鴨坦布蘇病毒病防治關(guān)鍵技術(shù)研究及應(yīng)用 醫(yī)療臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)

鴨坦布蘇病毒病防治關(guān)鍵技術(shù)研究及應(yīng)用Keytechnologyresearchandapplicationofducktembusuvirusdiseasecontrol目錄TOC\o"1-4"\h\u9950摘要 V20088Abstract VI23500縮略詞表 I19484第一章綜述 210801鴨坦布蘇病毒病 227982病原學(xué) 2192292.1生物學(xué)分類 2105672.2形態(tài)結(jié)構(gòu)及理化培養(yǎng)特性 280863鴨坦布蘇病毒病的主要流行病學(xué)特征 28834江西省蛋鴨場(chǎng)鴨坦布蘇病毒病流行概況 3225095鴨坦布蘇病毒診斷方法 474215.1臨床診斷 4323255.2實(shí)驗(yàn)室診斷方法 485015.2.1病原檢測(cè) 470385.2.2免疫組化方法 574295.2.3間接免疫突光試驗(yàn) 5149115.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 625680第二章研究的目的及意義 727470第三章材料與方法 8264831材料 875761.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病料來源 886071.2主要試劑 8285711.3菌株與細(xì)胞 8202551.4常用試劑及緩沖液配制 833521.5主要儀器 8212011.6分析軟件及說明 98072病原分離鑒定實(shí)驗(yàn) 9113492.1樣品采集 915782.1.1樣品背景調(diào)查 9114552.1.2樣品采集 10164412.2病原分離 10178702.2.1病毒提取分離 10133002.2.2引物設(shè)計(jì) 10286682.2.3病毒RNA提取及第一鏈合成 11242922.2.4全基因擴(kuò)增與克隆 11178872.3基因測(cè)序 11245203病毒復(fù)制試驗(yàn) 12101583.1病毒增殖培養(yǎng) 12185713.2病毒含量測(cè)定 1240813.3實(shí)驗(yàn)分組及攻毒 12165713.4攻毒效果評(píng)價(jià) 12191014病毒傳播途徑探究試驗(yàn) 1311894.1病毒增殖培養(yǎng) 1326094.2實(shí)驗(yàn)分組及方法 13283074.3實(shí)驗(yàn)效果評(píng)價(jià) 13293225鴨坦布蘇病毒防治試驗(yàn) 13252785.1毒株、疫苗來源 13121695.2中草藥配制 13317195.3實(shí)驗(yàn)分組及方法 1476185.4實(shí)驗(yàn)效果評(píng)價(jià) 1414706流行病學(xué)調(diào)查及田間應(yīng)用試驗(yàn) 15322066.1調(diào)查與應(yīng)用試驗(yàn)范圍 15316176.2開展方式 15120196.3實(shí)驗(yàn)效果評(píng)價(jià) 1513422第四章實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1651791病原分離鑒定實(shí)驗(yàn) 16299591.1PCR結(jié)果 1679971.2序列比對(duì)結(jié)果 1749202病毒復(fù)制試驗(yàn) 1856622.1臨床結(jié)果 1932912.2PCR檢測(cè)結(jié)果 1957723病毒傳播途徑探究試驗(yàn) 19110553.1臨床結(jié)果 1996813.2病理剖檢結(jié)果 20254074鴨坦布蘇病毒防治試驗(yàn) 21241024.1試驗(yàn)后產(chǎn)蛋變化結(jié)果 21251674.2致死率結(jié)果 21283494.3剖檢病理變化結(jié)果 22249605流行病學(xué)調(diào)查及田間應(yīng)用試驗(yàn) 24186935.1流調(diào)結(jié)果 24242495.2田間應(yīng)用結(jié)果 25219586結(jié)論與討論 2612630參考文獻(xiàn) 2824818致謝 32摘要鴨坦布蘇病毒病（DuckTembusuvirusdisease,DTMUVD）是由鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus,DTMUV）引起的一種以蛋鴨產(chǎn)蛋大幅下降為主要特征的急性、烈性傳染病。自2010年4月起，鴨坦布蘇病毒病（DTMUVD）在我國部分地區(qū)相繼暴發(fā)，在江西、安徽、河南、福建、廣東、河北、山東、江蘇、浙江、廣西等地部分鴨場(chǎng)均有過報(bào)道，該病病程約為1～2個(gè)月，會(huì)引起蛋鴨產(chǎn)蛋大幅下降，耐過的種鴨群可逐漸恢復(fù)產(chǎn)蛋，但淘汰率一般在10%～30%之間，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-6]。近些年以來，該病的發(fā)病率雖然出現(xiàn)降低趨勢(shì)，但是仍然存在高效防治措施不多、疫病暴發(fā)的原因尚未明確、動(dòng)物回歸的試驗(yàn)開展難度較大、疫病傳播的途徑不夠詳實(shí)等問題，為該病防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。本文旨在運(yùn)用我省自主分離純化的流行毒株進(jìn)行病毒復(fù)制試驗(yàn)及防治研究，確定我省蛋鴨減蛋癥致病原因，系統(tǒng)運(yùn)用中草藥制劑對(duì)當(dāng)前鴨坦布蘇病毒病防治效果進(jìn)行研究，確定最優(yōu)防治鴨坦布蘇病毒病的藥物組方，獲得藥效學(xué)和安全性分析基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期為開展好該病的防控提供科學(xué)性的建議與指導(dǎo)。研究的具體結(jié)果包括：一、鴨坦布蘇病毒病病原學(xué)、生物學(xué)特性研究1.通過病毒復(fù)制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制鴨坦布蘇病毒病，經(jīng)病毒分離、基因序列測(cè)定分析表明，其病原為黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇病；鴨坦布蘇病毒病不僅具有致病性，且是獨(dú)立的病毒種類，具有可復(fù)制性，且在感染機(jī)體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。2.通過鴨坦布蘇病毒病傳播實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明鴨坦布蘇病毒病不僅具有致病性，且能夠通過混群接觸感染、空氣傳播等方式進(jìn)行傳播，在日常生產(chǎn)過程中對(duì)患病鴨群應(yīng)盡早實(shí)行較好的隔離措施等方式，才能阻止疫病的傳播。二、鴨坦布蘇病毒病臨床研究3.通過鴨坦布蘇病毒過預(yù)防用藥與攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明本試驗(yàn)所選用F疫苗和中草藥1組、2組配方均能很好地控制鴨坦布蘇病毒對(duì)鴨群產(chǎn)蛋的危害，能夠顯著地增強(qiáng)鴨群抵抗力，減輕卵巢的損傷，縮短恢復(fù)產(chǎn)蛋的時(shí)間；但是中草藥1組配方在治療時(shí)沒能很好的控制蛋鴨死亡，鴨群死亡率為3.33%。疫苗是預(yù)防該病發(fā)生與防控的較好選擇，中草藥在預(yù)防該病防控與治療中有一定效果，但用法、用量及生產(chǎn)效益比等仍需進(jìn)一步深入研究。關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒病，中草藥，生物學(xué)特性，疫病傳播，疫病防控AbstractDucktembusuvirusdisease(DTMUVD)isanacuteandstronginfectiousdiseasecausedbyDuckTembusuvirus(DTMUV).SinceApril2010,templeSueducktembusuvirusdisease(DTMUVD)outbreaksinpartsofourcountryandinjiangxi,anhui,henan,fujian,guangdong,hebei,shandong,jiangsu,zhejiang,guangxiandotherplacesofYaChangwerereported,andthediseasecourseofabout1~2months,canleadtoasignificantdeclineineggproductionpathogenies,resistanttothekindsofduckscangraduallyrestoretheeggs,butselective,generallybetween10%~30%,suppliesseriescausedseriouseconomiclosses[1-6].Inrecentyears,althoughtheincidenceofthediseaseappearedtoreducethetrend,buttherearestillfeweffectivepreventionandcontrolmeasures,thecauseofthediseaseoutbreakisnotyetclear,animalregressiontestisdifficult,thespreadoftheepidemicapproachessuchproblemsasinsufficient,broughtahugechallengeforthediseasecontrolandprevention.Thepurposeofthispaperistouseourprovinceautonomouspurificationofpandemicstrainforpreventionandcontrolofviralreplicationtestandresearch,determinethepathogenieseggdiseasecausesreductioninourprovince,thesystemuseofChineseherbalmedicinepreparationforthecurrentducktempleSuevirusdiseasepreventionandcontroleffectarestudied,determiningtheoptimaldrugpreventionandcontrolofducktempleSuevirusdiseasecharacteristics,basisofpharmacodynamicsandsafetyanalysisdata,inordertocarryoutwellthepreventionandcontrolofthediseasetoprovidescientificadviceandguidance.Specificresultsofthestudyinclude:1.Studyontheetiologyandbiologicalcharacteristicsofducktambusuvirusdisease.1.ThroughtheviralreplicationexperimentresultsshowthattheexperimentsuccessfullycopiedducktempleSuevirusdisease,afterthevirusseparation,determinationofgenesequenceanalysisshowedthatthepathogenofyellowvirusflavivirusgenustempleSuedisease;Itisnotonlypathogenic,butalsoindependentvirusspecies,whichisreproducibleandcanbestableintheinfectedorganism.2.ThroughthetempleSueduckviraldiseasetransmissionexperiment,theresultsshowthattheducktempleSuenotonlyhasthepathogenicvirusdisease,infection,andcanbemixedgroupofcontactintheformofairandspread,indailyproductionprocessforsickducksgoodisolationmeasuresshallcomeintoforceassoonaspossible,topreventthespreadofthedisease.Ii.Clinicalstudyofducktembusuvirusdisease.3.ThroughtheducktempleSueviruspreventiondrugandpoisonattackexperiment,theresultsprovethatthisexperimentchoosesFvaccineandChineseherbalmedicineformula1group,2groupwerewellcontrolledducktempleSuevirusduckstotheharmofeggproduction,cansignificantlyenhanceducksresistance,reduceovarianlesions,shortentherecoverytimeofegg;However,theformulaof1groupofChineseherbalmedicinefailedtocontrolthedeathoftheduck,andthedeathratewas3.33%.Vaccineisagoodchoiceforpreventionofthediseaseoccurrenceandpreventionandcontrol,Chineseherbalmedicineinthepreventionofthediseasecontrolandpreventionandtreatmenthasacertaineffect,buttheusage,dosageandtheproductionefficiencyratiostillneedsfurtherresearch.Keywords:ducktembusuvirusdisease,Chineseherbalmedicine,biologicalcharacteristics,epidemicdiseasetransmission,epidemicpreventionandcontrol.縮略詞表AbbreviationsTable英文縮寫英文全稱中文名稱minhSMLbpkDaELISAMinuteHourSecondMilliliterBasepairKilodaltonEnzyme-linkedimMunosorbentassay分鐘小時(shí)秒毫升堿基對(duì)千道爾頓酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)DTMUVDuckTembusuvirus鴨坦布蘇病毒IHCImmuno-Histochemistry免疫組織化學(xué)DTMUVDDuckTembusuvirusdisease鴨坦布蘇病毒病第一章綜述1鴨坦布蘇病毒病鴨坦布蘇病毒?。―uckTembusuvirusdisease,DTMUVD）是由鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus,DTMUV）引起的一種急性、烈性傳染病，以蛋鴨產(chǎn)蛋大幅下降為主要特征的。該病的流行特點(diǎn)表現(xiàn)為發(fā)病急、傳播速度快、發(fā)病率高等，會(huì)導(dǎo)致蛋鴨產(chǎn)蛋迅速下降甚至停產(chǎn)。發(fā)病前期主要表現(xiàn)為持續(xù)高熱，發(fā)病鴨群后期會(huì)出現(xiàn)一定比例的神經(jīng)癥狀，臨床表現(xiàn)為癱瘓、翻滾、站立不穩(wěn)及共濟(jì)失調(diào)。該病發(fā)病率可高達(dá)100%，但病死率較低，約為5～15％[1-6]。2病原學(xué)2.1生物學(xué)分類在分類學(xué)上，鴨坦布蘇病毒(DTMUV)歸屬于黃病毒科（Flaviviridae）的黃病毒屬（Flavivirus）中恩塔亞病毒群（Ntayavirusgroup）的坦布蘇病毒（Tembusuvirus）[7-8]。2.2形態(tài)結(jié)構(gòu)及理化培養(yǎng)特性鴨坦布蘇病毒（DTMUV）具有典型的黃病毒形態(tài)特征，病毒粒子呈現(xiàn)球形狀，表面有纖突和囊膜，直徑約為50nm。該病毒不耐熱，對(duì)乙醚和氯仿較為敏感[9]；該病毒不具備血凝活性，無法凝集雞、鴨、鵝、鶴、人、鼠、豬、兔等的紅細(xì)胞。鴨坦布該蘇病毒（DTMUV）增殖載體較多，在鴨胚、雞胚、Vero細(xì)胞和鴨胚成纖維細(xì)胞中均可以增殖，主要在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)復(fù)制[10]。鴨坦布該蘇病毒經(jīng)尿囊腔接種鴨胚3～5d后死亡，表現(xiàn)為絨毛尿囊膜增厚、水腫，胚體水腫、出血，表現(xiàn)為折光性增強(qiáng)，細(xì)胞變圓及融合，最終崩解死亡[11-13]。2.3基因結(jié)構(gòu)鴨坦布蘇病毒（DTMUV）具有黃病毒典型的基因組特征，是單股正鏈的RNA病毒，有衣殼。病毒基因組全長10,990nt，基因組順序?yàn)?'-UTR-C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5-UTR-3'。開放閱讀框?yàn)?0278nt，5'端及3'端的非編碼區(qū)長度分別為94nt和618nt[28-32]。外膜蛋白E上連續(xù)7個(gè)氨基酸的抗原區(qū)域主要集中在20-400位氨基酸，分別為：E25-33，E52-74，E79-88，E118-127，E148-161，E166-174，E178-186，E215-230，E243-252，E261-270，E285-292，E313-319，E351-357，E388-398。在E蛋白的103-105位和154-156位存在兩個(gè)糖基化位點(diǎn)（分別為NGC和NYS）[34-43]。3鴨坦布蘇病毒病的主要流行病學(xué)特征黃病毒屬大多數(shù)病毒危害較大，是一種可引起腦炎、脊髓炎、明顯的神經(jīng)癥狀的人畜共患、自然疫源性疾病的病毒，比如登革熱病毒、腦炎病毒、西尼羅病毒、黃熱病病毒等[9,33]。鴨坦布蘇病毒（DTMUV）也不例外，站立不穩(wěn)，臥地不起等神經(jīng)癥狀在鴨感染后該病毒都均有表現(xiàn)，但除此之外，該病毒與其他黃病毒屬病毒不同的是地方還表現(xiàn)于該病毒可致蛋鴨卵巢病變，從而導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降[14-20]。DTMUV幾乎可感染所有品種的鴨，尤其是對(duì)麻鴨的致病力最強(qiáng)，易感染群主要以產(chǎn)蛋鴨群為主，現(xiàn)也有在雞]、種鵝]和野鴨體內(nèi)也分離到該病毒的報(bào)道，可見其致病范圍之廣[21-29]。本病的流行病學(xué)的確切研究目前尚未看見報(bào)道，但從臨床角度來看，如果鴨舍中一欄鴨發(fā)病后，疫病擴(kuò)展到整棟鴨舍時(shí)間只需要1-2天內(nèi)，同一地區(qū)的其他鴨場(chǎng)一周之內(nèi)即可蔓延到達(dá)[13]，通過開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證，與病鴨同居可感染發(fā)病，由此推斷出，水平傳播為該病毒的主要傳播方式，尤其是經(jīng)過呼吸道的傳播，動(dòng)物的采食及飲水也有可能傳播該病[6,14]。因?yàn)辄S病毒屬大部分成員的傳播方式為蚊蟲傳播，所以DTMUV經(jīng)蟲媒傳播的可能性也存在。但根據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在北方地區(qū)在秋冬季節(jié)，蚊蟲活動(dòng)相對(duì)較少，但仍然有DTMUVD大面積的流行的情況，而且白蛉和蚊蟲的飛行距離較為有限，這與該疫情可以在短時(shí)間內(nèi)大范圍暴發(fā)的情況不大相符。目前尚無蚊子體內(nèi)病毒的分離和動(dòng)物回歸試驗(yàn)報(bào)道，且病毒傳播期間的溫度變化與其他節(jié)肢動(dòng)物傳播的其他黃病毒的發(fā)病時(shí)間也不一致，所以目前該病毒不一定是以節(jié)肢動(dòng)物為主要傳播媒介，一些鳥類也有可能是傳播媒介[9,15]。趙冬敏等[16]發(fā)現(xiàn)該病毒在種鵝中可通過鵝胚傳到下一代，說明該病毒可經(jīng)垂直傳播。4江西省蛋鴨場(chǎng)鴨坦布蘇病毒病流行概況在上世紀(jì)90年代，就有DTMUVD發(fā)生的報(bào)道，1997年，一種疑似黃病毒的有囊膜病毒被溫立斌等[17]從石家莊、邢臺(tái)等地出現(xiàn)產(chǎn)蛋下降、神經(jīng)癥狀的康貝爾鴨子中分離到，初步命名為“鴨病毒性腦炎”。從2010年開始，僅僅幾個(gè)月的時(shí)間，該病就在我國突然大規(guī)模爆發(fā)，席卷了我國絕大多數(shù)養(yǎng)鴨地區(qū)。隨后，相繼報(bào)道了種鴨和蛋鴨產(chǎn)蛋下降的病例，并從病例中分離到一種黃病毒。從發(fā)病種鴨中分離出了一種新型黃病毒，命名為BYD病毒。起初，該病有多種命名，鴨病毒性腦炎、鴨出血性卵巢炎、鴨黃病毒感染、如鴨產(chǎn)蛋下降綜合癥、鴨坦布蘇病毒感染等均被使用過。經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致鴨群發(fā)病的這種黃病毒在進(jìn)化關(guān)系上，與1955年從馬來西亞庫蚊中分離到的坦布蘇病毒非常相近[19]。因此，該病名稱于2011年中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)第一屆水禽疫病防控研討會(huì)將統(tǒng)一，命名為“鴨坦布蘇病毒病”。2010年，DTMUVD被報(bào)道傳入江西省，給江西省養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。自2015年9月份以來，江西省大多數(shù)蛋鴨養(yǎng)殖集中區(qū)相繼出現(xiàn)產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋率突然大幅下降的情況，該疫病在樂平市、鄱陽縣、弋陽縣、新建區(qū)、豐城市、宜豐縣等地均有爆發(fā)。通過對(duì)發(fā)病群體的臨床癥狀、剖檢觀察、病毒分離、基因測(cè)序和動(dòng)物回歸試驗(yàn)等技術(shù)手段，確定了該病的致病原因是DTMUV[19]。2016年3～5月，筆者對(duì)江西省蛋鴨養(yǎng)殖密集區(qū)進(jìn)行了大量調(diào)查，先后到九江、吉安、南昌、鷹潭、景德鎮(zhèn)等5個(gè)地市的20個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（其中包括了3個(gè)發(fā)病場(chǎng)），共采集血清和棉拭子樣品524份，對(duì)采集的樣品進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。通過實(shí)地調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，結(jié)果顯示鴨坦布蘇病毒感染率較高，鴨坦布蘇病毒感染在3個(gè)發(fā)病場(chǎng)（其中包括1個(gè)鵝發(fā)病場(chǎng)）均被檢測(cè)出；20個(gè)被調(diào)查的養(yǎng)殖場(chǎng)中，有18個(gè)場(chǎng)檢測(cè)出DTMUV陽性，養(yǎng)殖場(chǎng)帶毒率高達(dá)90%。5鴨坦布蘇病毒診斷方法5.1臨床診斷產(chǎn)蛋鴨感染DTMUV的主要臨床表現(xiàn)為釆食量大幅下降，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)食欲廢絕現(xiàn)象，產(chǎn)蛋率亦隨之急劇下降，可由產(chǎn)蛋高峰期的90%～95%在短期內(nèi)下降至5%～10%。該病的發(fā)病率高達(dá)100%，而且感染后該病的死淘率達(dá)到了5%～15%，繼發(fā)感染時(shí)鴨群死淘率可達(dá)30%[40-44]。流行初期病鴨會(huì)出現(xiàn)體溫升高、排綠色稀糞的臨床癥狀，后期神經(jīng)癥狀表現(xiàn)更加明顯，會(huì)出現(xiàn)頭頸抽搐、共濟(jì)失調(diào)的情況，雙腿向后伸展，甚至癱瘓，嚴(yán)重病鴨會(huì)導(dǎo)致死亡。病鴨所產(chǎn)種蛋受精率會(huì)受到較大影響，受精率會(huì)降低10%左右。該病病程一般為1～1.5個(gè)月，可自行逐漸恢復(fù)[45]。體質(zhì)好的鴨群，尤其是剛開產(chǎn)或產(chǎn)蛋高峰期的鴨群，產(chǎn)蛋率一般可以恢復(fù)到發(fā)病前的產(chǎn)蛋水平。蛋鴨在感染該病后，恢復(fù)后期多數(shù)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)明顯的換羽過程。商品肉鴨和育成期的種鴨發(fā)病后臨床癥狀表現(xiàn)以神經(jīng)癥狀為主，表現(xiàn)站立不穩(wěn)、倒地不起、行走不穩(wěn)，發(fā)病期一般在20～40日齡，病鴨有飲欲和食欲，但多數(shù)會(huì)出現(xiàn)飲水、釆食困難的情況，因此病鴨容易因進(jìn)水進(jìn)食困難而衰竭死亡，死淘率為10%～30%[45-47]。5.2實(shí)驗(yàn)室診斷方法5.2.1病原檢測(cè)5.2.1.1電鏡法在實(shí)驗(yàn)室診斷方式中，一般可根據(jù)病毒本身具有的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和大小等不同的特征，利用電鏡技術(shù)進(jìn)行直觀、準(zhǔn)確地病毒鑒別，此診斷方法較為直觀。用DTMUV感染DF-1細(xì)胞72h后，2.5％戊二酵固定，制作超薄的病理切片，通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該病毒有球形、有囊膜、有纖突的病毒粒子，病毒粒子直徑大約50nm[47-50]。該方法雖然能直觀地觀察到病原體，但需要專業(yè)技術(shù)人員才能操作，操作步驟也比較繁瑣，且該檢測(cè)法對(duì)病毒量有較高的要求，所以不能用于快速診斷。5.2.1.2病毒分離病毒分離接種法經(jīng)常用于分離檢測(cè)活的病毒，是一種較為傳統(tǒng)且經(jīng)典的病毒檢測(cè)技術(shù)。感染DTMUV的病鴨適宜分離病毒的部位有卵泡膜、腦、脾臟、肝臟等病變組織，其中最易分離和檢測(cè)到病毒的是卵泡膜和卵巢中。DTMUV在鴨胚、雞胚、鴨胚成纖維細(xì)胞及Vero細(xì)胞中初次分離的成功率僅為20.6％，低于臨床樣品RT-PCR檢出率[46-52]。乳鼠腦內(nèi)接種法和細(xì)胞接種分離法是病毒分離常用的兩種方法，將病料研磨處理后，乳鼠腦內(nèi)接種一定數(shù)量的DTMUV，觀察散窩、弓背、震顫、抽搐、甚至死亡等情況是否會(huì)在乳鼠身上出現(xiàn)，以此來判斷其是否感染。同時(shí)，可以根據(jù)發(fā)病鼠數(shù)量測(cè)定病毒的滴度。細(xì)胞接種分離法，受限于有的黃病毒產(chǎn)生的細(xì)胞病變不明顯，難以區(qū)別和判斷，所以分離陽性率低。在實(shí)際操作中，接種分離法經(jīng)常免疫組織化學(xué)、免疫焚光、焚光定量RT-PCR等方法結(jié)使用，以此來相互印證，一般不單獨(dú)應(yīng)用。無論是乳鼠腦內(nèi)接種法還是細(xì)胞接種分離法，均有實(shí)驗(yàn)周期長，操作繁瑣等缺點(diǎn)，特別是當(dāng)結(jié)果為陰性時(shí)，需要進(jìn)行盲傳代，以排除由于病毒量少而導(dǎo)致假陰性結(jié)果的可能性[53-69]。5.2.2免疫組化方法免疫組織化學(xué)（Immuno-histochemistry,IHC）又稱免疫細(xì)胞化學(xué),簡稱免疫組化，IHC是組織化學(xué)的分支，其是在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來的。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)的目的，需要借助突光或細(xì)胞化學(xué)的手段，以抗體作為特異性染色的載體，將一些物質(zhì)標(biāo)記在抗體分子上，使抗原抗體復(fù)合物能夠在顯微鏡下直接觀察，其原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)。隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，傳統(tǒng)的病理學(xué)也發(fā)生了一場(chǎng)翻天覆地的革命，使得純形態(tài)的病理學(xué)逐漸發(fā)展成為了現(xiàn)代病理學(xué)，它包括了形態(tài)與免疫信號(hào)兩部分。對(duì)鴨群進(jìn)行人工鴨坦布蘇病毒攻毒后，取攻毒感染鴨的主要組織臟器，制作切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果在腎臟、腦、脾臟、肺臟等器官中均有黃色棕染顆粒，而明顯的陽性信號(hào)在對(duì)照組中沒有發(fā)現(xiàn)，這表明，鴨坦布蘇病毒存在于這些組織臟器中[20,21]。5.2.3間接免疫突光試驗(yàn)間接免疫突光試驗(yàn)是病毒感染快速診斷的一個(gè)重要手段，簡便、特異性強(qiáng)、非特異性的突光染色少是間接免疫突光試驗(yàn)的最大優(yōu)點(diǎn)。間接免疫突光試驗(yàn)利用的基本原理是將突光素與某些特異性抗體或抗原以共價(jià)鍵結(jié)合，但共價(jià)鍵的結(jié)合不影響該抗體的特異性，然后用此突光素標(biāo)記的抗體對(duì)標(biāo)本染色，只要標(biāo)本中有相應(yīng)的抗原，則突光標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，在紫外光或激