yǎng)基，用消毒酒精擦拭其外表面后放入操作臺(tái)（培養(yǎng)基混勻確認(rèn)其無渾濁）

貼壁細(xì)胞的換液與傳代換液1吸棄培養(yǎng)盤內(nèi)的液體再換入新鮮完全培養(yǎng)液。大部分細(xì)胞培養(yǎng)一般用DMEM+10%FBS,或用MEM,RPMI-1640。用其他特殊培養(yǎng)基的細(xì)胞可在ATCC網(wǎng)站查詢或詢問來源地。2盤內(nèi)排除污染的情況外，若有較多懸浮物可用1×PBS洗一遍后再加新鮮培液。3放回培養(yǎng)箱貼壁細(xì)胞的換液與傳代傳代1吸棄上清，加入1×PBS清洗剩余培液后加入1×Trpysin進(jìn)行消化，期間應(yīng)將其放入培養(yǎng)箱，溫度適于胰酶消化。時(shí)不時(shí)將其取出放鏡下觀察掌握消化進(jìn)程（制定一個(gè)時(shí)間梯度，如：2min，5min，10min等）鏡下觀察細(xì)胞從多變體或梭狀等皺縮為圓球狀，輕敲盤邊就飄起移動(dòng)即為消化完全。貼壁細(xì)胞的換液與傳代傳代2加入完全培液終止消化，終止體積至少為1:11）實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬H為留種則從細(xì)胞懸液中取出一部分丟棄后再補(bǔ)足培液。若細(xì)胞對(duì)胰酶敏感則需要將剩下的細(xì)胞懸液移至離心管離心去上清后用培液重懸重新鋪板。2）按實(shí)驗(yàn)要求分盤則需現(xiàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。之后按計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算后分入相應(yīng)培養(yǎng)盤。

3）將分好后的細(xì)胞放回培養(yǎng)箱

計(jì)數(shù)方法用70%酒精清潔血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片，鏡頭紙擦干；取20μl細(xì)胞懸浮液小心地從蓋玻片的邊緣加入血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板的兩個(gè)室，通過毛細(xì)管作用，細(xì)胞懸浮液在血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片之間均勻地分布；切勿加入過量，只要充滿即可。置入顯微鏡，用10倍的目鏡和10倍的物鏡觀察細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其中四個(gè)大的方陣中的細(xì)胞數(shù)，如果細(xì)胞濃度太高，可稀釋再統(tǒng)計(jì)，記住稀釋的倍數(shù)；細(xì)胞濃度=（四個(gè)方陣中細(xì)胞數(shù)之和/4）X104/ml，方陣上方和左邊邊緣的細(xì)胞可統(tǒng)計(jì)在內(nèi)，但下方和右邊邊緣的細(xì)胞則不應(yīng)統(tǒng)計(jì)，如有細(xì)胞團(tuán)計(jì)為一個(gè)。用70%酒精和蒸餾水清潔血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片，鏡頭紙擦干。計(jì)數(shù)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)板的基本結(jié)構(gòu)和計(jì)數(shù)范圍

血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板(hemocytometer)

含有兩個(gè)室，每個(gè)室被劃分為9個(gè)方陣，其中4個(gè)方陣有16個(gè)小方格，為0.1mm3

或1x10–4

ml，細(xì)胞濃度。取決于已知體積中的細(xì)胞數(shù)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇凍存1準(zhǔn)備好凍存細(xì)胞所需的低溫冰箱，液氮罐及液氮，細(xì)胞凍存管并寫好標(biāo)簽：細(xì)胞名稱，時(shí)間及保存人；2取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（融合度達(dá)70-80%），收集細(xì)胞前24h換液一次3吸出培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞一次，除去，加入1mlTrypsin-EDTA,放入37℃保溫3-5min,使細(xì)胞脫離底部；4離心細(xì)胞并重懸浮于10%DMSO/90%FBS中，大約1-5x106cells/ml5每個(gè)凍存管中加入1ml細(xì)胞懸浮液，擰緊蓋子6冷凍細(xì)胞應(yīng)緩慢降溫，可用裝有異丙醇的冷凍盒(每兩個(gè)小時(shí)溫度下降10℃)，放入-20℃冰箱中過夜，第二天再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱，可保存數(shù)月，如需長期保存，應(yīng)轉(zhuǎn)至液氮中。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇復(fù)蘇

在37℃水浴中預(yù)熱培養(yǎng)基；將凍存的細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中至解凍，用紙巾擦干管外水分，70%酒精消毒；）檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉。）操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。將細(xì)胞用移液管放入適量預(yù)熱的培養(yǎng)基中，混勻，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；由于細(xì)胞保存液中通常含有DMSO，對(duì)細(xì)胞生長有毒性，應(yīng)除去。對(duì)于貼壁細(xì)胞，待其貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基；對(duì)于初始細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞以及一些敏感細(xì)胞類型應(yīng)及時(shí)通過離心除去DMSO操作注意點(diǎn)實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在臺(tái)面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操

作。小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。操作時(shí)所用容器若非必須不要有兩個(gè)以上開口。容器打開后，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。平移取物時(shí)不要經(jīng)過開口上方，繞過去。操作時(shí)若操作面有液體或雜物要及時(shí)清理，隨時(shí)保持清潔。若大多數(shù)容器為塑料制品時(shí)，慎用酒精燈，以免因受熱變形造成密封不佳。操作注意點(diǎn)培養(yǎng)容器保持清潔，培養(yǎng)容器特別是盤蓋和瓶蓋內(nèi)側(cè)建議用真空吸液泵清潔由內(nèi)而外。使用移液器和移液槍若不慎吸至槍體和移液管上方棉塞，槍頭，移液管及內(nèi)容物丟棄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束整理清潔臺(tái)面：1）調(diào)槍至最大量程；2)空槍盒，飯盒，捆綁繩帶出細(xì)胞房至裝填處；3）冰箱拿出的東西放回冰箱，空管空瓶丟入濕桶，廢液缸內(nèi)容物倒入濕桶并用酒精消毒放回；4）酒精擦拭臺(tái)面，關(guān)門，關(guān)風(fēng)機(jī)，關(guān)照明，開紫外。細(xì)胞培養(yǎng)的污染及控制細(xì)菌污染培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。污染后重要的細(xì)胞加PS，不重要的丟棄。真菌污染真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。污染后丟棄。細(xì)胞培養(yǎng)的污染及控制支原體污染多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間，污染后，培液背景像罩了紗霧狀的東西看不清。部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染病毒污染本實(shí)驗(yàn)室一般是293感染腺病毒細(xì)胞產(chǎn)生病