項(xiàng)目九高效液相色譜法2

項(xiàng)目九高效液相色譜法一.高效液相色譜法（HPLC）概念？

指以液體為流動(dòng)相的色譜技術(shù)法高壓泵化學(xué)鍵合固定相高靈敏用檢測(cè)器二.高效液相色譜法的特點(diǎn)？1、分離效能高2、選擇性高3、分析速度快4、檢測(cè)靈敏度高三、HPLC與GC的區(qū)別？三、HPLC與GC的區(qū)別1．分析對(duì)象的不同2．流動(dòng)相的區(qū)別3．操作條件的差別流程及主要部件

HPLC主要有高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和記錄儀組成儀器分析一高壓輸液系統(tǒng)1.貯液器溶劑使用前必須過(guò)濾脫氣2.高壓輸液泵泵有恒流泵和恒壓泵兩類往復(fù)式柱塞泵（恒流泵）電動(dòng)機(jī)偏心輪柱塞柱球形單向閥溶劑3.梯度洗提裝置梯度洗脫：分離過(guò)程中，通過(guò)改變流動(dòng)相組成來(lái)增加洗脫能力的一種方法通過(guò)梯度裝置可得兩種或三種、四種溶劑按一定比例混合進(jìn)行二元三元或四元梯度洗脫高壓梯度（內(nèi)梯度）：將溶劑用高壓泵增壓后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室，加以混合后送入色譜柱。低壓梯度（外梯度）：在常壓下預(yù)先按一定程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂斎肷V柱ABABCC儀器分析二進(jìn)樣系統(tǒng)1.注射器進(jìn)樣

1—10μL微量注射器，類似于氣相色譜進(jìn)樣針，只是其針頭為平頭。儀器分析3.高壓定量進(jìn)樣閥（六通閥）

儀器分析三分離系統(tǒng)

色譜柱為直型不銹鋼柱，內(nèi)徑4.6或2mm，柱長(zhǎng)15～30cm。四檢測(cè)系統(tǒng)專用型：紫外吸收檢測(cè)器（UVD紫外吸收檢測(cè)器五記錄系統(tǒng)色譜工作站第三節(jié)高效液相色譜法的分類及分離原理按固定相分類按分離機(jī)理分類液液色譜法LLC液固色譜法LSC分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法分子排阻色譜法化學(xué)鍵合色譜法親合色譜法膠束色譜法HPLC一液液分配色譜法

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）

基本原理：試樣溶于流動(dòng)相后，在色譜柱內(nèi)經(jīng)過(guò)兩相分界面進(jìn)入固定液中。由于試樣組分在固定相和流動(dòng)相中的溶解度存在差異，因而組分在兩者間進(jìn)行分配液一液分配色譜法與氣一液色譜法的比較

相似處：分離順序決定于分配系數(shù)的大小，K大的組分保留值大

不同處:

GC流動(dòng)相性質(zhì)對(duì)K影響不大，而LC中流動(dòng)相種類對(duì)K影響較大正相色譜——固定液極性>流動(dòng)相極性

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出峰;

適于分離極性組分

反相色譜——固定液極性<流動(dòng)相極性

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出峰;

適于分離非極性組分固定相：早期涂漬固定液，系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，固定液易流失，不實(shí)用，故較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面。C-18柱（反相柱）化學(xué)鍵合固定相：將具有官能團(tuán)的固定相鍵合到載體表面，構(gòu)成化學(xué)鍵合相化學(xué)鍵合色譜法：以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合色譜法硅膠表面十八烷基硅烷鍵合相ODS化學(xué)鍵合固定相特點(diǎn)

不易流失

熱穩(wěn)定性好

化學(xué)性能好

載樣量大

適于梯度洗脫應(yīng)用適用于極性較小的樣品分離?？梢苑蛛x同系物、復(fù)雜稠環(huán)芳烴以及藥物、激素、天然產(chǎn)物、農(nóng)藥殘留量的測(cè)定在高效液相色譜法作為分離方法中，有80%的物質(zhì)的分離依靠反相色譜來(lái)完成。在反相色譜中，C18是常用的填充載體，水是常用的流動(dòng)相弱組分，重要的是選擇流動(dòng)相的強(qiáng)組分，常用的強(qiáng)組分有甲醇、乙腈與四氫呋喃稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器應(yīng)用舉例二液固吸附色譜分離原理以固體吸附劑為固定相的液相色譜法。利用各組分在固定相上吸附能力的不同將它們分離吸附脫附再吸附再脫附

…分離過(guò)程是一個(gè)吸附－脫附的平衡過(guò)程液固吸附色譜法分離機(jī)理固定相

極性固定相：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等

非極性固定相：活性炭、聚合物小球等

較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑流動(dòng)相各種不同極性的一元或多元溶劑,常用的有甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等出柱順序強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱應(yīng)用中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)

檢測(cè)器：差示折光檢測(cè)器

可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析三凝膠色譜（尺寸排阻色譜）固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)分離原理：按分子尺寸大小差異進(jìn)行分離當(dāng)被測(cè)組分隨流動(dòng)相通過(guò)凝膠色譜柱時(shí):①

尺寸大于孔徑的組分分子不能滲入凝膠孔隙而被全部排斥，最先流出色譜柱②尺寸小于孔徑的分子則全部滲入凝膠孔隙，最后流出③尺寸中等分子部分滲入較大孔隙，而排斥較小孔隙。因此介于中間流出分離原理示意圖排阻色譜分離示意圖相對(duì)分子質(zhì)量差別大于10％的化合物才可以分離相對(duì)分子質(zhì)量V0ViA排斥B全滲透選擇滲透V0ViVt洗脫體積固定相三種:軟質(zhì)凝膠半硬質(zhì)凝膠硬質(zhì)凝膠流動(dòng)相：僅作為載體，不與試樣本身或填料有任何相互作用；且完全溶解試樣、在分離溫度下黏度低度，其沸點(diǎn)通常比柱溫高20~50℃，與檢測(cè)器匹配等應(yīng)用

主要用于高分子化合物的分子量及分子量分布測(cè)定和高分子雜質(zhì)測(cè)定

2005-10版藥典大量收載該法1.聚乙二醇400002.聚乙二醇100003.聚乙二醇30004.聚乙二醇10005.聚乙二醇四、離子交換色譜(IEC)基本原理：根據(jù)不同組分離子對(duì)固定離子基團(tuán)的親和力的差別而達(dá)到分離目的。組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-應(yīng)用主要用來(lái)分離離子或可離解的化合物，不僅應(yīng)用于無(wú)機(jī)離子的分離如稀土化合物。還用于有機(jī)物分離（分離氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等）離子交換色譜法油田水質(zhì)中的陰離子分析固定相：薄殼型陰離子交換樹(shù)脂(3×250mm)流動(dòng)相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1

Na2CO3第四節(jié)高效液相色譜

法的應(yīng)用(P244)第五節(jié)高效液相色譜分離方法的選擇一、選擇合適的液相色譜分離類型

了解分析對(duì)象要分析的組分的大致濃度干擾物質(zhì)試樣的性質(zhì)結(jié)構(gòu)分子量酸堿性溶解性二、選擇合適的分析條件色譜柱流動(dòng)相檢測(cè)器的種類及條件（波長(zhǎng)等）