第六章基因操作中大分子的分離和分析

第六章基因操作中大分子的分離和分析第一節(jié)DNA的分離、檢測(cè)和純化分離純化核酸總的原則：①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性（完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求）②排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染。③無(wú)其他核酸分子的污染（如抽提DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA分子）。分離核酸應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解：酸、堿②減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械力③防止核酸的生物降解：進(jìn)行核酸分離時(shí)最好新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或-70℃冰箱中。1.1DNA提取的步驟一、細(xì)胞破碎二、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)三、除去其他雜質(zhì)核酸四、獲得DNA樣品一、細(xì)胞破碎目前細(xì)胞破碎主要有物理破碎（主要是機(jī)械破碎）和非物理破碎（主要化學(xué)破碎和生物酶解）

（一）、物理破碎

目前常用物理破碎的方法主要有：均質(zhì)珠子研磨振蕩、液氮研磨、乳缽研磨、凍融、煮沸、超聲波(ultrasonication)和微波加熱(microwaveheating)等。1、微波加熱對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌非常有效，但是加熱必須適中，否則DNA可能被破壞。

2、熱激處理包含冷凍和融解兩步，冷凍主要是用液氮、冰箱(?70℃、－20℃)或冰，而融解主要是37℃、50℃、65℃或100℃水浴，其中凍融循環(huán)次數(shù)和孵育時(shí)間可以根據(jù)不同要求變化。如，Lee(1996)等通過(guò)用吖啶橙染色直接統(tǒng)計(jì)經(jīng)三次熱激(?70℃/65℃)聯(lián)合溶菌酶和SDS處理后的細(xì)胞裂解率為90%。

熱激處理比其他物理處理的剪切力要小很多，而且提取效率、得到片段完整性較好。3、珠子打擊法(beadbeating)加入不同直徑的玻璃珠，有利于不同細(xì)胞DNA的提?。孩僦睆綖?10～1180μm

玻璃珠可打碎土壤塊和植物細(xì)胞；

②

425～600μm

玻璃珠可打碎真菌、植物和其他真核細(xì)胞；

③

106μm

玻璃珠可打碎細(xì)菌細(xì)胞。在使用玻璃珠研磨法時(shí)，應(yīng)在珠子大小和數(shù)量上具有合適的配比，這樣才能有效地破碎和抽提微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)生孢子或分生孢子的DNA。珠子打擊法優(yōu)點(diǎn)：有更好的裂解效率和產(chǎn)量，而且其DNA產(chǎn)量隨著打擊時(shí)間和打擊速度的增加而增加，因此，可以用較小的抽提緩沖液體積處理較小的樣品得到滿意的獲得率。珠子打擊法缺點(diǎn)：隨著打擊處理而增加產(chǎn)量的同時(shí)，剪切力增大并導(dǎo)致小片段增加，從而影響PCR的敏感性，甚至可能增加嵌合體形成率而影響隨后的分子生物學(xué)處理及結(jié)果，特別是引起多樣性分析的偏差。（二）非物理破碎法非物理破碎法相對(duì)比較溫和，利于保持DNA的完整性。其主要是包括化學(xué)破碎和生物酶解。1、化學(xué)破碎目前化學(xué)破碎法常用的化學(xué)試劑主要是陰離子型去污劑SDS（十二烷基硫酸鈉）、Sarkosyl（N-十二烷基肌氨酸鈉）和陽(yáng)離子型去污劑CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）等。

2、生物酶解在生物酶解中最普遍使用的是溶菌酶，其主要是通過(guò)水解細(xì)胞壁而達(dá)到裂解細(xì)胞的目的，特別是對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的破碎，同時(shí)溶菌酶還可以水解糖苷鍵和腐殖酸的化合鍵從而改善DNA純度。由于生物酶解比較溫和，故其常常還需要跟化學(xué)、物理等裂解方法聯(lián)合使用。目前除了使用溶菌酶外，也有添加旨在提高革蘭氏陽(yáng)性菌裂解的消色肽酶(achromopeptidase)、消化蛋白的蛋白酶K(proteinaseK)(主要通過(guò)酶解膜蛋白來(lái)提高裂解細(xì)胞以及消化蛋白而有利于隨后的核酸分離純化)以及在富含有機(jī)酸的樣品中有利于核酸釋放的鏈霉蛋白酶(pronase)等。一般來(lái)說(shuō)，單獨(dú)使用一種處理方法效果都不會(huì)很好，而適當(dāng)?shù)慕M合可產(chǎn)生很好的效果。二、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)苯酚對(duì)蛋白質(zhì)有極強(qiáng)的變性作用，而對(duì)DNA無(wú)影響；氯仿也可使蛋白質(zhì)變性，對(duì)DNA無(wú)影響；蛋白酶可降解蛋白質(zhì)，故在實(shí)驗(yàn)中也常使用。注：苯酚的殘留會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的分子操作，故用苯酚去除蛋白質(zhì)后還需用氯仿/異戊醇（24:1）抽提兩次，以去除殘留的蛋白質(zhì)和苯酚。三、除去其他雜質(zhì)核酸在DNA提取中會(huì)有少量的RNA雜質(zhì)殘留，但RNA極易降解，一般情況下對(duì)后續(xù)的DNA操作無(wú)大影響。如要求DNA純度較高時(shí)可加入RNA酶（RNase）以降解RNA。四、獲得DNA樣品含DNA的水相可用以下幾種沉淀劑沉淀：a.無(wú)水乙醇（最常用）：易于從DNA沉淀中除去。但所需的體積大（2倍），由于使用的管多為一次性，比較浪費(fèi)。b.異丙醇：能與自由水緊密結(jié)合。結(jié)合了溶解DNA的水分子，使DNA沉淀?？沙爻恋?，離心，加入體積為0.6—1倍體積，但不易除去，需用70%酒精洗滌幾次，否則對(duì)后續(xù)分子操作有影響。異戊醇：幾乎不能與自由水結(jié)合，但可分離有機(jī)醇與溶液層，還可去氣泡，也可做去蛋白的輔助劑。c.PEG（聚乙二醇，分子量6000—8000）選擇性沉淀：低濃度PEG（如1%）選擇沉淀大分子DNA，在構(gòu)建基因組文庫(kù)則用低濃度PEG沉淀幾十kb；高濃度PEG（20%），選擇沉淀小分子，幾百bp。如：PBR3224.3kb用PEG12%沉淀。PEG選擇沉淀的分辨率達(dá)100bp。沉淀時(shí)的注意事項(xiàng)：（1）當(dāng)DNA分子量<1kb或濃度較低,<1μg/ml，加入沉淀劑后應(yīng)在-70℃下幾小時(shí)或過(guò)夜，否則回收不徹底。此外，應(yīng)16000rpm離心；（2）DNA>1kb，加入沉淀劑后再加入糖原，幾分鐘可↓完全；（3）DNA<200bp，回收時(shí)，先加MgCl2至終濃度達(dá)10mmol/L，再用乙醇沉淀；（4）溶液中磷酸鹽>1mmol/LorEDTA>10mmol/L，則用乙醇沉淀得不到DNA，應(yīng)選其它方法沉淀DNA。DNA樣品的貯存：4℃短期貯存;-20℃長(zhǎng)期貯存，冰上緩解凍（取時(shí)）；也可將DNA樣品以乙醇沉淀的形式保存在-20℃。Figure3.4

Preparationofacellextract.PreparationofacellextractFigure3.5

Removalofproteincontaminantsbyphenolextraction.◆

PurificationofDNAfromacellextractFigure3.6CollectingDNAbyethanolprecipitation.◆ConcentrationofDNAsamples兩種經(jīng)典的化學(xué)試劑提取法：

1、CTAB法

2、SDS法?

CTAB法（1）原理：CTAB,十六烷基三甲基溴化銨是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時(shí)，從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。（2）具體操作：在所需量的CTAB抽提液中加入β－巰基乙醇，使終濃度達(dá)2％（v/v）。將此溶液預(yù)熱至65℃。對(duì)于每克新鮮的葉組織大約需要4ml的β－ME/CTAB抽提液。用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷卻粉碎器/勻漿器，將0.5g植物組織粉碎成細(xì)粉，然后將組織轉(zhuǎn)移到2.0ml離心管。加入800μl預(yù)熱的β－Me/CTAB，混合使之充分濕潤(rùn)，于65℃溫育20min，不時(shí)顛倒混勻。待冷至室溫后，加入800μl氯仿/異戊醇（24：1），顛倒混勻至溶液呈乳濁狀（但不要振蕩）。25℃，10000rpm離心10min。⑤上清（約700μl）轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中，加入5μlRNaseA貯液，37℃溫育30min。⑥加入700μl氯仿/異戊醇，顛倒混勻，25℃，10000rpm離心10min。⑦上清（約600μl）轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5ml離心管中，加入600μl異丙醇，顛倒混勻，室溫或-20℃放置20min。⑧

25℃，12000rpm，離心10min，收集沉淀。⑨去上清，加1ml70%乙醇洗滌沉淀兩次（25℃，12000rpm，離心10min）⑩晾干DNA，溶于50μlddH2O，4℃保存?zhèn)溆谩＃?）優(yōu)缺點(diǎn)：①

能很好地去除糖類物質(zhì)；②

在提取的前期能同時(shí)得到高含量的DNA及RNA；③

步驟多，復(fù)雜，提取的DNA分子量比SDS法小。（4）說(shuō)明：β—巰基乙醇的作用：a.是一種蛋白質(zhì)的輔助變性劑；b.主要作還原劑，加入溶液中可防止整個(gè)溶液的氧化，大大提高DNA得率。由于氣體（多酚類物質(zhì)）刺鼻，通風(fēng)柜操作。?SDS法（1）原理:利用高濃度的SDS，在較高溫度（55—65℃）條件下裂解細(xì)胞，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的做法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保溫，在低溫條件下KAc與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物），離心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

（2）過(guò)程：將0.3g植物材料于液氮速凍，然后在研缽中將其磨碎，將粉末轉(zhuǎn)至2ml離心管中。加入1.2ml預(yù)熱至65℃的提取緩沖液（其中加入3μlβ—巰基乙醇，增加DNA的穩(wěn)定性），置65℃水浴中放置30分鐘，不時(shí)顛倒混勻。加入0.45ml5M的醋酸鉀，混勻，冰浴20分鐘，在10000rpm離心20min。需要的話，用紗布過(guò)濾除去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，12000rpm離心15min。⑥轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加5μlRNaseA貯液，37℃溫育30min。⑦加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，12000rpm離心15min。⑧轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加入0.7V異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30分鐘沉淀核酸。⑨

25℃，12000rpm，離心10min，收集沉淀。⑩棄上清，70％乙醇洗兩次。涼干DNA，溶于50μlddH2O，4℃保存?zhèn)溆?。?）與CTAB法比較：SDS法較溫和，對(duì)DNA的切割不大，可獲得大分子量的DNA。故該法可建立基因組文庫(kù)，多酚類物質(zhì)的材料適用。該法極易造成SDS-DNA共沉淀。對(duì)SDS質(zhì)量要求較高。稱取SDS時(shí)，動(dòng)作要緩慢，因SDS易于形成微顆粒。溶解時(shí)，水應(yīng)沿壁使水輕緩流下，56℃助溶。

例1：水稻基因組DNA提取取3-5g新鮮水稻葉片，用液氮速凍，在研缽中快速研成粉末狀，轉(zhuǎn)入50ml離心管中；立即加入20ml預(yù)熱至65℃的提取緩沖液，65℃水浴30min；加入7.5ml5M醋酸鉀，輕輕混勻，冰上放置20min，4000rpm離心20min。將上清轉(zhuǎn)入另一干凈的50ml離心管中；加入15ml氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，4000rpm離心20min。將上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)干凈的50ml離心管中；加入15ml冰預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30min；4000rpm離心20min，棄上清，用20ml70%的乙醇洗一遍，倒置離心管于干凈的濾紙，室溫晾干沉淀；將沉淀重懸于0.6mlTE緩沖液，加10μl10mg/mlRNA酶，37℃保溫10min；轉(zhuǎn)入干凈的2ml離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），12000rpm離心10min；將上清轉(zhuǎn)入一干凈的2ml離心管中，加入1/10體積冰預(yù)冷的3M醋酸鈉（pH5.2），2倍體積冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇，12000rpm離心30min。棄上清，用70%的乙醇洗一遍，晾干后，容于500μlTE，保存于-20℃?zhèn)溆谩＠?：細(xì)菌DNA大量提取吸取1ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌于50ml不加抗生素的PSA中，28℃，200rpm過(guò)夜培養(yǎng)；6000rpm離心5分鐘，收集菌體；用50ml冰冷的1×TE沖洗菌體兩次；將菌體重新打散，懸于20ml1×TE中；加入（37℃預(yù)消化1小時(shí)）的蛋白酶、SDS使其終濃度分別為625g/ml(w/v)及1.25％（w/v）,冰浴45分鐘至有白色SDS析出；室溫放置30分鐘，不時(shí)輕輕搖動(dòng)；3%NaCl飽和的苯酚、苯酚/氯仿（1:1,v/v）及氯仿各抽提一次，收集上清于新的離心管；加入1/10體積的3MNaAc(pH4.8),再加等體積冰冷的異丙醇，混勻后置室溫30min，待出現(xiàn)無(wú)色透明的白色絮狀DNA，用Tip頭吸出，室溫干燥后溶于1xTE中；DNA保存于-20oC，可長(zhǎng)期保存。

例4：人類DNA提取親手提取自己的DNA

作為“紀(jì)念DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)五十周年系列展覽”的一部分，現(xiàn)場(chǎng)萃取DNA制成掛件模型實(shí)驗(yàn)，昨天在北京王府井新東安廣場(chǎng)舉行。十幾名學(xué)生在英國(guó)老師斯蒂娜的指導(dǎo)下親手萃取了自己的絮狀DNA，並制作成可愛的掛件，掛在脖子上。據(jù)悉，這次開放式實(shí)驗(yàn)活動(dòng)將持續(xù)到3日。

圖為北京外國(guó)語(yǔ)大學(xué)學(xué)生小周看見自己的DNA奇跡般地出現(xiàn)在試液中，驚奇不已。

本報(bào)記者吳平

張紅晉攝影報(bào)道

《京華時(shí)報(bào)》(2003年10月2日第2版)

1.2質(zhì)粒DNA的提取1、堿裂解法◆堿裂解法由Birnboim和Doly設(shè)計(jì)并于1979年發(fā)表，基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的?！粼趐H高達(dá)12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。◆當(dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?！敉ㄟ^(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去?；驹恚篎igure3.11

Plasmidpurificationbythealkalinedenaturationmethod.三種溶液：溶液I：50mM葡萄糖/25mM

Tris-Cl/10mMEDTA：pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；

溶液III：3M醋酸鉀/2M醋酸

提取步驟：pET28c(+)電泳結(jié)果

堿抽提法所用試劑的生化作用

提取過(guò)程中所用的材料有：LB培養(yǎng)基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris?HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、TE緩沖液、3mol/L乙酸鉀溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、異丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。

①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用,同時(shí)有利于溶菌酶的作用。

②NaOH-SDS液:NaOH濃度為0.2mol/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S03-…R+一蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來(lái)。③KAc:

pH4.8的KAc溶液是為了把pHl2.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽：3mol/LKAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體DNA因?yàn)橹泻土撕怂嵘系碾姾桑瑴p少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

④無(wú)水乙醇:沉淀DNA，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。

⑤酚-氯仿:酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。⑥異戊醇:異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過(guò)程中泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

2、通過(guò)試劑盒分離純化質(zhì)粒DNA

分離純化過(guò)程是通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的結(jié)合—洗滌—洗脫程序來(lái)完成的。

優(yōu)點(diǎn)：該方法操作簡(jiǎn)單，回收效率高，洗脫出來(lái)后的DNA可立即使用，無(wú)需濃縮、沉淀或脫鹽。

1.3瓊脂糖凝膠電泳分離純化的DNA是否真的存在、是否有降解現(xiàn)象，以及DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后其產(chǎn)物的大小如何等都是在基因操作中時(shí)刻面對(duì)的問(wèn)題。目前最成熟的檢測(cè)DNA的技術(shù)就是瓊脂糖凝膠電泳。一、瓊脂糖的特點(diǎn)及凝膠電泳的原理

瓊脂糖是從海藻中提取出的一種線性多糖聚合物。在高溫水溶液中會(huì)溶解，在常溫下凝固并形成一定大小孔徑的惰性介質(zhì)。在電場(chǎng)的作用下，DNA可在孔洞中遷移。瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為支持物，在適當(dāng)條件下對(duì)帶電生物大分子進(jìn)行電泳的技術(shù)。主要用于DNA分子的分離、純化和鑒定。瓊脂糖凝膠電泳的原理：DNA分子在溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，由于DNA分子的分子質(zhì)量差別，電泳后不同大小的DNA分子呈現(xiàn)遷移位置的差異，把已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)DNA與待測(cè)DNA同時(shí)電泳，比較兩者在凝膠板上所呈現(xiàn)的區(qū)帶，就可以鑒定出待測(cè)DNA的大小。二、瓊脂糖凝膠電泳基本操作步驟

在瓊脂糖中加入電泳緩沖液→微波加熱溶解→溫度降至60℃左右時(shí)，加入電泳染料→混勻后倒入凝膠槽→待凝膠完全凝結(jié)后，小心拔去梳子→放入電泳槽中，倒入電泳緩沖液，緩沖液高過(guò)凝膠面0.5cm→點(diǎn)樣→根據(jù)需要設(shè)置電泳電壓和時(shí)間，開始電泳→電泳結(jié)束后在凝膠成像儀上觀察、照相→進(jìn)一步分析。瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程染色體DNA瓊脂糖電泳圖譜紫外線光源靈敏度:302nm>254nm>366nm電泳結(jié)果分析：

0.8%的瓊脂糖凝膠，應(yīng)呈現(xiàn)一條清晰帶。若呈長(zhǎng)帶狀彌散熒光則表明DNA降解,原因可能有：①是否滅菌器皿及試劑；②材料收集是否立即冷凍，研磨（后）提取是否融化；③是否劇烈振動(dòng)，吸管口過(guò)窄，產(chǎn)生氣泡。反復(fù)吸打及凍融等問(wèn)題。若在溴酚藍(lán)處出現(xiàn)明亮的熒光，則有RNA，可用RNase消化。消化后用氯仿抽提，乙醇沉淀方法純化。若在樣品槽內(nèi)有熒光出現(xiàn)，可能樣品中DNA未完全溶解或濃度過(guò)高，或樣品不純，可能是大量帶正電荷的雜質(zhì)與DNA樣品結(jié)合。

凝膠類型及濃度

分離DNA片段的大小范圍（bp）

0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1三、瓊脂糖凝膠電泳的影響因素1、凝膠濃度凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。具體的濃度及分離DNA片段的大小范圍如下表。

2、DNA分子的大小和構(gòu)象線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠上電泳距離與DNA的分子質(zhì)量對(duì)數(shù)成反比。但當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí)，它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子質(zhì)量有關(guān)，還和它本身構(gòu)象有關(guān)。有相同分子質(zhì)量的線狀DNA<開環(huán)狀DNA<超螺旋DNA。3、電泳緩沖液目前常用的緩沖液有TAE（40mol/LTris-乙酸、1mmol/LEDTA）和TBE（90mmol/L硼酸、1mmol/LEDTA）。TAE緩沖液的緩沖能力較低，適用于低電壓長(zhǎng)時(shí)間電泳；TBE有較強(qiáng)的緩沖能力，是比較通用的緩沖液。4、指示劑

電泳過(guò)程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過(guò)程。目前常用的核酸電泳指示劑是溴酚藍(lán)，呈藍(lán)紫色。5、染色①溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）可很好地?fù)饺氲诫p鏈DNA中，在紫外光的激發(fā)下會(huì)呈現(xiàn)橙紅色的熒光，便于鑒定，可用于對(duì)DNA進(jìn)行染色和觀察。②SYBRGreenI

:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價(jià)格較EB貴。

強(qiáng)烈誘變劑1.4聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）可很好的分辨100bp-1kb大小的核酸分子。對(duì)單鏈DNA來(lái)說(shuō)，其分辨率可達(dá)1bp，這種分辨能力在DNA序列測(cè)定中發(fā)揮了重要作用。

特點(diǎn)：分辨率高；載樣量大；回收DNA純度高；適于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp1.5脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PEGE）

1984年，D.C.Schwartz和C.R.Cantor發(fā)明。用來(lái)分離整條染色體這樣的超大分子量DNA分子，如大腸桿菌染色體基因組DNA，>4000kb。DNA分子的遷移方向隨所用電場(chǎng)方向的周期性變化而不斷改變。可成功分離到分子量高達(dá)107bp的DNA大分子。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳實(shí)際上是一種交替變化電場(chǎng)方向的電泳，以一定的角度并以一定的時(shí)間變換電場(chǎng)方向，使DNA分子在微觀上按“Z”字形向前泳動(dòng)，從而到達(dá)分離大分子DNA的目的。與常規(guī)的直流單向電場(chǎng)凝膠電泳不同，這項(xiàng)技術(shù)采用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1秒到5分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場(chǎng)。脈沖場(chǎng)凝膠電泳的工作方式：橫向交變電泳（TAFE）、場(chǎng)翻轉(zhuǎn)凝膠電泳（FIGE）、旋轉(zhuǎn)凝膠電泳和箝位勻場(chǎng)電泳（CHEF）。其中使用最廣泛的是CHEF。+++-----2脈沖電泳槽電泳儀冷凝器真空泵BIio-Rad公司CHEF-DR脈沖電泳儀影響脈沖場(chǎng)凝膠電泳的因素：脈沖時(shí)間、分子大小、電場(chǎng)強(qiáng)度、溫度和電場(chǎng)間角度。若分子重新定向時(shí)間和脈沖時(shí)間的比值在0.1-1之間，對(duì)較長(zhǎng)的DNA片段的分離具有最佳的分辨率。1.6DNA片段的純化1、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖總體上可分為兩類：普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)（LMP

）瓊脂糖。

LMP瓊脂糖的熔點(diǎn)為62-65℃，其一旦溶解，便可在37℃持續(xù)保持液體狀態(tài)達(dá)數(shù)小時(shí)，而在25℃下也可持續(xù)保持液體狀態(tài)約10min。純化步驟：用LMP瓊脂糖凝膠分離特定的DNA片段→切割帶有目的DNA的瓊脂糖凝膠塊→加入適量緩沖液→加熱到60℃使凝膠溶化，DNA進(jìn)入水溶液中→通過(guò)苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀→獲得純化的DNA片段。（這是經(jīng)典的DNA片段回收方法，現(xiàn)在一般比較少用。）其在回收大片段DNA時(shí)仍是一個(gè)比較好的辦法，在回收大片段DNA時(shí)在加熱融化后常用瓊脂糖酶水解瓊脂糖，從而減少殘留的雜質(zhì)，提高回收效率。2、透析袋電洗脫法

純化步驟：將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊切割下來(lái)→放在透析袋中→置于電泳緩沖液中電泳→DNA分子在電場(chǎng)作用下從凝膠塊中游離出來(lái)，貼在透析袋內(nèi)壁上→取出凝膠塊→更換新鮮緩沖液，反向電泳，使DNA游離于緩沖液中→取出含DNA的緩沖液→通過(guò)苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀→獲得純化的DNA分子。

透析袋電洗脫法現(xiàn)在多用來(lái)純化相對(duì)分子量較大的DNA片段。

3、GlassMilk（bead）結(jié)合法該方法涉及兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)：①瓊脂糖凝膠在3倍體積的3mol/LNaI

溶液作用下與55℃會(huì)溶化，從而使DNA釋放到水溶液中；②在這樣的高鹽濃度下有一種硅粒（glassbead，硅的細(xì)微顆粒，其水溶液呈牛奶狀，故也成為玻璃奶，glassmilk）可特異性吸附DNA。當(dāng)硅粒吸附DNA后，通過(guò)離心的方法很容易對(duì)硅粒進(jìn)行洗滌，然后用水或低鹽緩沖液可從硅粒中將吸附的DNA洗脫出來(lái)。該方法操作簡(jiǎn)便，回收效率高，易于推廣。但回收的DNA片段一般不超過(guò)10kb，否則回收效率低。

4、純化試劑盒純化DNA

目前已有純化各類DNA的商品試劑盒，大部分都是使用帶硅膠膜的純化柱吸附DNA，再經(jīng)過(guò)洗滌、洗脫步驟得到純化的DNA。該方法操作簡(jiǎn)便快速，且純化效果好。但其只對(duì)小于10kb的DNA片段有好的純化效果，且價(jià)格相對(duì)于其他方法較昂貴。（目前也有一些公司開發(fā)出可以純化>20kbDNA的純化試劑盒，有些還可純化回收到50kb左右的DNA片段）1.7DNA或RNA的紫外分光光度法測(cè)定純度

定量測(cè)定DNA或RNA時(shí)需要讀取260nm和280nm兩個(gè)波長(zhǎng)下的讀數(shù)。根據(jù)260nm處的讀數(shù)可計(jì)算出樣品中核酸的濃度，1個(gè)OD值相當(dāng)于約50μg/ml雙鏈DNA、40μg/ml單鏈DNA和RNA及33μg/ml單鏈寡核苷酸。利用OD260和OD280的比值可計(jì)算出核酸的純度，DNA的純制品OD260：OD280為1.8，RNA的純制品OD260：OD280為2.0.若低于這兩個(gè)值說(shuō)明核酸中含有酚或蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。1.8DNA分離、純化過(guò)程中常用到的有毒試劑1、SDS

有毒，是一種刺激物，對(duì)眼睛會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p傷，可因吸入、咽下或皮膚吸收而損害健康。使用時(shí)需戴手套，稱量時(shí)需戴口罩。2、β-巰基乙醇高濃度的β-巰基乙醇對(duì)黏膜、上呼吸道、皮膚和眼睛有嚴(yán)重的損失作用，使用時(shí)需要戴手套于通風(fēng)櫥操作。3、PEG

可因吸入、咽下或皮膚吸收而危害健康。使用時(shí)需戴手套于通風(fēng)櫥操作。4、蛋白酶K

是一種刺激物，使用時(shí)需戴手套。5、溴化乙錠（EB）是一種強(qiáng)誘變劑，使用時(shí)要避免吸入其粉末。在用含有EB的溶液工作時(shí)需戴合適的手套。6、苯酚具有很強(qiáng)的毒性和高度的腐蝕性，并能引起嚴(yán)重的灼傷，可因吸入、咽下或皮膚吸收而受到危害。使用時(shí)要戴手套，于通風(fēng)櫥操作。如皮膚接觸到酚，需立即用大量的水沖洗接觸酚的部位，并用肥皂和水洗。7、氯仿、異戊醇、異丙醇等溶劑都具有刺激性氣味，可因吸入、咽下或皮膚吸收而危害健康，使用時(shí)需戴手套于通風(fēng)櫥操作。第二節(jié)RNA的分離、檢測(cè)和純化

細(xì)胞內(nèi)的RNA主要有：rRNA、tRNA、mRNA。對(duì)于基因操作來(lái)說(shuō)，所需的RNA主要是mRNA，其在細(xì)胞中的含量最少，僅占總RNA的1%-5%。由于mRNA是單鏈的，容易受到核酸酶的攻擊，導(dǎo)致在RNA操作過(guò)程中易降解。故RNA的提取要比DNA困難許多。實(shí)驗(yàn)成敗關(guān)鍵：創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNase的環(huán)境去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙酯)抑制內(nèi)源性RNase的活性RＮase阻抑蛋白（RＮasin，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑）氧銅核糖核苷復(fù)合物硅藻土2.1控制潛在RNA酶的活性

一、溶液和用具的去RNA酶處理

RNA酶能耐高溫，即使是高溫濕熱滅菌也不可能完全清除其活性。對(duì)于一些耐熱的物品，如玻璃制品，可通過(guò)高溫干熱滅菌。（180℃烘箱中烘烤8h以上）對(duì)于一些塑料物品，如移液吸頭和微量離心管，應(yīng)用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過(guò)的水浸泡后再滅菌，或者購(gòu)買無(wú)RNA酶污染的用具。對(duì)于電泳用具最好使用專用的，不要用于其他分析，并且在使用之前用洗滌劑洗刷干凈，再用3%H2O2和0.1%DEPC處理的水浸泡，清洗干凈。對(duì)于可能接觸RNA的溶液，需要用DEPC處理的水配制。在提取過(guò)程中要戴口罩，盡量少講話，始終戴一次性橡膠手套，并且經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶污染用具。（不要使用一次性塑料手套，因?yàn)樗芰鲜痔锥喑龅牟糠殖３Ｔ谄骶叩腞NA酶污染處和無(wú)RNA酶處傳播RNA酶，擴(kuò)大污染。）二、RNA酶抑制劑的使用目前應(yīng)用較多的是蛋白類抑制劑，如人胎盤RNase

抑制劑。除此外，還有氧銅核糖核苷復(fù)合物和硅藻土。2.2RNA的抽提和純化RNA提取的一般步驟：①破碎細(xì)胞；②使核蛋白復(fù)合體充分變性，即使核蛋白迅速與核酸分離；③抑制內(nèi)源RNase以及容器污染的外源RNase的活性；④將RNA與DNA、蛋白質(zhì)和多糖分開。1、酚—異硫氰酸胍抽提法(TRIZOL試劑)

TRIZOL試劑是使用最廣泛的抽提總RNA的專用試劑，主要由苯酚和異硫氫酸胍組成。對(duì)任何生物材料的RNA提取，首先研磨組織或細(xì)胞，或使之裂解；加入該試劑后，可保持RNA的完整，同時(shí)進(jìn)一步破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分；加入氯仿抽提，離心，水相和有機(jī)相分離；收集含RNA的水相；通過(guò)異丙醇沉淀，可獲得RNA樣品。

Trizol的主要成分是酚，主要作用是裂解細(xì)胞。酚不能完全抑制RNA酶活性。0.1%的8-羥基喹啉與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)對(duì)RNase的抑制；異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇主要破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。

2、硅膠膜純化法（純化柱試劑盒）設(shè)計(jì)思路與DNA的分離純化思路相似：含有目標(biāo)核酸的細(xì)胞破碎液通過(guò)硅膠膜時(shí)，核酸吸附在硅膠膜上，從而與其它細(xì)胞成分分開，然后在低鹽濃度下核酸可從硅膠膜上洗脫出來(lái)。

2.3mRNA的純化

mRNA的純化主要是針對(duì)于真核生物的，由于真核生物mRNA的3’端有一個(gè)poly（A）尾，可與oligo（dT）-纖維素吸附，從而可利用親和層析的方法純化。對(duì)于原核生物，其mRNA與其他的RNA沒(méi)有明顯的結(jié)構(gòu)差異，難以從總RNA中純化出來(lái)。2.4RNA的電泳檢測(cè)

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA分析與DNA分析的原理是類似的。不同的是，由于RNA呈單鏈狀態(tài)，易形成鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)。為保證電泳過(guò)程中RNA的遷移率與其相對(duì)分子質(zhì)量呈線性關(guān)系，因此，RNA分析是在變性條件下進(jìn)行的。常用的變性劑為甲醛，也可使用氫氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亞砜（DMSO）。第三節(jié)分子雜交分子雜交是在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用于檢測(cè)混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子是否存在，以及期相對(duì)分子質(zhì)量的大小。生物化學(xué)中分子雜交是指DNA在變性后，在復(fù)性的過(guò)程中兩個(gè)不同來(lái)源但具有同源性的核酸分子形成雜合雙鏈的過(guò)程。

根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同，分子雜交可分為Southern雜交、Northern雜交和Western雜交，以及由此簡(jiǎn)化的斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和菌落雜交等。3.1Southern雜交

根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫DNA印跡雜交技術(shù)。由E.Southern1975年設(shè)計(jì)，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。

印跡轉(zhuǎn)移（blotting)：通過(guò)電泳將DNA、RNA或蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，使不同相對(duì)分子質(zhì)量的的分子在凝膠上展開，然后將凝膠上的樣品通過(guò)影印的方式轉(zhuǎn)移到濾膜上的過(guò)程稱為印跡。Southern雜交流程圖樣品制備電泳雜交轉(zhuǎn)膜結(jié)果顯示探針制備（一）Southern雜交的操作步驟1.預(yù)處理：（1）用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行酶切。（2）將酶切后的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（3）將電泳出來(lái)的凝膠泡在強(qiáng)堿溶液中，此時(shí)雙鏈的DNA樣品變性成單鏈DNA結(jié)構(gòu)。（4）用酸中和，使單鏈DNA維持其單鏈狀態(tài)（5）大片段DNA脫嘌呤，0.2NHCl。2.原位轉(zhuǎn)移：將凝膠上的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素膜上。（毛細(xì)管、電轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移）3.固定：在真空烤箱里，80℃下烤1-3h或紫外線照射或微波烘烤，將核酸樣品進(jìn)一步固定在濾膜上。4.雜交：雜交之前須有一個(gè)預(yù)雜交，封阻膜的背景，避免雜交時(shí)背景吸附探針。（魚精DNA或脫脂牛奶）將濾膜移在含有放射性同位素標(biāo)記的探針?lè)肿尤芤褐校芤荷系膯捂淒NA分子與探針?lè)肿油ㄟ^(guò)互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行雜交，形成雜種分子。5.漂洗：將濾膜上沒(méi)有和單鏈DNA樣品結(jié)合的游離的探針?lè)肿悠聪聛?lái)，此后濾膜上只有雜交分子。6.放射自顯影：在X光曝射下進(jìn)行放射自顯影形成自顯影圖片。7.比較鑒定：將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進(jìn)行比較。確定與探針?lè)肿咏Y(jié)合的DNA分子是凝膠上DNA鏈的那個(gè)片段。放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交－＋SouthernBlotting的過(guò)程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過(guò)電泳液的移動(dòng)轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的DNA4.預(yù)雜交和雜交(放射性和熒光檢測(cè))5.結(jié)果檢測(cè)

Southern印跡雜交方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果十分靈敏，在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即使每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測(cè)出來(lái)。

Southern雜交主要用于判斷某一生物樣品中是否存在某一基因，以及該基因所在的限制性酶切片段的大小。（鑒定特定的目的基因）

1.硝酸纖維素濾膜在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，但它存在一些不足之處:

（1）硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結(jié)合DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固，隨著雜交及洗膜進(jìn)程，DNA會(huì)慢慢脫離硝酸纖維素濾膜，從而使雜交效率下降。（二）Southern雜交的雜交濾膜（2）硝酸纖維素濾膜質(zhì)地較脆弱，容易碎裂，因此操作須小心謹(jǐn)慎(特別是經(jīng)烘烤后)。（3）硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合有賴于高鹽濃度，在低鹽濃度時(shí)結(jié)合DNA效果不佳，不適宜于電轉(zhuǎn)印跡法。（4）硝酸纖維素濾膜對(duì)于小分子質(zhì)量的DNA片段

(特別是小于200bp的DNA片段)結(jié)合能力不強(qiáng)。2.尼龍膜優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合DNA和RNA的能力強(qiáng)于硝酸纖維素濾膜，對(duì)小分子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合。尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對(duì)離子濃度要求不高，可重復(fù)用于雜交。缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底較硝酸纖維素濾膜高。3.2Northern雜交將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉(zhuǎn)膜：不需變性Northern雜交的過(guò)程

①提取總RNA。②分離mRNA。利用親和層析的原理純化mRNA。③制備RNA探針。根據(jù)mRNA序列合成同源DNA探針，或以cDNA為探針。④Northern雜交。Northern雜交的方法包括點(diǎn)雜交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到轉(zhuǎn)錄，但后者還能確定mRNA分子質(zhì)量大小及豐度。

Northern雜交的應(yīng)用：

（1）檢測(cè)mRNA長(zhǎng)度分子量大小（依電泳遷移率估計(jì)）；（2）mRNA的含量，即基因表達(dá)高低。（密度掃描儀，定量分析）

3.3Westen雜交

其雜交總體過(guò)程與Southern雜交相似，只是在印跡轉(zhuǎn)移過(guò)程中轉(zhuǎn)移的是蛋白質(zhì)而不是DNA。

Westen雜交主要用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品中是否存在能被某抗體識(shí)別的蛋白質(zhì)，從而判斷在翻譯水平上某基因是否表達(dá)。主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：硝酸纖維素膜靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)靶蛋白與第一抗體（一抗）反應(yīng)與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)3.4其他分子雜交

以上三種分子雜交可以獲得較精確的結(jié)果，但在操作程序上比較繁瑣，當(dāng)樣品量很大時(shí)，難以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。為此，當(dāng)檢測(cè)大量樣品時(shí)可以采用簡(jiǎn)化的方式做初步的檢測(cè)，如菌落雜交、噬菌斑雜交、斑點(diǎn)雜交和狹線雜交，然后再對(duì)陽(yáng)性樣品作精確的測(cè)試。一、菌落雜交將細(xì)菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點(diǎn)種在濾膜上然后再生長(zhǎng)出可見的菌落→對(duì)濾膜上的菌體進(jìn)行原位裂解使DNA釋放出來(lái)，并使之固定在濾膜上→通過(guò)分子雜交，判斷哪個(gè)或哪些菌落含有與探針同源的DNA。菌落雜交主要用來(lái)從通過(guò)質(zhì)?；蝠ち］d體構(gòu)建的基因文庫(kù)中尋找陽(yáng)性克隆子，當(dāng)?shù)玫疥?yáng)性克隆子后，再通過(guò)Southern雜交進(jìn)一步驗(yàn)證。這種方法在一張直徑為9cm的濾膜上，可檢測(cè)幾百到幾千個(gè)菌落，達(dá)到高通量篩選的目的。圖2—3檢測(cè)重組體克隆的菌落雜交技術(shù)(a)將硝酸纖維素濾膜鋪放在生長(zhǎng)著轉(zhuǎn)化菌落的平板表面，使其中的DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上；(b)取出濾膜，做溶菌、堿變性、酸中和等處理后，置80℃下烤干；(c)帶有DNA印跡的濾膜同32P標(biāo)記的適當(dāng)探針雜交。以檢測(cè)帶有重組質(zhì)粒（含有被研究的DNA插入片段）的陽(yáng)性菌落；(d)將放射自顯影的X光底片同保留下來(lái)的原菌落平板對(duì)照，從中挑出陽(yáng)性菌落供作進(jìn)一步的分析研究二、噬菌斑雜交噬菌斑雜交與菌落雜交相似，只是所檢測(cè)的不是菌落而是噬菌體。主要用來(lái)篩選λ噬菌體載體構(gòu)建的基因文庫(kù)中的陽(yáng)性重組體，通過(guò)Southern雜交進(jìn)一步驗(yàn)證后可獲得所需要的目的基因。三、點(diǎn)雜交其是分子雜交中最簡(jiǎn)單的一種，直接將DNA或RNA分子以斑點(diǎn)的形式固定在濾膜上，進(jìn)行分子雜交。其雜交的信號(hào)比菌落雜交和噬菌斑雜交受到蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分的干擾小，其結(jié)果的可靠性更強(qiáng)。四、狹線雜交其是在斑點(diǎn)雜交的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)的，只是點(diǎn)種核酸樣品的方式不同?？捎糜趯?duì)mRNA進(jìn)行定量比較，從而比較目的基因的表達(dá)強(qiáng)度。3.5雜交探針的獲得

雜交探針是指經(jīng)放射性或非放射性等物質(zhì)標(biāo)記的已知或特定的DNA/RNA序列，用于核酸雜交可檢測(cè)特定的基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。探針（probe）可以是DNA、RNA或寡核苷酸，可以是單鏈也可以是雙鏈（在使用前先變性成為單鏈）。

一、制備特異性探針?biāo)枰幕緱l件

1.被檢基因結(jié)構(gòu)清楚；

2.有明確的基因產(chǎn)物;3.已知某一基因產(chǎn)物對(duì)表型的反應(yīng)或缺少某一基因?qū)Ρ硇偷姆磻?yīng)。具備以上條件之一就可以制備特異性基因探針。二、探針的標(biāo)記

將探針標(biāo)記上一種標(biāo)識(shí)物以便雜交后檢測(cè)。常用于標(biāo)記探針的標(biāo)識(shí)物：

放射性同位素標(biāo)記（32P,35S,3H-dNTP等）：靈敏度高，成本低,但操作不便，標(biāo)記效率不太穩(wěn)定，壽命受半衰期限制

非放射性標(biāo)記（地高辛、生物素、熒光素等）：安全，標(biāo)記穩(wěn)定，探針壽命較長(zhǎng)，但靈敏度較低，背景較高，成本高1、缺口平移法（NickTranslation）原理及過(guò)程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口處按5’→3’方向切除單核苷酸；同時(shí)DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口處3’端加入底物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物中被標(biāo)記單核苷酸，并被隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。

NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP

，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP

Bio-dNTP2、隨機(jī)引物法（6核苷酸引物標(biāo)記法）

原理及過(guò)程：利用由六個(gè)核苷酸組成的序列隨機(jī)的寡核苷酸為引物，在Klenow酶的作用下對(duì)待標(biāo)記DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增。Klenow具有5’→3’聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下，以引物3’端為起點(diǎn)，沿模板3’→5’方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP,隨機(jī)摻入新合成的DNA鏈中，探針即被標(biāo)記。隨機(jī)引物標(biāo)記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP變性-復(fù)姓****探針制備****非放射性標(biāo)記：地高辛標(biāo)記地高辛可以與dNTP連接成地高辛-dUTP(UTP)等，參入DNA(RNA)的合成過(guò)程，形成地高辛標(biāo)記的DNA(RNA)探針。利用抗地高辛的抗體通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)來(lái)完成。探針檢測(cè)原理地高辛探針序列待測(cè)基因地高辛抗體酶底物產(chǎn)物探針DNA用地高辛標(biāo)記。地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個(gè)顯色反應(yīng)。地高辛抗體與地高辛結(jié)合。偶聯(lián)酶及其底物：堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增第五節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌5.1轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)5.1.1Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù).其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5,離心收集菌體

用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液懸浮菌體，離心收集菌體用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液懸浮菌體冰浴放置12-24小時(shí)，備用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100ml感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng載體的重組DNA連接液，混勻冰浴放置半小時(shí)

在42℃保溫2分鐘（熱脈沖）

快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘加入1ml新鮮培養(yǎng)基,于37℃培養(yǎng)1小時(shí)（擴(kuò)增）涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選

5.1.2細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子.酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化.

不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無(wú)水無(wú)去污劑

細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：

取0.2-1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個(gè)原生質(zhì)體）