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文檔簡介
醫(yī)療器械微生物限度檢驗2021/4/261精品概述微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。微生物限度檢查細菌、真菌菌落數(shù)控制菌2021/4/262精品概述微生物:形體微小,結(jié)構(gòu)簡單,通常要用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物特點:1、個體微小,一般<0.1mm
2、構(gòu)造簡單,有單細胞的,簡單多細胞的,非細胞的
3、進化地位低分類:原核類:二菌,四體(細菌、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體、衣原體)真核類:真菌,原生動物,顯微藻類
非細胞類:病毒,亞病毒2021/4/263精品2021/4/264精品概述醫(yī)療用品的分類按醫(yī)療用品與人體接觸的性質(zhì)以及對人體使用安全性要求分三類:
a)Ⅰ類醫(yī)療用品:接觸人體完整皮膚的醫(yī)療用品
b)Ⅱ類醫(yī)療用品:接觸人體未破損粘膜的醫(yī)療用品
c)Ⅲ類醫(yī)療用品:進入人體無菌組織、器官和血液以及接觸破損皮膚和粘膜的醫(yī)療用品
2021/4/265精品常用檢測標準《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄XIJ“微生物限度檢查法”GB15979-2002《一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》附錄BISO11737-1:2006Sterilizationofmedicaldevices–Microbiologicalmethods—Part1:Determinationofapopulationofmicroorganismsonproducts2021/4/266精品項目《藥典》2010GB15979-2002細菌定量:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2個平皿定量:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基5個平皿真菌定量:玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基至少2個平皿72h
酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基定量:沙氏瓊脂培養(yǎng)基5個平皿7天定性:沙氏液體培養(yǎng)基7天大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基/大腸菌群膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍瓊脂、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基沙門菌營養(yǎng)肉湯、四硫酸鈉亮綠培養(yǎng)基、膽鹽硫乳瓊脂(或沙門、志賀菌屬瓊脂)培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞藍瓊脂)培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基/銅綠假單胞菌膽鹽乳糖、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、氧化酶試驗、綠膿菌素試驗、SCDLP培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、氧化酶試驗、綠膿菌素試驗、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、明膠液化試驗42℃生長試驗金黃色葡萄球菌亞碲酸鈉(鉀)肉湯(或營養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)基、卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、血漿凝固酶試驗SCDLP培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵試驗、血漿凝固酶試驗梭菌庖肉培養(yǎng)基、含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、過氧化氫酶試驗/溶血性鏈球菌/葡萄糖肉湯、血瓊脂培養(yǎng)基、鏈球菌試驗、桿菌肽敏感試驗白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、念珠菌顯色培養(yǎng)基、1%聚山黎脂80-玉米瓊脂培養(yǎng)基、芽管試驗/2021/4/267精品實驗條件無菌操作技術(shù)實驗環(huán)境實驗器材2021/4/268精品無菌操作技術(shù)微生物學(xué)基礎(chǔ)微生物實踐基礎(chǔ)無菌操作意識2021/4/269精品實驗環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域或隔離系統(tǒng);定期按GB/T16292-16294:2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證;實驗中監(jiān)控:實驗時將制備好的營養(yǎng)瓊脂平板打開放于實驗臺上,至實驗結(jié)束收起,30℃~35℃培養(yǎng)48h,菌落平均數(shù)應(yīng)小于1cfu/φ90mm。2021/4/2610精品9、人的價值,在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣,抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:53:14PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心,不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望,作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個人炫耀什么,說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義,不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個人即使已登上頂峰,也仍要自強不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3實驗器具
儀器超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、薄膜過濾裝置、比濁儀等。用具試管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密PH試紙、濾膜、濾杯、剪刀、鑷子、無菌服、牛皮紙等。2021/4/2612精品實驗準備實驗環(huán)境保證實驗試液培養(yǎng)基滅菌方法2021/4/2613精品實驗環(huán)境保證環(huán)境清潔,表面消毒(75%(V/V)乙醇、新潔爾滅(1:1000)溶液或其他適宜消毒溶液)空氣過濾系統(tǒng),紫外燈或臭氧空氣消毒儀2021/4/2614精品實驗試液稀釋劑
1.0.9%氯化鈉溶液
2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液
3.pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液:調(diào)解pH至近中性,其中蛋白胨對細菌細胞有保護作用有利于菌落數(shù)及控制菌測定。表面活性劑、中和劑或滅活劑鑒定用試劑
1.靛基質(zhì)試液
2.1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液(氧化酶試液)
3.三氯甲烷
4.1mol/l鹽酸試液2021/4/2615精品培養(yǎng)基標準菌株處理及增菌用培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基2021/4/2616精品培養(yǎng)基培養(yǎng)基的酸堿度應(yīng)符合細菌生長要求。應(yīng)按各種培養(yǎng)基要求準確測定調(diào)節(jié)pH值。多數(shù)細菌生長的適宜pH值為7.2~7.6。酵母菌霉菌(6.0~6.5)。調(diào)節(jié)可用1NHCl或NaOH。培養(yǎng)基的滅菌時間和溫度,應(yīng)按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進行,以保證滅菌效果及不損失培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分。制成的培養(yǎng)基應(yīng)透明,以便觀察細菌生長性狀以及其他代謝活動所產(chǎn)生的變化。2021/4/2617精品滅菌方式濕熱:115℃~121℃,15min~30min
物品切勿立即取出置冷處,以免急速冷卻,使滅菌物品內(nèi)蒸氣冷凝造成負壓,以致染菌。干熱:160℃~170℃,2h
適于耐高溫的玻璃、陶瓷或金屬器皿的滅菌。滅菌程序需要經(jīng)過驗證。2021/4/2618精品計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用培養(yǎng)基應(yīng)進行培養(yǎng)基的適用性檢查,成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。2021/4/2619精品計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查菌種大腸埃希菌[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]白色念珠菌[CMCC(F)
98001]
黑曲霉[CMCC(F)98003]
驗證試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代),并采用適宜的菌種保藏技術(shù),以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。2021/4/2620精品計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備取細菌新鮮培養(yǎng)物(一般18h~24h,白念24h~48h,黑曲霉5~7天),用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)50cfu~100cfu的菌懸液(黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液);菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時內(nèi)使用,若保存在2℃~8℃可以在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2℃~8℃,在驗證過的貯存期內(nèi)使用。2021/4/2621精品計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基接種
金黃色葡萄球菌2個平皿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基大腸埃希菌2個平皿枯草芽孢桿菌2個平皿
玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌2個平皿黑典霉2個平皿酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:白色念珠菌2個平皿用相同的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基做對照2021/4/2622精品計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果判定若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%,且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致,判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。2021/4/2623精品樣品準備供試品進入無菌實驗室前應(yīng)作表面消毒,用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒。檢驗數(shù)量:應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品,膜劑還不得少于4片。一般應(yīng)隨機抽取不少于檢驗用量(兩個以上最小包裝單位)的3倍量供試品。2021/4/2624精品樣品準備檢驗量:除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗量為10g或10ml;化學(xué)膜劑100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗應(yīng)增加20g或20ml(其中10g或10ml用于陽性對照試驗)。2021/4/2625精品供試液制備液體供試品、固體、半固體或黏稠液供試品取10ml或10g用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml,混勻,作為1:10的供試液。油劑可加入適量的無菌吐溫80使供試品分散均勻;
水溶性液體亦可用混合供試品原液作為供試液;非水溶性供試品:乳化或萃取;膜劑供試品:取供試品100cm2,剪碎,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml浸泡,振搖,作為1:10的供試液;腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品:取供試品10g,加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑)PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(用于結(jié)腸溶制劑)至100ml,置45℃水浴中,振搖,使溶解,作為1:10的供試液;氣霧劑、噴霧劑供試品,經(jīng)處理后同第一項制備供試液;貼劑供試品具抑菌活性的供試品:培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法;2021/4/2626精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)實驗方法傾注平皿法薄膜過濾法培養(yǎng)基細菌總數(shù):營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基霉菌及酵母菌計數(shù):玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基2021/4/2627精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)培養(yǎng)和計數(shù)除另有規(guī)定外,細菌培養(yǎng)3天,逐日點計菌落數(shù)霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天,逐日點計菌落數(shù)必要時可延長至7天進行菌落計數(shù)點計菌落數(shù)后,計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù),按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)2021/4/2628精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證(1)試驗組平皿法:供試液1ml+1ml試驗菌菌懸液,平行制備2個平皿,菌落計數(shù);薄膜過濾法:供試液,過濾,沖洗,在最后一次的沖洗液中加入1ml試驗菌,過濾,菌落計數(shù);(2)菌液組測定所加的試驗菌數(shù);(3)供試品對照組取規(guī)定量供試液,按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù);(4)稀釋劑對照組若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時,應(yīng)增加稀釋劑對照組,以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。稀釋劑+試驗菌菌懸液;2021/4/2629精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證試驗至少應(yīng)進行3次獨立的平行試驗,并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。結(jié)果判斷在3次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率應(yīng)均不低于70%;若試驗組的菌數(shù)回收率均不低于70%,可照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù);若任一次試驗中試驗組的菌數(shù)回收率低于70%,應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證。2021/4/2630精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)1.平皿法采用平皿法進行菌數(shù)測定時,應(yīng)取適宜的連續(xù)2~3個稀釋級的供試液。取供試液1ml,置直徑90mm的無菌平皿中,注入15~20ml溫度不超過45℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固,倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。陰性對照試驗取試驗用的稀釋液1ml,置無菌平皿中,注入培養(yǎng)基,凝固,倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)的培養(yǎng)基各制備2個平板,均不得有菌生長。2021/4/2631精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)營養(yǎng)瓊脂-細菌玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基-霉菌2021/4/2632精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)1.平皿法菌數(shù)報告規(guī)則:細菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100的稀釋級,作為菌數(shù)報告(取兩位有效數(shù)字)的依據(jù);以最高平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù);如果各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅是最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落數(shù)小于1時,以<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。2021/4/2633精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)2.薄膜過濾法取相當于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾。若供試品每1g或1ml所含的菌數(shù)較多時,可取適宜稀釋級的供試液1ml,過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。陰性對照試驗取試驗用的稀釋液1ml,照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。2021/4/2634精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)2.薄膜過濾法菌數(shù)報告規(guī)則:以相當于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù);若濾膜上無菌生長,以<1報告菌數(shù)(每張濾膜過濾1g或1ml供試品),或<1乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。
2021/4/2635精品細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)在特殊情況下,若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細菌,則應(yīng)分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細菌數(shù),與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細菌數(shù)進行比較,以菌落數(shù)較高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結(jié)果。2021/4/2636精品2021/4/2637精品控制菌檢查法驗證菌種(菌液制備同前)大腸埃希菌[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]生孢梭菌[CMCC(B)64941]2021/4/2638精品控制菌檢查法驗證(1)試驗組取規(guī)定量供試液及10cfu~100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中,依相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時,取規(guī)定量供試液,過濾,沖洗,試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中,過濾后,注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。(2)陰性菌對照組設(shè)立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組,驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌;驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌,梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。結(jié)果判斷陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌,按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查;若試驗組未檢出試驗菌,應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證。2021/4/2639精品大腸埃希菌檢驗
取供試液10ml(相當于供試品1g、1ml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時,必要時可延長至48小時。取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi),培養(yǎng),于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察,同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光,為MUG陽性,不呈現(xiàn)熒光,為MUG陰性。觀察后,沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液,液面呈玫瑰紅色,為靛基質(zhì)陽性;呈試劑本色,為靛基質(zhì)陰性。本底對照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。2021/4/2640精品大腸埃希菌檢驗MUG靛基質(zhì)試驗2021/4/2641精品大腸埃希菌檢驗如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性,判供試品檢出大腸埃希菌;如MUG陰性,靛基質(zhì)陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌;如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性,或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性,均應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)18~24小時。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,應(yīng)進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗,確認是否為大腸埃希菌。2021/4/2642精品大腸埃希菌檢驗大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色、菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心、圓形,稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤,常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色,菌落中心呈深桃紅色,圓形,扁平,邊緣整齊,表面光滑,濕潤2021/4/2643精品大腸菌群檢驗取含適量(不少于10ml)的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支,分別加入1:10的供試液1ml(含供試品0.1g或0.1ml)、1:100的供試液1ml(含供試品0.01g或0.01ml)、1:1000的供試液1ml(含供試品0.001g或0.001ml),另取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基加入稀釋液1ml作為陰性對照管。培養(yǎng)18~24小時。2021/4/2644精品大腸菌群檢驗?zāi)扄}乳糖發(fā)酵管若無菌生長、或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣,判該管未檢出大腸菌群;若產(chǎn)酸產(chǎn)氣,應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)18~24小時。若平板上無菌落生長,或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌,判該管未檢出大腸菌群;若平板上生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,且為革蘭陰性無芽孢桿菌,應(yīng)進行確證試驗。2021/4/2645精品大腸菌群檢驗大腸菌群落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色,圓形,扁平或稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤
麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色,圓形,扁平或稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤2021/4/2646精品大腸菌群檢驗確證試驗從上述分離平板上挑選4~5個疑似菌落,分別接種于乳糖發(fā)酵管中,培養(yǎng)24~48小時。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣,判該乳糖發(fā)酵管檢出大腸菌群,否則判未檢出大腸菌群。根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù),按下表報告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。2021/4/2647精品可能的大腸菌群數(shù)表2021/4/2648精品沙門菌檢驗取供試品10g或10ml,直接或處理后接種至適量(不少于200ml)的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,用勻漿儀或其他適宜方法混勻,培養(yǎng)18~24小時。取上述培養(yǎng)物1ml,接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時后,分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂(或沙門、志賀菌屬瓊脂)培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞藍瓊脂)培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)18~24小時(必要時延長至40~48小時)。若平板上無菌生長,或生長的菌落不同于下表所列的特征,判供試品未檢出沙門菌。2021/4/2649精品沙門菌檢驗沙門菌菌落形態(tài)特征2021/4/2650精品沙門菌檢驗若平板上生長的菌落與上表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似,用接種針挑選2~3個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種,培養(yǎng)18~24小時,如斜面未見紅色、底層未見黃色;或斜面黃色、底層無黑色,判供試品未檢出沙門菌。否則,應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進行適宜的生化試驗和血清凝集試驗,確認是否為沙門菌。2021/4/2651精品銅綠假單胞菌檢驗取供試液10ml(相當于供試品1g、1ml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時。取上述培養(yǎng)物,劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)18~24小時。銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表面濕潤,灰白色,周圍時有藍綠色素擴散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板上的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似,應(yīng)挑選2~3個菌落,分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)18~24小時。取斜面培養(yǎng)物進行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗。2021/4/2652精品銅綠假單胞菌檢驗氧化酶試驗取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi),用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上,滴加新配置的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液,在30秒內(nèi)培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性,否則為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性,均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則,應(yīng)進行綠膿菌素試驗。綠膿菌素試驗取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)24小時,加三氯甲烷3~5ml至培養(yǎng)管中,攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻,將三氯甲烷相移至另一試管中,加入1mol/l鹽酸試液約1ml,振搖后,靜置片刻,觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色,為綠膿菌素試驗陽性,否則為陰性。同時用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對照,陰性對照試驗應(yīng)呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性,判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性,應(yīng)繼續(xù)進行適宜的生化試驗,確認是否為銅綠假單胞菌。2021/4/2653精品金黃色葡萄球菌檢驗取供試液10ml(相當于供試品1g、1ml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)亞碲酸鈉(鉀)肉湯(或營養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時,必要時可延至48小時。取上述培養(yǎng)物,劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上,培養(yǎng)24~72小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于下表所列特征,判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。若平板上生長的菌落與下表所列的菌落特征相符或疑似,應(yīng)挑選2~3個菌落,分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)18~24小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進行革蘭染色,并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18~24小時,作血漿凝固酶試驗。2021/4/2654精品金黃色葡萄球菌檢驗金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色,圓形凸起,邊緣整齊,外圍有黃色環(huán),菌落直徑0.7~1mm卵黃氯化鈉瓊脂金黃色,圓形凸起,邊緣整齊,外圍有卵磷脂分解的乳濁圈,菌落直徑1~2mm2021/4/2655精品金黃色葡萄球菌檢驗血漿凝固酶試驗取滅菌小試管3支,各加入血漿和無菌水混合液(1:1)0.5ml,再分別加入可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物(或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液)0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物(或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液)0.5ml、營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml,即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3管同時培養(yǎng),3小時后開始觀察直至24小時。陰性對照管的血漿應(yīng)流動自如,陽性對照管血漿應(yīng)凝固,若試驗管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗陽性,否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規(guī)定時,應(yīng)另制備血漿,重新試驗。2021/4/2656精品金黃色葡萄球菌檢驗若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性,判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。2021/4/2657精品梭菌檢驗取供試液10ml(相當于供試品1g,1ml)2份,其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的0.1%新鮮庖肉培養(yǎng)基中。各培養(yǎng)基管在厭氧條件下培養(yǎng)48小時。再取上述培養(yǎng)物0.2ml,涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上,在厭氧條件下培養(yǎng)48~72小時。若平板上無菌落生長,判供試品未檢出梭菌;若平板上有菌落生長,應(yīng)挑選2~3個菌落分別進行革蘭染色和過氧化氫酶試驗。過氧化氫酶試驗取上述平板上的菌落,置潔凈玻片上,滴加3%過氧化氫試液,若菌落表面有氣泡產(chǎn)生,為過氧化氫酶試驗陽性,否則為陰性。若上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌,有或無卵圓形或球形的芽孢,過氧化氫酶陰性,判供試品檢出梭菌,否則判供試品未檢出梭菌。2021/4/2658精品白色念珠菌檢驗取供試液10ml(相當于
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