有關(guān)核酸提取與鑒定的最基本實驗

有關(guān)核酸提取與鑒定的最基本實驗2021/6/201哺乳動物細胞總RNA的提取與純化經(jīng)典方法：異硫氰酸胍-酸酚法實驗原理：高濃度強變性劑異硫氰酸胍作用：a.可使細胞結(jié)構(gòu)迅速破壞，釋放出RNA，包括核糖體RNA。b.使RNA酶失活，使釋放出的RNA不被RNA酶降解。采用酸性苯酚/氯仿/異戊醇抽提細胞裂解物時，蛋白質(zhì)變性不溶，而在酸性pH條件下，DNA溶于酚相中，RNA仍留于水相中。取水相用冰異丙醇沉淀，70%乙醇洗滌晾干后即可得到高質(zhì)量總RNA。商品化方法：trizol法2021/6/202trizol法實驗步驟1.提取組織RNA時，每50～100mg組織（已研磨成粉沫）用1mlTrizol試劑進行裂解；提取細胞RNA時，先離心沉淀細胞，每5-10×106個細胞加1mlTrizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞；2.將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30℃下放置5分鐘；3.在上述EP管中，按照每1mlTrizol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋緊管口，用力震蕩15秒，室溫下（15℃～30℃）放置2～3分鐘，12000g（2℃～8℃）離心15分鐘；2021/6/2034.取上層水相置于新EP管中,按照每1mlTrizol加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15℃～30℃）放置10分鐘,12000g（2℃～8℃）離心10分鐘；5.棄上清，按照每1mlTrizol加1ml75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500g（2℃～8℃）離心5分鐘，棄上清；6.沉淀的RNA在室溫下自然干燥數(shù)分鐘，用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。2021/6/204病毒RNA的提取1、取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積Trizol液，混勻；2、室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊管口，用手劇烈搖蕩離心管15秒；3、取上層水相于新EP管，按每1mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘；2021/6/2054、棄去上清液，按每1mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7500g離心5分鐘；5、重復(fù)第4步；6、小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度；7、將RNA溶于Rnase-freewater中,紫外定量。2021/6/206附：磁珠分離mRNA試劑盒1、1.5mlEP管中加入500μL待提取樣品，加入400μL核酸提取液，震蕩10秒；2、將EP管置于60℃保溫10分鐘；

3、將EP管置于室溫放置10分鐘，轉(zhuǎn)移到磁珠分離器上，靜置5分鐘；待磁珠吸附于管壁后，吸凈管中的氣泡和液體，保留磁珠；4、向管中加入1ml洗滌液，取下后震蕩10秒，再置于磁珠分離器上，靜置5分鐘；重復(fù)步驟3，共用洗滌液漂洗2次，最后盡量吸凈液體；2021/6/207

5、若后續(xù)試驗無特殊要求，加入50μLDEPC處理H2O，震蕩，使磁珠懸浮即可；

6、若需要將磁珠洗脫下來，可向管中加入50ul洗脫液（DEPC處理H2O或Long-termRNAStorageBuffer），取下并震蕩10秒，再將管置于恒溫裝置上60℃保溫5分鐘；

7.立即將上述EP管重新置于磁珠分離裝置上，靜置3分鐘，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，取出清液（棄磁珠），即為提取的RNA。2021/6/208RNA抽提注意事項1、器皿處理，塑料用DEPC浸泡，玻璃用高溫處理。2、樣本要求：新鮮。3、操作溫度：盡可能在低溫下操作，如液氮里或冰浴上。4、操作過程防污染（口罩手套、環(huán)境干凈）。5、每一步操作注意點：勻漿（完全）萃取（吸取上層的60%-70%）沉淀、洗滌按操作規(guī)程干燥（不能用真空干燥，要自然干燥）6、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。2021/6/209細菌質(zhì)粒DNA的提取與純化2021/6/2010細菌的收獲收獲1）將2ml含抗生素的LB加入到容量為15ml并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。2）將1.5ml培養(yǎng)物倒入EP管中，于4℃以12000g離心60秒。3）吸去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥，注意吸頭遠離細菌沉淀。2021/6/2011細菌質(zhì)粒DNA的提取與純化（堿裂解法）1）將細菌沉淀，所得重懸于100μL用冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩。溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，每瓶約100ml，在10lbf/in2（6.895×104Pa）高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細菌沉淀在溶液I中完全分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。2021/6/20122）加200μL新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）、1%SDS蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個內(nèi)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。3）加150μL用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml蓋緊管口，將EP管倒置后振蕩10秒鐘，溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3－5分鐘。2021/6/20134）用微量離心機于4℃12000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到新EP管中。5）可做可不做：加等量酚：氯仿，振蕩混勻，于4℃以12000g離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一新EP管中。有些工作者認為不必用酚：氯仿進行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會影響限制酶切反應(yīng)。6）用2倍休積的乙醇于室溫沉淀DNA.振蕩混合，于室溫放置2分鐘。7）用微量離心機于4℃以12000g離心5分鐘。8）小心吸去上清液，將EP管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出，將附于管壁的液滴除盡。注意吸頭遠離核酸沉淀。9）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所述方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。2021/6/2014堿裂解法提取細菌質(zhì)粒DNA的原理溶液Ⅰ：懸浮50mmol/L葡萄糖25mmlol/LTris·Cl(PH8.0)10mmol/LEDTA(PH8.0)在10lbf/in-2(6.895×10--4pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘，貯存于4℃溶液I的作用：50mM葡萄糖：加了葡萄糖后懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部Tris-Cl溶液：控制好溶液的pHEDTA：是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑2021/6/2015溶液Ⅱ：裂解0.4mol/LNaOH2%SDS臨用前配制，1：1混合破細胞壁的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。SDS:結(jié)合蛋白質(zhì)2021/6/2016溶液Ⅲ：沉淀5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml溶液Ⅲ加入后，鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而SDS由于與蛋白質(zhì)結(jié)合，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，大腸桿菌的基因組DNA因為與蛋白質(zhì)結(jié)合也一起被共沉淀了。2M的醋酸：中和氫氧化鈉，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100kb大小的片斷就沒有辦法再被PDS共沉淀了。2021/6/2017由于還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提：1、酚：萃取蛋白2、氯仿：調(diào)節(jié)液體密度3、異戊醇：消泡劑。2021/6/2018回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70％的乙醇多洗幾次。2021/6/2019操作注意事項第一步：混勻要完全。第二步：時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；必須溫柔混合，不然基因組DNA的斷裂會導(dǎo)致抽提的質(zhì)粒純度大幅下降。第三步：冰上操作，嚴格按操作規(guī)程做。2021/6/20201.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)量一般約為：每毫升原細菌培養(yǎng)物3－5μg。2.如果要通過限制酶切割反應(yīng)來分析DNA，可取1μlDNA溶液加到另一含8μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶，37℃溫育1－2小時。將剩余的DNA貯存于－20℃。3.此方法按比例放大可適用于100ml細菌培養(yǎng)物。2021/6/2021細菌基因組DNA提取純化CTAB/NaCl法：細菌基因組DNA的制備

一、材料

細菌培養(yǎng)物。

二、試劑

1、CTAB十六烷基三甲基溴化銨/NaCl溶液：4.1g

NaCl溶解于80ml

H2O,緩慢加入10g

CTAB,加水至100ml。

2、其它試劑：氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70%

乙醇，TE，10%

SDS，蛋白酶

K

(20mg/ml或粉劑)，5mol/L

NaCl。2021/6/20221、將菌株接種于LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。2、取1.5ml培養(yǎng)物12000r/min離心2min。3、棄上清，沉淀物中加入567μL的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30μL10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h.4、加入100μL5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻后于65℃溫育10min。

5、加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入新EP管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。6、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇。2021/6/2023哺乳動物細胞DNA的提取與純化鹽析法原理：細胞中的DNA和RNA分別與蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成脫氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在細胞破碎后，這兩種核蛋白將混雜在一起。因此，要制備DNA首先要將這兩種核蛋白分開。已知這兩種核蛋白在不同濃度的鹽溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/LNaC1的稀鹽溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脫氧核糖核蛋白的溶解度則最?。▋H約為在純水中的1%）；而在lmol/LNaCl的濃鹽溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在純水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度則明顯降低。根據(jù)這種特性，調(diào)整鹽濃度即可把這兩種核蛋白分開。因此，在細胞破碎后，用稀鹽溶液，反復(fù)清洗，所得沉淀即為脫氧核糖核蛋白成分。2021/6/2024分離得到的脫氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸鈉（SDS）使蛋白質(zhì)成分變性，使DNA游離出來，再用含有異戊醇的氯仿沉淀除去變性蛋白質(zhì)。最后根據(jù)DNA只溶于水而不溶于有機溶劑的特點，加入95%的乙醇即可從溶液中把DNA沉淀出來，獲得產(chǎn)品。2021/6/2025細胞破碎時，細胞內(nèi)的脫氧核糖核酸酶（DNase）立即開始降解DNA，如不及時采取抑制措施，最后將會得不到任何DNA。為此，如在本實驗中加入檸檬酸鹽、EDTA等螯合劑以除DNase必需的Mg2＋離子，使DNase活性降低，并要求整個操作均在4℃以下進行，最后加入SDS使所有的蛋白質(zhì)（包括DNase）變性。如果希望獲得更大分子的DNA，則在細胞破碎后，及時加入SDS使蛋白質(zhì)（包括DNase）變性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白質(zhì)成為碎片或氨基酸，及時阻止DNase的降解作用。2021/6/2026DNA分子很大、很長，在水中呈黏稠狀，但DNA鏈的雙螺旋結(jié)構(gòu)不宜小角度的折疊，使之DNA分子具有剛性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折疊和壓擠等剪切力，將使DNA斷裂成碎片。為保證獲得大分子DNA，操作時應(yīng)避免劇烈振搖，或過大的離心力。轉(zhuǎn)移吸取DNA時不可用過細的吸頭，不可猛吸猛吹，更不能用細的吸頭反復(fù)吹吸。2021/6/2027試劑及器材（1）0.15mol/LNaCl–0.015mol/LpH7.0檸檬酸鈉溶液：稱取8.77gNaCl，4.41g檸檬酸三鈉（Na3C6H507·2H20），用約800ml蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0，最后定容至1000ml。（2）0.15mol/LNaCl–0.1mol/LEDTANa2溶液：稱取8.77gNaCl，37.2gEDTANa2溶于約800ml蒸餾水中，以NaOH調(diào)pH至8.0，最后定容至1000ml。（3）5%（W/V）十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液：稱取5gSDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。

（4）氯仿–異戊醇溶液：按氯仿:異戊醇=24:1配制。5）pH8.0TE緩沖液或0.01mol/LNaOH：120mol/LTris–HCl，lmol/LEDTANa2?；蛉aOH0.4g加蒸餾水至1000ml。

（6）95％（V/V）乙醇1000ml。（7）75％（V/V）乙醇1000ml。（8）組織搗碎機。（9）玻璃勻漿器。（10）冷凍離心機。（11）冰、粗鹽。2021/6/2028實驗步驟（1）本實驗以兔肝臟作材料（其他動物肝臟也可）。實驗前將兔饑餓24h以上，以避免糖原的干擾。（2）用燒杯（500ml）裝1/3體積的冰，加入少量水及約20g食鹽，制成冰鹽水。（3）將經(jīng)過饑餓的兔頸部放血致死，迅速開腹取出肝臟，稱取約10g浸入在冰鹽水預(yù)冷的0.15mol/LNaCl–0.015mol/L檸檬酸鈉溶液中。除去脂肪、血塊等雜物，再用少量溶液反復(fù)洗滌幾次，直至組織塊無血為止。（4）將洗凈的組織剪成碎塊。先加入20ml0.15mol/LNaCl–0.015mol/L檸檬酸鈉溶液，放在組織搗碎機中迅速搗成勻漿，再放入玻璃勻漿器中勻漿2～3次，使細胞充分破碎。最后加入0.15mol/LNaCl–0.015mol–L檸檬酸鈉溶液至50ml。（5）勻漿液于4℃6000r／min離心15min，棄上清。在沉淀中加入4倍體積冷的0.15mol/LNaCl–0.015mol/L檸檬酸鈉溶液，攪勻，按上述條件，離心棄上清。如此重復(fù)操作2～3次。最后棄去上清，留沉淀。2021/6/2029（6）將沉淀物（約5m1）懸浮于5倍體積的pH8.0，0.015mol/LNaCl–0.1mol/L

EDTANa2溶液中，攪勻，然后邊攪拌邊慢慢滴加5%SDS溶液，直至SDS的最終濃度達1%為止（應(yīng)加多少毫升?）。（此時溶液變得十分黏稠，若不黏稠應(yīng)重做。）然后，加入固體NaCl使最終濃度達1mol/L。繼續(xù)攪拌30～45min，以確保NaCl全部溶解，此時可見溶液粘稠度下降。（7）將上述混合溶液倒于一個300ml的帶塞三角瓶中，加入等體積的氯仿–異戊醇，振蕩10min。室溫3000r/min離心10min（為什么可以在室溫操作?），此時可見離心液分為3層：上層為水溶液，中層為變性蛋白塊，下層為氯仿–異戊醇。小心吸取上層水相，記錄體積，放入三角瓶中，向水相中加入等體積氯仿–異戊醇，振蕩，離心，如此重復(fù)抽提2–3次，除凈蛋白質(zhì)。（8）最后1次離心后，小心吸取上層溶液（不要吸取下層氯仿），記錄體積，放入干燥小燒杯中，加入2倍體積預(yù)冷的95%乙醇。邊加邊用玻璃棒慢慢攪拌，隨著乙醇的不斷加入可見溶液出現(xiàn)黏稠狀物質(zhì)，將黏稠絲狀物盡可能多的纏在玻璃棒上。黏稠絲狀物即是DNA。（9）將所得的DNA從玻璃棒上取下，用75%乙醇洗2次，置于干燥器中抽干，稱取重量，計算產(chǎn)率。（10）按200μg/ml的濃度稱取一定量DNA，溶于0.01mol/LNaOH溶液或pH8.0TE緩沖液中（干燥DNA不易溶解，應(yīng)在測定前幾天預(yù)先溶解）。2021/6/2030有機溶劑抽提法1、切取組織5g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細越好)。

2、倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。

3、加1ml

10%

SDS,

混勻,此時樣品變得很粘稠。

4、加50ul或1mg

蛋白酶

K,

37℃保溫1-2h,

直至組織完全溶解。

5、加1ml

5mol/L

NaCl,

混勻,5000rpm離心數(shù)秒鐘。

6、取上清液于新EP管中，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm離心

5分鐘。

7、取上層水相至另一新EP管,

加2倍體積乙醚抽提(在通風櫥中)。

8、移去上層乙醚,保留下層水相。

9、加1/10

體積3mol/L

NaAc,

及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜置10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。

10、用玻璃棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml

TE中,-20℃保存。

11、如果DNA溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm短暫離心,取上清;

如要除去其中的RNA,可加5μL

RNaseA(10μg/μL),

37℃保溫30分鐘,

用酚抽提后,

按步驟9-10重沉淀DNA。

2021/6/2031SDS法實驗原理：DNA主要存在于細胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細胞；苯酚和氯仿可使蛋白質(zhì)變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。

2021/6/2032試劑配制1、Tris–HCL1mol/LPH8.050ml

40mlddH2O，6.057g固體Tris放入燒杯中溶解，用濃鹽酸調(diào)PH值到8.0，ddH2O定容至50ml，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、生理鹽水:0.85%NaCL100ml

在20mlddH2O中溶解0.85g固體NaCL，定容至100ml，搖勻后，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、EDTA0.5mol/LPH8.050ml

將9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40mlddH2O，用1g的NaOH顆粒（慢慢加入）調(diào)PH值到8.0，定容至50ml，如果EDTA難溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。

4、TES緩沖液（釋放DNA）100ml

將0.5844g的5mol/lNaCl溶解于80mlddH2O，在分別加入1ml的0.5mol/lEDTA、0.2ml的Tris-HCl(pH=8.0)，加定容至100ml,搖勻后，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2021/6/20335、10%SDS（變性劑破細胞壁）100ml

將10g的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解于80mlddH2O中，于68℃加熱溶解，用濃HCl調(diào)至PH=7.2，定容至100ml，搖勻后，貼上標簽，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6、蛋白酶K（降解蛋白質(zhì)）：20mg/mL無菌三蒸水溶解。

7、RNA酶（降解RNA）：將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份存于–20℃。

8．氯仿：異戊醇=24：1100ml

按24:1的比例加入氯仿、異戊醇，搖勻，轉(zhuǎn)到準備好的瓶中，貼上標簽，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

9．TE緩沖液（溶解DNA）PH8.050ml

將0.5ml的10mmolTris-HCl(PH8.0)、0.1ml的0.5mol/lEDTA(PH8.0)加入到50ml的容量瓶中，調(diào)PH8.0定容至50ml搖勻后，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2021/6/2034實驗步驟1．組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取約0.5g組織，放入1.5mlEP管中，剪碎。

2．加入0.45mlTES混勻，再加入50ulSDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混勻后，于56°C保溫4-6h，每2h搖1次。

3．于室溫加入等體積飽和酚（500ul），顛倒混勻，10000r/min離心10min，分離水相和有機相，小心吸取上層含DNA的水相到新的1.5mlEP管。

4．加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，10000r/min，離心10min，取上層轉(zhuǎn)移到新的1.5mlEP管中。

5．加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），顛倒混勻，10000r/min，離心10min，取上清液到新的1.5mlEP管中。

6．加入2.5倍體積的-20°C預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA，觀察現(xiàn)象。

7．12000r/mim，離心10min，棄乙醇。

8．-20°C保存的75%乙醇洗滌，10000r/min，離心5分鐘，去乙醇，55°C干燥DNA。

9．加入適量TE溶解DNA（根據(jù)DNA的量），-20°C保存?zhèn)溆谩?021/6/2035注意事項1．抽提每一步用力要柔和，防止機械剪切力對DNA的損傷。

2．取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質(zhì)層。

3．乙醇漂洗去除乙醇時，不要蕩起DNA。

4．離心后，不要晃動離心管，拿管要穩(wěn)，斜面朝外。2021/6/2036核酸樣品純度測定DNA模板的純度、含量測定260nm1OD雙鏈DNA50μg/ml單鏈DNA40μg/mlOD260nm/OD280nm≈1.8RNA模板的純度、含量測定260nm1OD單鏈RNA40μg/mlOD260nm/OD280nm≈2.02021/6/2037DNA的瓊脂糖凝膠電泳實驗原理帶電粒子在電場中可以按固定方向移動的現(xiàn)象，稱為電泳。DNA分子在pH值高于其等電點的緩沖液中帶負電荷，在電場中向正極移動,緩沖液pH值偏離等電點愈遠，其所帶的電荷愈多。在一定的電場強度下，不同的DNA片段的遷移速度不一樣。其遷移速度主要取決于DNA的分子大小、所帶電荷量等，分子量愈小、帶電荷量愈多，遷移速度愈快，相同分子量的不同構(gòu)型的DNA分子，其遷移速度也不一樣。超螺旋質(zhì)粒DNA的泳動速度最快，線狀質(zhì)粒DNA次之，復(fù)制中間體質(zhì)粒DNA泳動速度最慢。另外，同一種DNA分子，在高濃度瓊脂糖膠中泳動速度較慢，在低濃度瓊脂糖膠中泳動速度較快。2021/6/2038實驗步驟1、瓊脂糖膠液的制備：稱取1g瓊脂糖，置于三角燒瓶中，加入100mlpH8.3Tris-硼酸EDTA緩沖液，加熱，瓊脂全部融化后溶液變澄清，取出搖勻，即為1%瓊脂。（也可加溴化乙啶2.5ul）

2、凝膠板的制備

用橡皮膏將凝膠塑料托盤短邊缺口封住，置工作臺面上（將樣品槽模板（即梳子）插進托盆長邊上的凹槽內(nèi)（距一端約1.5cm），梳子底邊與托盤表面保持0.5一1mm的間隙。待瓊脂糖冷至65℃左右，加入4μl熒光指示劑?；靹蚝笮⌒牡氐谷胪斜P內(nèi)，使凝膠緩慢地展開直至在托盤表面形成一層厚度均勻膠層．其內(nèi)不存有氣泡．室溫下靜置0.5一lh。待凝固完全后，在梳齒附近加入少量緩沖液潤濕凝膠，雙手均勻用力輕輕拔出樣品槽模板（注意勿使樣品槽破裂）。2021/6/20393、取下封邊的橡皮膏，將凝膠連同托盤放人電泳槽中，用緩沖液先填滿加樣槽，防