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dldhierarch2013.06.22Lrp5/6在高血脂所致?lián)p傷時所扮演的角色的探究計劃01、用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠建立高脂損傷模型ApoE基因敲除小鼠模擬高血脂損傷模型的機理/ApoE基因的作用用何種指標或手段確認高血脂損傷模型的建立02、Lrp5/6在高脂損傷時表達水平的探索體外用Ox-LDL刺激huv-ec細胞,看膜上的Lrp5/Lrp6水平的表達取小鼠的血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng),重復OX-LDL刺激實驗03、Lrp5/6在高脂損傷時所起作用的探索取已建立好ApoE基因敲除小鼠高脂損傷模型的小鼠各臟器觀察Lrp5/6及βCatenin的表達水平的變化如Lrp5/6在其中扮演角色,則研究其內(nèi)在機制(何種通路等)體內(nèi)探索Lrp5/6在高血脂損傷時所扮演的角色ApoE(apolipoproteinE/載脂蛋白E)載脂蛋白是血漿脂蛋白(脂-蛋白復合物)中的蛋白部分。載脂蛋白是構(gòu)成血漿脂蛋白的蛋白質(zhì)組分,主要在肝臟(部分在小腸)合成,主要分類由A、B、C、D、E五類?;竟δ苁沁\載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu),某些載脂蛋白還有激活脂蛋白代謝酶、識別受體等功能。ApoE結(jié)構(gòu)及功能簡介血漿脂蛋白是哺乳動物血漿中的脂—蛋白復合物,能夠和脂類(甘油三酯、磷脂、膽固醇等)結(jié)合從而實現(xiàn)在血漿中運輸脂類(跨器官運輸)(1)脂—蛋白的結(jié)合機制脂蛋白中脂質(zhì)與蛋白質(zhì)之間沒有共價鍵結(jié)合,多數(shù)是通過脂質(zhì)的非極性部分與蛋白質(zhì)組分之間以疏水性相互作用而結(jié)合在一起。一般認為血漿脂蛋白都具有類似的結(jié)構(gòu),呈球狀,在顆粒表面是極性分子,如蛋白質(zhì)、磷脂,故具有親水性;非極性分子如甘油三酯、膽固醇酯則藏于其內(nèi)部。磷脂的極性部分可與蛋白質(zhì)結(jié)合,非極性部分可與其它脂類結(jié)合,作為連接蛋白質(zhì)和脂類的橋梁,使非水溶性的脂類固系在脂蛋白中。(2)脂蛋白的分類及功能dldhierarch脂蛋白的分類及功能:01、乳糜微粒(chylomicron,CM)——顆粒最大,密度最低約為500nm大小,脂類含量高達98%,蛋白質(zhì)含量少于2%,因此密度極低。主要功能為運輸外源性甘油三酯。02、極低密度脂蛋白(verylowdensitylipoprotein,VLDL)VLDL中脂類占85%-90%,其中甘油三酯(TG)占55%,其密度也很低;VLDL的功能為運輸內(nèi)源性甘油三酯(肝臟中由脂肪酸和葡萄糖合成)。03、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)04、高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)dldhierarch03、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)主要功能是把膽固醇(是攜帶膽固醇最多的脂蛋白)從肝臟運輸?shù)饺砀魈幖毎?,?jīng)代謝進行清除。(1)受體介導途徑清除(主要是Apo蛋白配體+LDL受體)——約2/3體內(nèi)2/3的LDL是通過受體介導途徑吸收入肝和肝外組織,經(jīng)代謝而清除的。在血管運輸過程中,當LDL,尤其是OX-LDL(氧化修飾的低密度脂蛋白)過量時,它攜帶的膽固醇便積存在動脈壁上,長期積累容易引起動脈硬化。因此LDL被稱為“壞的膽固醇”。(2)非受體通路(巨噬細胞吞噬LDL)——約1/3巨噬細胞與LDL結(jié)合,吸收LDL中的膽固醇,這樣膽固醇就留在細胞內(nèi),變成“泡沫”細胞。因此,LDL能夠進人的動脈壁細胞,并帶入膽固醇。所以LDL水平過高能夠?qū)е聞用}粥樣硬化的發(fā)生。dldhierarch04、高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)
顆粒最小密度最高的血漿脂蛋白,其直徑為7.5~10nm,密度為1.21g/cm3,含有6%膽固醇、13%膽固醇酯與50%蛋白質(zhì),其載脂蛋白大多為ApoA(載脂蛋白A)。生理功能和意義主要功能為將內(nèi)源性膽固醇從組織向肝臟進行逆向轉(zhuǎn)運,在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽汁酸或直接轉(zhuǎn)化為膽汁從腸道中排出。降低了膽固醇在血管中沉積的風險。因此HDL能夠抵抗血管粥樣硬化的形成,是“好的膽固醇”被譽為“血管清道夫”。同時HDL具有逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能不良、刺激PIG2(前列環(huán)素,具有擴血管和抗血栓形成作用)生成,抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡、減少血小板聚集、抑制LDL氧化(即減少OX-LDL生成)等許多功能。1985年諾貝爾生理學獎成果——膽固醇代謝調(diào)節(jié)機制美國德克薩斯大學的Michael·S·Brown和Joseph·L·GoldsteindldhierarchApoE蛋白結(jié)構(gòu)及功能簡介ApoE主要由肝臟合成,近年來發(fā)現(xiàn)腦,腎,骨骼,腎上腺及巨噬細胞也能合成。ApoE生理功能:①是LDL受體的配體,也是肝細胞CM殘粒受體的配體,它與脂蛋白代謝有密切相關(guān)性;②ApoE具有多態(tài)性,多態(tài)性是決定個體血脂水平與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān);③參與激活水解脂肪的酶類,參與免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)組織的再生。ApoE基因敲除小鼠構(gòu)建AS(動脈粥樣硬化)的模型的機制ApoE基因敲除小鼠構(gòu)建AS(動脈粥樣硬化)的模型的機制ApoE蛋白能夠是通過不同機制對動脈粥樣硬化起到一定的抑制作用。模擬機理ApoE是構(gòu)成CM
(乳糜微粒)、VLDL
(極低密度脂蛋白)及HDL
(高密度脂蛋白)的重要成分,它作為一種清除配體,參與受體介導的載脂蛋白清理過程,主要介導血漿脂蛋白特別是乳糜微粒和低密度脂蛋白的代謝與清除,在脂蛋白代謝巾發(fā)揮重要作用。因此當ApoE基因敲除后,可導致TC(總膽固醇)、LDL-C(低密度脂蛋白膽固醇)升高,誘發(fā)動脈內(nèi)膜損傷及脂質(zhì)沉積,最終發(fā)展成動脈粥樣硬化。
SpontaneoushypercholesterolemiaandarteriallesionsinmicelackingapolipoproteinE.Science,1992
Oct16;258(5081):468-71.模型優(yōu)點以往的As動物模型大多以高脂肪、高膽固醇膳食負荷喂養(yǎng),其As病理變化機制與人類As的形成有較大的差異。dldhierarch高血脂損傷模型建立確認的指標脂質(zhì)代謝異常與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展具有密切的關(guān)系。載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠可出現(xiàn)高脂血癥并形成動脈粥樣硬化,因而成為理想的動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)模型。SeverehypercholesterolernicaandatherosclerosisinapolipoproteinE-deficientmicecreatedbyhomoIogousrecombinationinEScells.Cell,
Volume71,Issue2,343-353,16October1992血脂生化分析指標血管超聲檢查病理切片指標血管內(nèi)皮細胞凋亡指標CT血管造影檢查dldhierarch總膽固醇(TC)甘油三酯(TG)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)血脂生化分析指標dldhierarchApoE-/-小鼠As病變通常是從主動脈根部、升主動脈開始形成,并在冠狀動脈、主動脈弓及其分叉處、頸總動脈及其分叉處、胸主動脈、腹主動脈、雙腎動脈等處均可形成斑塊,與人類As好發(fā)處相近。由于ApoE-/-小鼠As病變是從主動脈根部開始發(fā)生,為了觀測早期As的病變特征,可以采用UBM(超聲生物顯微鏡,ultrasoundbiomicroscopy)成像觀察ApoE-/-小鼠主動脈根部的形態(tài)學和IMT(主動脈后壁內(nèi)-中膜厚度)變化。Non-invasivereal-timeimagingofatherosclerosisinmiceusingultrasoundbiomicroscopy.Atherosclerosis.2007.190(2)
Ultrasoundbiomicroscopynoninvasiveassessmentofatherosclerosisinapolipoprotein-Eknockoutmice.UltrasoundinMed&Bio,2011dldhierarch血管超聲檢查dldhierarch用Ox-LDL刺激huv-ec細胞和體外培養(yǎng)的小鼠血管內(nèi)皮細胞以探究細胞膜上的Lrp5/6的表達水平huv-ec
cell(人臍靜脈內(nèi)皮細胞,HumanUmbilicalVeinEndothelialCells)HUV-EC-C(ATCC?
CRL-1730?)OX-LDL(Oxidizedlow-densitylipoprotein,氧化型低密度脂蛋白)OX-LDL喜好在血管內(nèi)皮受損部位即血管斑塊部位聚集,它能夠誘導血管壁內(nèi)巨噬細胞泡沫化,并在其局部引發(fā)一連串的多種細胞參與的炎癥反應(yīng),從而導致不同程度的動脈粥樣硬化。dldhierarchApoE基因敲除小鼠模型的建立及對照組的設(shè)置看時間梯度結(jié)合高血脂損傷的諸項指標觀察Lrp5/6表達水平的變化及差異dldhierarchLrp5/6在高脂損傷時所扮演角色的的探索用Lrp5/
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