第二章 基因工程制藥

第二章基因工程制藥

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系概念：基因工程藥物指利用基因工程技術(shù)研制和生產(chǎn)的藥物，包括重組蛋白多肽藥物、反義核酸藥物、DNA藥物、基因工程抗體等。第一節(jié)概述蛋白細(xì)胞因子藥物蛋白類激素溶血栓藥物治療用酶可溶性受體和黏附分子其它核酸DNA藥物反義RNA藥物RNAi藥物核酶20世紀(jì)70年代基因工程誕生最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域。1982年第一個(gè)基因工程產(chǎn)品--人胰島素在美國(guó)問(wèn)世。優(yōu)點(diǎn):大量生產(chǎn)、應(yīng)用臨床、深入研究、擴(kuò)大應(yīng)用、改造不足。胰島素人生長(zhǎng)激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物1982第一個(gè)基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國(guó)轉(zhuǎn)基因魚1993基因工程西紅柿在美國(guó)上市1997英國(guó)羅斯林研究所多莉羊1999.9中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃.負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的1%2000.6.26科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2001.2.11公布人類基因組基本信息基因工程大事記基因工程藥物研究簡(jiǎn)史1976年第一家利用重組技術(shù)研制新藥的公司—-Genetech1982年美英批準(zhǔn)第一個(gè)基因工程藥物——重組人胰島素[美]Lilly公司受讓獲得生產(chǎn)權(quán)至2004年底FDA共批準(zhǔn)79種大腸桿菌（18種）2000－2004只批了4種酵母（8種）2000－2004只批了2種哺乳動(dòng)物細(xì)胞（53種）2000－2004批了22種基因工程藥物的幾次發(fā)展重組蛋白多肽類單克隆抗體藥物基因組藥物MPIF－1KGF2VEGF2在人類基因組計(jì)劃與后基因組基礎(chǔ)上開發(fā)新藥是研發(fā)新型基因工程藥物的新模式藥物靶標(biāo)：現(xiàn)有500藥靶，其中45％為膜受體、28％是酶、其余為激素、離子通道、核受體和DNA，7％未知.HGP增加藥靶數(shù)量：3－4萬(wàn)基因，可能藥靶3000以上；探尋具治療作用的新基因備用基因工程藥物我國(guó)基因工程藥物研究和開發(fā)：起步較晚，基礎(chǔ)較差。α1b型基因工程干擾素是由我國(guó)自行研制開發(fā)的具有國(guó)際先進(jìn)水平的生物高科技成果，于1997年

通過(guò)Ⅲ

期臨床，并獲得國(guó)家一類新藥證書，成為“863”計(jì)劃生物技術(shù)領(lǐng)域第一個(gè)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的基因工程藥物。目前我國(guó)已批準(zhǔn)12種基因工程藥物和疫苗上市，在研究開發(fā)中的也有10余種?；蚬こ趟幬镏扑幍闹饕绦?⒈目的基因的克隆，⒉構(gòu)建DAN重組體，⒊DAN重組體轉(zhuǎn)入宿主菌，⒋構(gòu)建工程菌，⒌工程菌發(fā)酵，⒍表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，⒎產(chǎn)品的檢驗(yàn)等包含三個(gè)步驟獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞）培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過(guò)濾半成品檢定成品檢定包裝基因工程基本過(guò)程：建立基因高效表達(dá)系統(tǒng)

微生物表達(dá)系統(tǒng)1動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2動(dòng)物活體表達(dá)系統(tǒng)3植物表達(dá)系統(tǒng)41、上游階段：首先獲得目的基因，然后用限制性內(nèi)切酶和連接酶將其插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)大腸桿菌或其它宿主菌（細(xì)胞），以便大量復(fù)制目的基因。選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)功能，其次要考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。在實(shí)驗(yàn)室完成。：“切、接、轉(zhuǎn)、增、檢”五步）2、下游階段：將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，它主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)大的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度純品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等。（1）從供體細(xì)胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開（簡(jiǎn)稱“切”）；（2）用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片斷接到載體上，形成DNA重組分子（簡(jiǎn)稱“接”）；（3）借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中（簡(jiǎn)稱“轉(zhuǎn)”）；（4）短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子或使其整合到受體細(xì)胞的基因組中（簡(jiǎn)稱“增”）；（5）篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞（簡(jiǎn)稱“檢”）；基因工程關(guān)鍵要素工具酶與載體系統(tǒng)目的基因的獲得基因的重組與轉(zhuǎn)移克隆基因?qū)胨拗骷?xì)胞表達(dá)第二節(jié)基因工程的工具酶與載體一、工具酶常用的工具酶：（一）限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionenzyme）是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。關(guān)于限制性內(nèi)切酶來(lái)源：性質(zhì)：功能：自我保護(hù)，細(xì)菌的限制與修飾系統(tǒng)。1、限制性內(nèi)切酶的來(lái)源與性質(zhì)寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來(lái)的DNA，并能使后者降解掉。R/M體系：是由兩種酶活性配合完成的：一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶

R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。

※EcoB的核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。TGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶TGAN8TGCTACTN8ACGACH3CH3CH3CH3甲基化酶噬菌體來(lái)源序列宿主來(lái)源序列※限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。※由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶?！?/p>

1968年，阿爾伯證明了一種特別的限制酶的存在，它只分裂那些含有為噬菌體所特有的某種序列的核苷酸；※這一工作經(jīng)過(guò)內(nèi)森斯和史密斯的發(fā)展，從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII?！拗菩院怂崦傅陌l(fā)現(xiàn)，為基因結(jié)構(gòu)、DNA堿基順序分析和基因工程的研究開辟了途徑。2023/2/328阿爾伯WernerArber瑞士巴塞爾Biozentrum大學(xué)史密斯HamiltonO.Smith美國(guó)霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)森斯DanielNathans美國(guó)霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院W.阿爾伯，H.史密斯和D.內(nèi)森斯三人共同獲得了1978年諾貝爾獎(jiǎng)2、限制性內(nèi)切酶的功能限制功能：外源DNA的切割功能修飾功能：自身DNA的甲基化3、限制性核酸內(nèi)切酶的命名若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。

4、限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位50ul反應(yīng)體系中，含1ug底物DNA，于最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫1小時(shí)，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個(gè)酶單位，用U表示。限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。5、緩沖液(Buffer)是影響限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。緩沖液的化學(xué)組成:MgCl2

、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；6、溫度不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37℃，少數(shù)要求40-65℃。7、限制性核酸內(nèi)切酶的分類根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶II類限制性內(nèi)切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來(lái)。分離的第一個(gè)酶是HindⅡ基本特點(diǎn)：Ⅰ.識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（通常是由4～8個(gè)核苷酸組成的回文序列）。與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。2023/2/337Ⅱ.切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)處切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。粘性末端：含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端分兩種類型：①3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）；②5’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）粘性末端的意義:①連接便利與平齊末端相比，粘性末端的連接效率更高。②5’末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。凸出的3’末端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。同裂酶（Isoschizomers)識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。Ⅰ.完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。如HindⅢ和HsuIⅡ.不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和Sma同尾酶（Isocaudamers)8、限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式1986年J.A.McClarin等通過(guò)X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。完全消化內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開局部消化只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開9、限制酶酶切反應(yīng)的終止大多數(shù)酶可用65℃溫育5min失活。10、幾種常用限制酶識(shí)別位點(diǎn)11、限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用重組DNA前的切割構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究（二）DNA連接酶（ligase）能夠催化DNA中相鄰的3’-羥基和5’-磷酸基末端之間形成3′，5′-磷酸二酯鍵。T4DNA連接酶可連接帶匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的雙鏈DNA分子相互連接。大腸桿菌DNA連接酶只能連接帶匹配粘性末端的DNA分子(a)分子間連接連接條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+連接反應(yīng)的機(jī)理連接反應(yīng)的溫度連接酶反應(yīng)的最佳溫度37℃。但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。所以一般采用14～16℃。影響連接反應(yīng)的因素插入片段與載體的濃度比例：10~20倍。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。2.反應(yīng)溫度：一般14~16℃（三）DNA聚合酶把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli)

Klenow片段(E.coli)T４DNA聚合酶(T４Phage感染的E.coli)

T７DNA聚合酶(T７Phage感染的E.coli)修飾的T７DNA聚合酶(測(cè)序酶)TaqDNA聚合酶(耐熱)DNA末端轉(zhuǎn)移酶(不依賴DNA)

反轉(zhuǎn)錄酶(依賴RNA)聚合酶主要區(qū)別持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來(lái)。大多數(shù)DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來(lái)。常用DNA聚合酶的特性比較化學(xué)發(fā)光底物：HRPO和AP的顯色反應(yīng)底物克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。柯斯質(zhì)粒(cosmid)一種人工構(gòu)建的克隆載體，包含了λ噬菌體的cos基因。柯斯質(zhì)粒能被包裝到λ噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細(xì)菌的DNA片段（超過(guò)45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大。其他酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）人基因組十分龐大，約含3×109bp，建立和篩選人的基因組文庫(kù)，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應(yīng)運(yùn)而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(diǎn)(centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長(zhǎng)度達(dá)200-500kb的外源DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計(jì)劃的重要工具。正常酵母人工染色體含有：四膜蟲端粒（tel)酵母自主復(fù)制序列（ARS)酵母著絲點(diǎn)(CEN)酵母的選擇標(biāo)記(TRP1、URA3)YAC載體第三節(jié)基因工程目的基因的制備與重組一、目的基因制備方法1.化學(xué)合成法2.基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)1.化學(xué)合成法獲取目的基因要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。一般用于小分子基因的合成2.從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因基因組DNA文庫(kù)（genomicDNAlibrary）將某一基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱為G文庫(kù)3.從cDNA文庫(kù)獲取目的基因(逆轉(zhuǎn)錄法)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)：以某種細(xì)胞的全部mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA（cDNA）再?gòu)?fù)制成雙鏈cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(kù)(cDNAlibrary)。C-文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。獲取途徑：mRNApurificationa.細(xì)胞內(nèi)RNA的組成和含量:DNA：95%核內(nèi)，5％細(xì)胞器RNA：75％細(xì)胞質(zhì)，10%核內(nèi)，15%細(xì)胞器rRNA80-85%；tRNA10-15%；mRNA1-5%b.真核細(xì)胞mRNA的特點(diǎn)及分離純化方法。3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)纖維素柱純化Poly(A)mRNA流程圖Oligo(dT)纖維素Poly(A)--Oligo(dT)cDNA第一鏈的合成：一次好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使oligo(dT)選出的mRNA有5—30%被拷貝。cDNA第二鏈的合成：cDNA第二鏈合成的方法有四種，自身引導(dǎo)合成法，置換合成法，引導(dǎo)合成法和引物－銜接合成法cDNAcloning：expressionvectorpUC將重組體導(dǎo)入hostcellcDNAlibraryidentification目的cDNA克隆的分離和鑒定（限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測(cè)序、確定基因的轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)等。）4.利用PCR合成：如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因。但此法可能會(huì)造成克隆的目的基因堿基序列的改變。二、目的基因的重組DNA重組技術(shù)，即含有目的基因的DNA片段和載體DNA連接技術(shù)。本質(zhì)：DNA片段之間的體外連接核心步驟：涉及限制酶，連接酶等酶促反應(yīng)過(guò)程。載體的選擇質(zhì)粒：可用于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制，有的亦可用于動(dòng)、植物細(xì)胞。噬菌體：經(jīng)構(gòu)建后，常用于細(xì)菌細(xì)胞。病毒：常用作動(dòng)物細(xì)胞基因工程的載體。DNA分子的體外切割與連接目的基因連接到載體上去，要經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)，需要幾種工具酶，這中間最為重要的是兩大類酶：①DNA限制性內(nèi)切酶：把載體DNA片段切開。②DNA連接酶：用于連接載體和外源DNA片段。此外，在構(gòu)建DNA重組分子中使用的工具酶還有：DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA修飾酶、RNA修飾酶、核酸外切酶、堿性磷酸酶等。DNA分子的體外連接

粘性末端連接：連接效率高具有匹配的酶切末端平端連接：連接效率低人工接頭(linker)法同聚物接尾法以相同的限制性內(nèi)切酶酶切，產(chǎn)生匹配的末端三、將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞重組體DNA分子只有導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，才能進(jìn)行大量地復(fù)制，擴(kuò)增和表達(dá)。感受態(tài)細(xì)胞的制備連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化基因工程菌TOP10，DH5α，BL21，JM109轉(zhuǎn)化(transformation)制備感受態(tài)細(xì)胞：冷的氯化鈣處理，細(xì)胞處于最適攝取和容忍外來(lái)DNA的生理狀態(tài)感染(infection)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過(guò)程轉(zhuǎn)染(transfection)：真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程。四、目的基因的篩選和鑒定(screening/selection)遺傳學(xué)方法插入滅活法(insertioninactivation)：抗藥性標(biāo)志選擇標(biāo)志補(bǔ)救：表達(dá)產(chǎn)物與營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)α-互補(bǔ)、藍(lán)白斑篩選免疫學(xué)方法：Westernblot、抗體雜交分子雜交：探針原位雜交PCR限制性酶切圖譜五、目的基因的表達(dá)克隆蛋白質(zhì)藥物基因的一個(gè)主要目的是為了高效的表達(dá)該基因，從而獲得大量的、市場(chǎng)原本難以獲得的藥物。原核表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；真核表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞：酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞。（一）原核表達(dá)體系原核表達(dá)載體必須具備的條件（1）載體能夠獨(dú)立的復(fù)制（2）具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記（3）具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子（4）具有阻遏子（5）有很強(qiáng)的終止子（6）有翻譯的起始信號(hào)常用的表達(dá)載體：（1）pBV220系統(tǒng)（2）pET系統(tǒng)

外源基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的必要條件(1).刪除內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)；(2).外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列控制下；(3).維持正確的開放閱讀框（ORF）(4).mRNA穩(wěn)定且可以有效轉(zhuǎn)譯，形成的蛋白質(zhì)不易被降解影響基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素：1.啟動(dòng)子：建立表達(dá)載體的時(shí)候，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子常見(jiàn)的原核強(qiáng)啟動(dòng)子：(1)Plac:受Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)，受IPTG的誘導(dǎo)；(2)Ptrp:取自大腸桿菌色氨酸操縱子；(3)Ptac:Lac啟動(dòng)子和trp啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子；(4)PL和PR:噬菌體早期左/右啟動(dòng)子，受λ噬菌體CI基因負(fù)調(diào)控，溫度誘導(dǎo)(5)T7啟動(dòng)子2.基因劑量:帶目的基因載體的拷貝數(shù)。3.核糖體結(jié)合位點(diǎn)(1)SD順序與16srRNA3’末端互補(bǔ)程度：UAAGGAGG的SD序列比AAGGA的SD序列能使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高36倍(2)ATG（AUG)—SD間的距離：5-13bp4.密碼子的選用不同生物甚至同種生物的不同蛋白質(zhì)的基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子的使用具有一定的選擇性。原核表達(dá)載體的類型：(1)融合型表達(dá)載體——表達(dá)出融合蛋白；(2)非融合型表達(dá)載體——表達(dá)出完整蛋白；(3)分泌型表達(dá)載體——表達(dá)產(chǎn)物可跨膜分泌到胞間隙。融合型表達(dá)載體非融合型表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體常見(jiàn)的表達(dá)受體菌株原核表達(dá)的宿主細(xì)胞（1）大腸桿菌：表達(dá)產(chǎn)物的形式和種類廣泛（細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)（包含體）、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，極少還可分泌到胞外表達(dá)）。大腸桿菌表達(dá)體系的不足

缺乏翻譯后加工機(jī)制，不能折疊和糖基化融合蛋白形成包涵體，復(fù)性后才有活性

很難表達(dá)大量的可溶性蛋白此外，由于翻譯常從甲硫氨酸的AUG密碼子開始，故目的蛋白質(zhì)的N端常多余一個(gè)甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應(yīng)。大腸桿菌會(huì)產(chǎn)生很難除去的內(nèi)毒素，還會(huì)產(chǎn)生蛋白酶而破壞目的蛋白質(zhì)。（2）枯草芽孢桿菌：分泌能力強(qiáng)，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包涵體。該菌也不能使蛋白質(zhì)糖基化，另外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解，因此，它的應(yīng)用也受到限制。（3）鏈霉菌：重要的工業(yè)微生物。特點(diǎn)是不致病、使用安全，分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，可做理想的受體菌。外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)鑒定（二）真核表達(dá)體系不同表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)表達(dá)及翻譯后修飾情況的比較真核基因表達(dá)外源基因的意義(一)生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品－有生物活性的蛋白質(zhì)，尤其是藥物。(二)研究基因功能，觀察目的基因－產(chǎn)物：1.對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)的影響：如細(xì)胞增殖、分化、基因表達(dá)及其他特殊功能等；2.活性結(jié)構(gòu)域：如突變目的基因－>導(dǎo)入細(xì)胞，可闡明表達(dá)產(chǎn)物關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)和關(guān)鍵點(diǎn)；3.結(jié)構(gòu)分析：如制備過(guò)量的目的蛋白用于結(jié)構(gòu)分析。典型的真核細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元件:(1)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(2)終止信號(hào)和加多聚腺苷酸化信號(hào)，(3)選擇標(biāo)記(4)幾個(gè)原核作用元件，如細(xì)菌抗生素選擇標(biāo)記(Ampr)和用于質(zhì)粒擴(kuò)增的復(fù)制子（具有原核作用元件才能作為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞之間的穿梭質(zhì)粒）等。真核表達(dá)元件：?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子—克隆位點(diǎn)—終止信號(hào)和加poly(A)信號(hào)真核表達(dá)的宿主細(xì)胞（1）酵母：繁殖迅速，可廉價(jià)的大規(guī)模培養(yǎng)，而且沒(méi)有毒性，基因工程操作與原核生物相似，表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到細(xì)胞外，簡(jiǎn)化了分離純化工藝。表達(dá)產(chǎn)物能糖基化。特別是某些在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)不良的真核基因，在酵母中表達(dá)良好。目前以釀酒酵母應(yīng)用最多。干擾素和乙肝表面抗原已獲成功。（2）絲狀真菌：很強(qiáng)的分泌能力；能正確進(jìn)行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如曲霉）被確認(rèn)是安全菌珠，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。（3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞：由于外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液成分完全由人控制，從而是產(chǎn)物純化變得容易。產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物。但動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)慢，生產(chǎn)率低，而且培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較稀。外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的基本方法近年來(lái)，基因?qū)敕椒ú粩喔倪M(jìn)，使得轉(zhuǎn)染效率逐漸接近100％，將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有2類。病毒感染（Virusinfection）：是一種將外源基因?qū)爰?xì)胞的天然方法。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（Transfection）：用非病毒的理化方法將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法稱轉(zhuǎn)染。外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的主要方式（一）按外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)間的長(zhǎng)短：（二）按外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)方式的不同：1.分泌表達(dá)2.非分泌表達(dá)3.融合表達(dá)4.非融合表達(dá)（三）克服外源基因?qū)λ拗骷?xì)胞的毒性建立可調(diào)控的誘導(dǎo)型表達(dá)載體，給一定濃度的誘導(dǎo)藥物，可避免外源基因產(chǎn)物的毒性，建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。如四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和蛻皮素(Pnasterone)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的鑒定和純化雖然從理論上講，各種微生物都可以用于基因表達(dá)，但由于克隆載體、DNA導(dǎo)入方法以及遺傳背景等方面的限制，目前使用最廣泛的宿主菌仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。藥物篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因）潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH）胸苷激酶（TK）反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。新霉素G418：細(xì)菌抗生素，干擾原核、真核生物蛋白質(zhì)合成

neo（APH）：磷酸轉(zhuǎn)移酶新霉素抗性基因(neo)能在真核細(xì)胞中表達(dá)并能使G418失活(neo基因編碼一個(gè)磷酸轉(zhuǎn)移酶),細(xì)胞可以生長(zhǎng).neo與目的基因連鎖,轉(zhuǎn)染Question?分析三大表達(dá)系統(tǒng)在基因工程制藥應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)？試統(tǒng)計(jì)分析FDA批準(zhǔn)的三種表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的全部藥物？第四節(jié)基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，又分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。分裂不穩(wěn)定是指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)

對(duì)菌體生長(zhǎng)的調(diào)控主要有兩種觀點(diǎn)：一種認(rèn)為能量的供應(yīng)決定了菌體的最大比生長(zhǎng)速率；另一種認(rèn)為是小分子前體和催化組分等等的限制決定了菌體的最大比生長(zhǎng)速率。菌體生長(zhǎng)與能量的關(guān)系當(dāng)菌體生長(zhǎng)所需能量大于菌體有氧代謝所能提供的能量時(shí)，菌體往往會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸。產(chǎn)生乙酸的機(jī)制還不完全清楚，一般認(rèn)為是由于呼吸鏈或三羧酸循環(huán)的供能不足，使部分乙酰輔酶A通過(guò)轉(zhuǎn)化為乙酸來(lái)供能。高濃度的乙酸能明顯抑制菌體的生長(zhǎng)。分批培養(yǎng)中選用不同的碳源、補(bǔ)料培養(yǎng)中控制補(bǔ)料速度、連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等培養(yǎng)方法，都能在一定范圍內(nèi)控制菌體的生長(zhǎng)，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用，以實(shí)現(xiàn)工程菌的高密度培養(yǎng)和提高重組產(chǎn)物的表達(dá)水平。實(shí)質(zhì)：控制菌體的糖酵解速度，使之低于三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的最大代謝能力，從而避免乙酰輔酶A的積累和乙酸的產(chǎn)生，以降低供能速度或前體供應(yīng)速度來(lái)降低蛋白合成和菌體生長(zhǎng)速度。菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系由于菌體中小分子前體量和催化結(jié)構(gòu)是有限的，因而生物大分子和合成處于亞飽和狀態(tài)，限制了菌體的比生長(zhǎng)速率?；虮磉_(dá)在各個(gè)水平的競(jìng)爭(zhēng)又是各個(gè)基因互相競(jìng)爭(zhēng)共同的前體和催化結(jié)構(gòu)的結(jié)果。由于基因工程菌質(zhì)粒的復(fù)制和外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯需要與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，從而加劇了這些成分的不足，因而在同樣的培養(yǎng)基中，工程菌的比生長(zhǎng)速率往往低于其宿主細(xì)胞，特別是工程菌誘導(dǎo)后，由于外源基因的大量表達(dá)，引起菌體比生長(zhǎng)速率下降，甚至生長(zhǎng)停滯。“嚴(yán)緊反應(yīng)”：當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí)，核糖體在密碼子上停留，合并稱為“魔點(diǎn)”的ppGpp的結(jié)果。第六節(jié)基因工程菌發(fā)酵一、基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程：（1）通過(guò)搖瓶操作了解工程菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)條件：如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分以及碳氮比，分拆表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對(duì)受體細(xì)胞的影響；（2）通過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案以及順序。二、基因工程菌的培養(yǎng)方式常用的有：補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)。1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的培養(yǎng)方式。2、連續(xù)培養(yǎng)將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定濃度后，開動(dòng)進(jìn)料和出料的蠕動(dòng)泵，以控制一定稀釋率進(jìn)行不間斷的培養(yǎng)。3、透析培養(yǎng)利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過(guò)去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來(lái)解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響。4、固定化培養(yǎng)三、基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌的發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵工藝的區(qū)別：（1）生物材料方面（2）生產(chǎn)目的方面1、培養(yǎng)基的影響常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解產(chǎn)物、玉米漿和氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。另外還要加一些無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、生物素等。對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株還要補(bǔ)加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基及灌注式細(xì)胞培養(yǎng)袋

2、接種量的影響接種量是指移入的種子液體和培養(yǎng)液體積的比例。接種量小，不利于外源基因的表達(dá)，大接種量有利于對(duì)基質(zhì)的利用，縮短生長(zhǎng)延遲期，并使生產(chǎn)菌能迅速占領(lǐng)整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，減少污染機(jī)會(huì)，但接種量過(guò)高又會(huì)抑制后期菌體的生長(zhǎng)。所以接種量大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵中的生長(zhǎng)繁殖速度。3、溫度的影響溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子調(diào)節(jié)分子的合成水平上。在復(fù)制水平上，可通過(guò)調(diào)控復(fù)制，改變基因拷貝數(shù)，影響基因表達(dá)；在轉(zhuǎn)錄水平上，可通過(guò)影響RNA聚合酶的作用或修飾RNA聚合酶，來(lái)調(diào)控基因表達(dá)；溫度也可在mRNA講解和翻譯水平上影響基因表達(dá)，溫度還可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)小分子調(diào)節(jié)分子的量而影響基因表達(dá)，也可通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)ppGpp量調(diào)控一系列基因表。溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。4、溶解氧的影響溶解氧是工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中影響菌體代謝的一個(gè)重要參數(shù)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成影響很大。外源基因的高效表達(dá)和翻譯需要維持較高水平的DO2值。通常采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法，可以改善培養(yǎng)過(guò)程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。5、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。6、pH的影響pH對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長(zhǎng)和代謝情況，對(duì)pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)?？傊こ叹l(fā)酵工藝的優(yōu)化對(duì)異源蛋白的表達(dá)關(guān)系重大，必須建立最佳化工藝。四、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備發(fā)酵罐的組成部分有：發(fā)酵罐體、保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無(wú)菌過(guò)濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測(cè)量與控制系統(tǒng)以及培養(yǎng)液配置及連續(xù)操作裝置等。第七節(jié)基因工程藥物的分離純化許多醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品都是活性肽或蛋白質(zhì)。這些產(chǎn)品的制備具有下列特點(diǎn)：（1）目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低（2）含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，且影響較大（3）目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差（4）種類繁多（5）應(yīng)用面廣，對(duì)其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無(wú)菌、無(wú)熱原等。因此，為了獲得合格得目的產(chǎn)物，必須建立與上述特點(diǎn)相適應(yīng)的醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品的分離純化工藝。一、建立分離純化工藝的依據(jù)1、含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)：包括（1）菌種類型及其代謝特性（2）原材料和培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量（3）生產(chǎn)工藝和條件（4）初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。2、物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)3、目的產(chǎn)物特性4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求二、分離純化的基本過(guò)程分離純化是基因工程藥物生產(chǎn)中極其重要的一環(huán)。一般不應(yīng)超過(guò)4～5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。

重組蛋白表達(dá)及分離純化技術(shù)平臺(tái)基因工程藥物分離純化生產(chǎn)裝置

三、分離純化的技術(shù)分離純化技術(shù)應(yīng)滿足下列要求：（1）技術(shù)條件要溫和（2）選擇性要好（3）收率要高（4）兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接（5）整個(gè)分離純化過(guò)程要快1、細(xì)胞破碎與固液分離：有細(xì)胞收集、細(xì)胞破碎和細(xì)胞碎片分離等步驟。（1）細(xì)胞收集：細(xì)胞收集常用的是離心分離的方法，膜過(guò)濾法液逐步得到廣泛應(yīng)用。（2）細(xì)胞破碎：有機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法。機(jī)械破碎法：高壓勻漿法、超聲破碎法、高速珠磨法、高壓擠壓法非機(jī)械破碎法：酶溶法、化學(xué)滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法等。（3）固液分離：離心沉淀是固液分離的主要手段，包括高速離心和超速離心。常用的膜過(guò)濾技術(shù)有微濾、超濾和反滲透等。2、目的產(chǎn)物的分離純化主要依賴色譜分離方法。色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜。親和色譜、凝膠色譜、高壓液相色譜等。蛋白質(zhì)純化方法的設(shè)計(jì)通常根據(jù)產(chǎn)物分子的物理、化學(xué)參數(shù)和生物學(xué)特性，他們對(duì)分離純化的影響見(jiàn)表3—3。選擇純化方法應(yīng)根據(jù)目的蛋白質(zhì)和雜蛋白的物理、化學(xué)和生物學(xué)方面性質(zhì)的差異，尤其重要的是表面性質(zhì)的差異。（1）離子交換色譜（ionexchangechromatography,IEC）基本原理是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離的目的。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和表面電荷的分布主要影響其離子交換的性能，影響蛋白質(zhì)離子交換色譜保留的其他因素，還有交換基團(tuán)和交換介質(zhì)的種類、吸附和洗脫的條件等。

（2）反相色譜（reversedphasechromatography,RPC）和疏水色譜（hydrophobicinteractionchromatography,HIC）反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來(lái)分離純化的。（3）親和色譜（affinitychromatography,AC）親和色譜是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附的。親和色譜的過(guò)程大致分為3步：第一步配基固定化;第二步吸附目的產(chǎn)物；第三步樣品解吸。（4）凝膠過(guò)濾色譜凝膠過(guò)濾是以具有空隙大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小