高效液相在中藥鑒定中的應(yīng)用課件版張林小改

第五章高效液相色譜法在中藥鑒定中的應(yīng)用

第一節(jié)概述一、定義

高效液相色譜法（HighPerformanceLiquid

Chromatograph,HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初在經(jīng)典液相柱色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新型分離分析技術(shù)，系指采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。因需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法（HighPressureLiquidChromatograph）,又因分析速度快而稱高速液相色譜法（HighSpeed

Liquid

Chromatograph）。

與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別:填料顆粒細(xì)小而均勻，柱效高，但阻力大，故需用高壓輸送流動(dòng)相。二、高效液相色色譜法的分離原理（過程）

是借不同組分在兩相間親和力、吸附力、離子交換過程或分子排阻作用等差異，使溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行一種連續(xù)多次的分配（過程）而進(jìn)行分離。優(yōu)勢(shì)：可分離極性的、離子化的、不揮發(fā)的、相對(duì)分子量大的和熱不穩(wěn)定的化合物，具有用量少、分離效能高、檢測(cè)靈敏高、分析速度快、專屬性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。廣泛應(yīng)用于各種中藥的鑒別中，在中藥鑒定方面具有較好的應(yīng)用前景。

《中國(guó)藥典》2005版中，用HPLC法檢測(cè)的藥材、飲片為164種，中藥制劑308種，其品種數(shù)是2000年版的4倍多，2010版藥典也大量采用高效液相色譜方法建立藥品的鑒別、檢查和含量鑒定，該方法已成為藥典中應(yīng)用最為廣泛的含量測(cè)試技術(shù)。三、HPLC分離模式與主要分離機(jī)制分離模式主要保留機(jī)制液-固吸附吸附劑的表面吸附鍵合相溶質(zhì)在兩相間的分配或溶質(zhì)與極性固定相的吸附離子交換溶質(zhì)離子與填料上的反電荷層之間的相互作用離子對(duì)電中性離子對(duì)在兩相中的分配分子排阻基于流體動(dòng)力學(xué)體積的過濾作用手性溶質(zhì)手性異構(gòu)體與填料手性作用點(diǎn)間非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體相互作用。親和溶質(zhì)與固定化配體間生化專屬結(jié)合其中，鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來的。液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。

正相高效液相色譜法－色譜柱固定相極性大于流動(dòng)相極性。反相高效液相色譜法－色譜柱固定相極性小于流動(dòng)相極性。分配色譜正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中

中～低流動(dòng)相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出

極性大先洗出反相高效液相色譜柱材料固定相：通用十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS），簡(jiǎn)稱ODS柱或C18柱。流動(dòng)相：常用水作主體，加一定比例的甲醇、

乙腈、異丙醇、丙酮或四氫呋喃作改性劑，或以緩沖溶液作為流動(dòng)相。

第二節(jié)高效液相色譜儀

主要部件：貯液瓶、高壓輸液泵（含流動(dòng)相脫氣裝置）、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。圖1

高效液相色譜儀示意圖1-流動(dòng)相貯瓶；2-輸液泵；3-進(jìn)樣器；4-色譜柱；5-檢測(cè)器；6-廢液出口或餾分收集器；7-記錄裝置；8-過濾器圖2

高效液相色譜儀流程1-貯液罐；2-脫氣裝置；3-梯度洗脫裝置；4-高壓輸液泵5-流動(dòng)相流量顯示；6-柱前壓力表；7-輸液泵泵頭；8-過濾器；9-阻尼器；10-進(jìn)樣裝置；11-色譜柱；12-檢測(cè)器；13-數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；14-廢液貯罐

一、輸液泵(梯度泵)為HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。目前多采用梯度系統(tǒng)，又稱梯度泵泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。梯度泵的作用梯度：在操作過程中改變洗脫溶劑的組成，依分離需要可改變pH值、離子強(qiáng)度或溶劑強(qiáng)度。改變?nèi)軇┙M成，使同一種流動(dòng)相在不同比例下同時(shí)兼顧不同性質(zhì)的組分。常用于待分析樣品中含多種不同類型組分的情況。

二、進(jìn)樣器六通閥進(jìn)樣（常用）優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量準(zhǔn)確、重復(fù)性好（微量進(jìn)樣器的針為平頭，高檔儀器帶有自動(dòng)進(jìn)樣器）。三、色譜柱—HPLC系統(tǒng)的心臟作用：分離系統(tǒng)的核心部分分類：正相色譜柱和反相色譜柱常用色譜柱：中藥所含成分多為脂溶性，分析多選用反相色譜柱。反相高效液相色譜柱材料固定相：通用十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS），簡(jiǎn)稱ODS柱或C18柱。流動(dòng)相：一般選用水，再加入一定比例的甲醇或乙腈作改性劑。

四、檢測(cè)器—HPLC的三大關(guān)鍵部件之一HPLC檢測(cè)器的要求：靈敏度高、噪音低（即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感）、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣。常用檢測(cè)器：紫外（UV）、蒸發(fā)光散射（ELSD）、示差折光（RID

）

、熒光（FD）、電化學(xué)紅外、

質(zhì)譜等檢測(cè)器。1、紫外檢測(cè)器(UltravioletDetector)適用范圍：最廣。多數(shù)有紫外吸收的芳香族化合物（黃酮類、酚酸類、蒽醌類、部分生物堿類等）。限制：1.沒有紫外吸收的物質(zhì)不能檢測(cè)；2.盡量選擇在檢測(cè)波長(zhǎng)下沒有背景吸收的流動(dòng)相。紫外檢測(cè)器分類：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)紫外檢測(cè)器?？勺儾ㄩL(zhǎng)型檢測(cè)器。二極管陣列檢測(cè)器等。2．通用型檢測(cè)器適用范圍（化合物）無紫外吸收的化合物（多糖、單糖及部分蛋白）紫外吸收較弱（ε＜100）的化合物（黃芪甲苷等），流動(dòng)相在短波長(zhǎng)處有干擾。被測(cè)成分濃度較低，信噪比太低而無法使用紫外檢測(cè)器。（1）示差折光檢測(cè)器（RID

）

優(yōu)點(diǎn)：最先使用且用途最廣。所有化合物均具有折射率，理論上可適用于中藥中所有成分。

缺點(diǎn)（局限性）：不可用RID進(jìn)行梯度洗脫，因流動(dòng)相成分（含溶液和添加劑）具明顯折光效應(yīng)。溫度、流動(dòng)相中溶入氣體等因素均會(huì)產(chǎn)生折光效應(yīng)而限制RID的應(yīng)用。

（2）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）適用條件：某些無紫外吸收、又不適用RID示差檢測(cè)的中藥成分，主要用于糖類、高分子化合物、高級(jí)脂肪酸、維生素及甾體類等化合物。

ELSD檢測(cè)器的檢測(cè)原理：組分隨流動(dòng)相進(jìn)入霧化器而被霧化為小霧粒，霧粒進(jìn)入可控蒸發(fā)器，使流動(dòng)相氣化蒸發(fā)而剩下微小組分顆粒，組分顆粒穿過光束產(chǎn)生光散射，散射光經(jīng)光電二極管接收后轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。若流動(dòng)相恒定，散射光通量與流通池中組分的量成正比（定量分析）。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高（檢測(cè)限10ng）；②對(duì)流動(dòng)相溫度不敏感；③溶劑無干擾，可進(jìn)行梯度洗脫；④無需校正即可定量（質(zhì)量型檢測(cè)器），可同時(shí)測(cè)定各種組分。應(yīng)用ELSD時(shí)應(yīng)注意的問題：①檢測(cè)組分應(yīng)為非揮發(fā)性，而流動(dòng)相應(yīng)為易揮發(fā)

性溶劑。②以緩沖溶液作為流動(dòng)相時(shí)其必須具揮發(fā)性且緩沖液濃度盡可能低。③常用緩沖液組成：醋酸、甲酸、三氟醋酸、硝酸銨和磷酸氫二銨等組成。3．其他類型的檢測(cè)器（自學(xué)）熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等

四、數(shù)據(jù)處理裝置－記錄色譜圖1、保留時(shí)間（tR）：可作定性指標(biāo)。2、峰高或峰面積：與樣品組分的濃度成正比，可作定量指標(biāo)。第三節(jié)高效液相實(shí)驗(yàn)方法與評(píng)價(jià)

一、反相高效液相色譜法的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)

主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、溶劑及供試樣品的純化

2、色譜柱的保護(hù)

3、色譜柱的平衡

4、色譜柱的清洗與再生

1、溶劑及供試樣品的純化流動(dòng)相及改性劑的選用流動(dòng)相主體：通常以二次蒸餾水為基礎(chǔ)溶劑，最好用超純水，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等，最好用色譜級(jí)試劑。1、溶劑及供試樣品的純化流動(dòng)相純化：出廠前已用0.25μm微孔濾膜過濾（早期曾用0.45μm微孔濾膜及G4微孔玻璃漏斗過濾），使用前必須經(jīng)0.45μm(或0.22μm)微孔濾膜濾過。

供試樣品純化：以0.45μm微孔濾膜過濾。目的：防止微粒雜質(zhì)堵塞流路或柱入口墊片。2、色譜柱的保護(hù)使用不當(dāng)所致的不良現(xiàn)象：①理論塔板數(shù)下降、②色譜峰型變壞、③柱壓力降

增大等，縮短色譜柱壽命。延長(zhǎng)色譜柱壽命的措施：柱前連接內(nèi)徑2～3mm、長(zhǎng)度不超過3cm的小型保護(hù)柱，填料與主柱相同。3、色譜柱的平衡在貯存運(yùn)輸過程中，反相色譜柱的保護(hù)溶劑（乙腈－水）因揮發(fā)使固定相填料的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而影響分離效果。故新柱須平衡方可使用。

色譜柱的平衡方法①以純乙腈或甲醇作流動(dòng)相低速（0.2mL/min）將

色譜柱平衡過夜（此期間需斷開檢測(cè)器）。②逐漸增加流速至0.8mL/min沖洗30min，直到獲

得穩(wěn)定的基線，使填料充分平衡至最佳狀態(tài)，確保柱的使用壽命并獲良好結(jié)果和重現(xiàn)性。4、色譜柱的清洗與再生被測(cè)樣本保留在柱中的雜質(zhì)組分：無機(jī)鹽、脂肪、

蛋白質(zhì)等。雜質(zhì)在柱內(nèi)積聚將會(huì)影響柱效。雜質(zhì)影響柱效的表現(xiàn)：寬峰、基線擾動(dòng)、基線漂

移、柱壓不穩(wěn)等。常規(guī)（普通）洗脫：以20倍柱體積的甲醇、乙腈四氫呋喃等強(qiáng)洗脫溶劑洗脫。強(qiáng)化洗脫步驟：100％甲醇→100％乙腈→

75％乙腈－25％異丙醇→100％異丙醇→

100％二氯甲烷。以上強(qiáng)化步驟每種洗脫劑至少需10倍柱體積的

量，流速1～2mL/min。清洗后返回原始流動(dòng)相，亦可按相反方向沖洗。清洗注意事項(xiàng)：以二氯甲烷清洗后必須用異丙醇再次清洗才可使用含水流動(dòng)相，否則不能混溶。異丙醇粘度高，流速不宜過高，以免超壓。若流動(dòng)相含無機(jī)鹽緩沖液，可能會(huì)析出結(jié)晶堵塞管路而造成柱壓升高、峰分裂、拖尾等現(xiàn)象。流動(dòng)相含無機(jī)鹽緩沖液的清洗措施：

以高含水溶劑按極性梯度清洗（C18柱不可用純水沖洗，否則影響其鏈狀分子結(jié)構(gòu)，應(yīng)在水中加入5

％～10％甲醇或乙腈沖洗）。二、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1、容量因子：計(jì)算公式：tR為保留時(shí)間；tM為死時(shí)間。組分恒定的流動(dòng)相洗脫：時(shí)，分離效果最佳，原則上k/≤20，否則需考慮更換洗脫系統(tǒng)。2.分離度R：（可從軟件中讀得數(shù)據(jù)）定量分析：R＞1.5結(jié)構(gòu)相似的兩種物質(zhì)：R＜1.53.不對(duì)稱（拖尾）因子：考察峰形是否對(duì)稱的指標(biāo)完全對(duì)稱的峰形：一般要求：。4、理論塔板數(shù)n：一般要求：n＞3000（中藥分析）n越高則表明柱效越好，分離效果好。三、方法學(xué)論證1、線性關(guān)系的考察：測(cè)定對(duì)照品不同進(jìn)樣量下所得出的峰面積，以進(jìn)樣量為x軸，峰面積為y軸，計(jì)算回歸方程，一般要求r＞

0.995。

2、精密度考察：取同一份樣品進(jìn)樣數(shù)次（5次或以上），每次進(jìn)樣量相同，計(jì)算幾次所得峰面積的RSD，一般要求RSD<2％。

3、穩(wěn)定性考察：取同一份樣品，相隔若干時(shí)間進(jìn)樣（一般24小時(shí)內(nèi)共測(cè)定6次或以上），每次進(jìn)樣量相同，要求幾次所得峰面積的RSD≤2％。可認(rèn)為該成分24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。4、重復(fù)性考察：取同一份樣品，按相同提取、純化等方法，平行實(shí)驗(yàn)5次或以上，要求每次實(shí)驗(yàn)所測(cè)得峰面積的RSD≤

3％，方可用于定量分析。5、回收率考察：在已知含量的樣品中加入已知量的對(duì)照品，按照相同的提取、純化等方法，平行實(shí)驗(yàn)5次或以上，計(jì)算平均回收率，一般要求回收率應(yīng)在95％～105％之間（衡量實(shí)驗(yàn)方法和操作對(duì)樣品損失程度的大?。?。

四、高效液相色譜法鑒別中藥的注意事項(xiàng)（一）、根據(jù)中藥所含成分的性質(zhì)選擇合適的分離

方法（正相或反相）。（二）、根據(jù)擬檢測(cè)成分的特性，選擇適宜的色譜柱流動(dòng)相。（三）、檢測(cè)成分的選擇被測(cè)中藥：?jiǎn)挝端幉幕驈?fù)方制劑。單味藥材：選用該藥材的主要有效成分、毒性成

分或影響療效的化學(xué)成分作為鑒別指標(biāo)。中藥復(fù)方制劑：選擇其中主藥（君藥）、輔藥（臣藥）作為主要對(duì)象，其次選毒劇藥及貴重藥材（四）、供試品溶液的制備方法1、中藥樣品前處理：選用適當(dāng)提取方法，并對(duì)所提樣品進(jìn)行初步凈化等。2、提取溶劑：選用對(duì)目標(biāo)成分溶解度大而雜質(zhì)成

分溶解小的溶劑。3、常用提取方法：冷浸法、連續(xù)回流法和超聲波

提取法等。樣品的凈化：組成簡(jiǎn)單的樣品：直接以HPLC鑒別。復(fù)雜成分的樣品：需先凈化。常用凈化方法：液液萃取法。沉淀法。蒸餾法。色譜法等。預(yù)處理柱：進(jìn)口：Merck廠的Extrelut（硅藻土）、美國(guó)BondElutColumn（硅膠，C8，C18，CCN，鍵合相等）、Waters公司的Sep-Pak柱。國(guó)產(chǎn)：PT一系列預(yù)處理柱等。以上預(yù)處理柱使用方便，操作簡(jiǎn)單，凈化效率高。

（五）、其他注意事項(xiàng)：測(cè)定條件選擇：溶劑的選擇、流動(dòng)相的選擇、色譜柱的選擇及檢測(cè)器的選擇等。1、流動(dòng)相的一般要求：①純度要高，一般使用色譜級(jí)的溶劑。②對(duì)樣品要有適宜的溶解度。③溶劑的黏度要小。④與檢測(cè)器相匹配。

流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。

2、樣品溶劑要求（溶解試樣的溶劑要求）：①對(duì)樣品溶解度大。②對(duì)樣品穩(wěn)定。③與檢測(cè)器相匹配。④

最好與流動(dòng)相相同，即可允許大的進(jìn)樣量又不影響待測(cè)物的洗脫。⑤為提高分離效果及保持pH，有時(shí)可用緩沖溶液。常用緩沖溶液：醋酸鹽和磷酸鹽緩沖溶液。3、監(jiān)測(cè)器的選用要求：樣品有紫外吸收時(shí)選用紫外監(jiān)測(cè)器，鑒別中藥選用紫外檢測(cè)器者占95％以上。檢測(cè)樣品所用波長(zhǎng)的選擇：檢測(cè)樣品所用吸收波長(zhǎng)須大于溶劑的截止波長(zhǎng)，常見溶劑的截止波長(zhǎng)見表1。表1

常見溶劑的截止波長(zhǎng)

溶劑截止波長(zhǎng)／nm溶劑截止波長(zhǎng)／nm水，環(huán)己烷，乙腈200三氯甲烷，乙酸245～250甲醇，乙醇，異丙醇，正丁醇，硫酸（96％），乙醚210四氯化碳，甲酸甲酯，乙酸乙酯260正己烷，對(duì)二氧六環(huán)220苯，甲苯，二甲苯290甘油，二氯甲烷235丙酮，丁酮，吡啶，二硫化碳335小結(jié)：用HPLC鑒別中藥應(yīng)根據(jù)其分析目的、樣品性質(zhì)和含量、現(xiàn)有設(shè)備條件等選擇合適方法。五、DIONEX

P680型高效液相色譜儀操作流程

1．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備2.開機(jī)3.程序設(shè)置4.色譜圖的實(shí)時(shí)觀察和樣品分析5.數(shù)據(jù)處理6.洗柱7.關(guān)機(jī)第三節(jié)高效液相色譜法在中藥鑒別中的應(yīng)用一、高效液相色譜法在定量測(cè)定中的應(yīng)用高效液相色譜法在《中國(guó)藥典》中對(duì)中藥的鑒別主要是進(jìn)行含量測(cè)定，以供試品與對(duì)照品的保留時(shí)間一致進(jìn)行鑒別。（一）大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚等成分的含量測(cè)定（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1％磷酸溶液（85:15）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)≥3000。

（2）對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆薈大黃素對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1ml含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各80μg,大黃素甲醚40μg的溶液；分別精密量取上述對(duì)照品溶液各2ml，混勻，即得（每1ml中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16ug，含大黃素甲醚8μg）。

（3）供試品溶液的制備取本品粉末（過四號(hào)篩）約0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8％鹽酸溶液10ml，超聲處理2分鐘，再加三氯甲烷10ml，加熱回流1小時(shí);放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取三次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（4）測(cè)定法

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。本品按干燥品計(jì)算，含蘆薈大黃素（C15H10O5）、大黃酸（C15H8O6）、大黃素（C15H10O5）、大黃酚（C15H10O4）和大黃素甲醚（C16H12O5）的總量不得少于1.5％。

（二）一清顆粒中黃芩苷的含量測(cè)定（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.7）（42:58）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

（2）對(duì)照品溶液的制備精密稱取黃芩苷對(duì)照品12.5mg，置250ml量瓶中，加甲醇10ml使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml含黃50μg）。

（3）供試品溶液的制備取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約0.75g，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇10ml，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）10分鐘，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

（4）測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。本品每袋含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計(jì)，不得少于21mg。

（三）不同產(chǎn)地黃柏藥材的質(zhì)量分析1儀器與試劑儀器：島津LC-10ATvp高效液相色譜儀，島津SPD-10Avp紫外檢測(cè)儀，AlltimaC184.6mm×250mm。試劑：乙腈（色譜純），磷酸（分析純），十二烷基磺酸鈉（分析純），鹽酸小檗堿對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）。樣品：黃柏藥材（分別由不同產(chǎn)地藥材公司提供并鑒定）。

2對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取在100℃干燥5h的鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成約5μg/ml的溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備取本品藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.1g，精密稱定，置100ml容量瓶中，加入流動(dòng)相80ml，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）40min，放冷，再用流動(dòng)相補(bǔ)足至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3方法與結(jié)果3.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇取對(duì)照品溶液在200～450nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定其吸收光譜，結(jié)果表明其在346nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇此波長(zhǎng)作為鹽酸小檗堿的測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

固定相：AlltimaC184.6mm×250mm。流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100ml加十二烷基磺酸鈉0.1g）；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：346nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μl。理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)算應(yīng)不低于4000。

3.3線性關(guān)系考察

精密稱取經(jīng)100℃干燥5h的鹽酸小檗堿對(duì)照品5.15mg，置100ml量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，再取20ml用流動(dòng)相稀釋到100ml，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、5.0ml、8.0ml、10ml分別至10ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按含量測(cè)定項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定；以峰面積（S）對(duì)濃度（C）做二元一次線性回歸，得回歸方程S=108730·C+9363.7（r=0.9998），結(jié)果表明：鹽酸小檗堿濃度范圍在1.03～10.3μg/ml之間峰面積（S）與濃度（C）線性關(guān)系良好。

圖X-8

鹽酸小檗堿對(duì)照品HPLC圖圖X-9

黃柏藥材HPLC圖3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液20μl，分別在0、3、6、9、12h按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積積分值。得RSD為1.12%。3.5精密度試驗(yàn)精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液20μl，按上述色譜條件進(jìn)樣6次，記錄峰面積積分值。RSD為0.98%。

3.6回收率試驗(yàn)精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成一定濃度的溶液，分別精密移取等量，加入到已知含量的6份樣品中，按供試品溶液制備方法制得6份供試品溶液，照含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算回收率，數(shù)據(jù)見表X-4。

表X-4加樣回收試驗(yàn)（n=6）3.7樣品含量測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各20μl，按上述色譜條件，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，取平均值，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中鹽酸小檗堿含量，本品按干品計(jì)算，含小檗堿以鹽酸小檗堿計(jì)算（C20H17NO4·HCL），得各產(chǎn)地黃柏藥材中小檗堿的平均含量見表X-5。

表X-5各產(chǎn)地黃柏藥材中小檗堿的含量測(cè)定結(jié)果表X-5實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各產(chǎn)地黃柏藥材中小檗堿含量存在差異，除產(chǎn)地地理環(huán)境的影響外，也受采收季節(jié)，樹齡及加工方法等因素影響，而《中國(guó)藥典》2005年版一部對(duì)黃柏藥材中小檗堿的含量定在以鹽酸小檗堿計(jì)（C20H17NO4·HCL）不得少于3.0%，可通過進(jìn)一步研究為黃柏道地藥材優(yōu)良品系繁育和GAP基地建設(shè)奠定基礎(chǔ)。4討論二、高效液相色譜法在中藥材定性鑒定中的應(yīng)用

西青果與訶子均為使君子科訶子屬植物的果實(shí)，前者為幼果，后者為成熟果實(shí)。西青果主要靠進(jìn)口，品種僅是訶子屬的單一品種。訶子的品種則較復(fù)雜，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，全世界約有200種，中國(guó)產(chǎn)8種，入藥3～4種。（一）西青果與訶子的HPLC指紋圖譜鑒別研究《中國(guó)藥典》與進(jìn)口藥材部頒標(biāo)準(zhǔn)收載訶子有兩種：一種是訶子（TerminaliachebulaRetz.），另一種是絨毛訶子（TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.）的干燥成熟果實(shí)。

訶子的化學(xué)成分主要分為四類，即鞣質(zhì)類、三萜類、酚酸類、脂肪族類化合物。鑒于鞣質(zhì)為訶子類藥材的主要化學(xué)成分，含量高達(dá)23％～37％，故采用高效液相色譜法對(duì)該類成分進(jìn)行分析比較，為西青果與訶子以及不同品種訶子的鑒別提供依據(jù)。

（1）色譜條件色譜柱：LiChrospherRP-C18（4mm×125mm）色譜柱；流動(dòng)相：以流動(dòng)相A[0.05mol/L的磷酸溶液與0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液（1:1）]，流動(dòng)相B（甲醇），流動(dòng)相C（醋酸乙酯），梯度洗脫；流速：1ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。（2）結(jié)果與分析各供試品的色譜圖見圖X-3及圖X-4。為便于辨認(rèn)和分析比較，將色譜圖分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)區(qū)：第Ⅰ區(qū)包括1～3號(hào)峰（保留時(shí)間2～10.6min）、第Ⅱ區(qū)包括4～11號(hào)峰（保留時(shí)間11～22.5min）、第Ⅲ區(qū)包括12～20號(hào)峰（保留時(shí)間23～40min）。圖X-3西青果和訶子的HPLC指紋圖譜第I區(qū)和第II區(qū)色譜峰行為較相似，但第III區(qū)色譜峰行為相差較大，具有較顯著的鑒別意義。

7種訶子的色譜圖見圖X-4，訶子、大訶子、小訶子及恒河訶子的峰較豐富，第I、II、III區(qū)均有較多峰，而其余3種僅有第I區(qū)特征峰〔1號(hào)峰、2號(hào)峰（沒食子酸）、3號(hào)峰〕，第II、III區(qū)在同樣進(jìn)樣量的情況下基本沒有明顯的色譜峰。

圖X-47個(gè)品種訶子的HPLC色譜圖圖X-4所表示的7種訶子：(a)訶子(TerminaliachebulaRetz.)；(b)大訶子(T.chebulaRetz.f.maccrocarpa)；(c)小訶子(T.chebulavar.parviflora)；(d)恒河訶子(T.chebulavar.gangetica)；(e)絨毛訶子(T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.)；(f)毛訶子(T.abellirica)；(g)銀葉訶子(T.argyrophylla)結(jié)論：不同品種訶子其鞣質(zhì)類成分的種類及其含量存在差異，在HPLC色譜圖中形成各自的“面貌”特征。以此為依據(jù)，可鑒別出不同品種訶子。

(二)不同產(chǎn)地半枝蓮藥材及其混淆品HPLC指紋圖譜研究

1儀器與試藥1.1儀器與試劑Waters1525高效液相色譜儀；Waters2487檢測(cè)器（UV）；Empower工作站；SCQ-200超聲波清洗器（上海聲譜超聲波設(shè)備廠）；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)迪馬公司）；水為二次重蒸水；其它試劑均為分析純。

1.2對(duì)照品與供試藥材樣品表X-2半枝蓮的來源野黃芩苷對(duì)照品；黃芩素對(duì)照品；漢黃芩素對(duì)照品；木犀草素對(duì)照品；半枝蓮對(duì)照藥材，由中國(guó)藥品生物制品檢定提供。

本試驗(yàn)收集了30種不同產(chǎn)地的半枝蓮藥材及其混淆品樣品，來源見表X-2。

表X-2半枝蓮樣品的來源表X-2半枝蓮樣品的來源(續(xù)表)2實(shí)驗(yàn)方法2.1色譜條件色譜柱DiamonsilTMC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-乙腈50：50（A）-0.05磷酸（B）梯度洗脫，線性洗脫程序?yàn)?-36min，30-46A，36-40min，46-55A；40-45min，55A；45-65min，55-90A；65-75min，90-30A。檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為1.0mL/min，柱溫為35°C，進(jìn)樣量20μL。

2.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)取上述供試液20μL注入液相色譜儀記錄色譜圖按野黃芩苷峰計(jì)算理論板數(shù)約為6000，與其它色譜峰分離度大于1.5。2.3對(duì)照品溶液的制備取野黃芩苷、木犀草素、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成1mL中分別含0.1mg的混合溶液，即得2.4供試品溶液的制備取半枝蓮藥材，粉碎，過60目篩，取約0.2g，精密稱定，精密加入60%乙醇25mL，超聲提取1h，放冷至室溫，再稱定重量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻。用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

2.5精密度試驗(yàn)取6號(hào)半枝蓮樣品粉末，精密稱定，按2.4項(xiàng)方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜。將指紋圖譜信號(hào)數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A），計(jì)算6次進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度。結(jié)果表明，6次進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度均高于0.97，符合指紋圖譜測(cè)定要求，精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取6號(hào)半枝蓮樣品粉末6份，精密稱定，按2.4方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。計(jì)算6份樣品所得指紋圖譜的相似度。結(jié)果表明，6份樣品所得指紋圖譜的相似度均高于0.98，符合指紋圖譜測(cè)定要求，重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取6號(hào)半枝蓮樣品粉末適量，精密稱定，按2.4方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12，24h進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算24h內(nèi)進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度。結(jié)果表明，24h內(nèi)進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度均高于0.96，符合指紋圖譜測(cè)定要求，穩(wěn)定性良好。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1不同產(chǎn)地半枝蓮藥材指紋圖譜的建立取不同來源的半枝蓮藥材（1～24號(hào)樣品），按2.4方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄各樣品在75min內(nèi)的指紋圖譜，14個(gè)共有峰被標(biāo)定，見圖X-5。圖X-5

HPLC-UV色譜圖

A.半枝蓮樣品B.對(duì)照品6.野黃芩苷12.木犀草素14.黃芩素15.漢黃芩素圖X-6

為24批不同來源半枝蓮藥材的指紋圖譜（圖X-6）。圖X-6

24批不同來源半枝蓮藥材的指紋圖譜

S1～S24：1～24號(hào)樣品S1：對(duì)照藥材

S.野黃芩苷R.共有模式

取混淆品（25～30號(hào)樣品），同法制備供試品溶液，進(jìn)樣，獲得6批不同來源半邊蓮藥材的指紋圖譜（圖X-7）。圖X-7

6批混浠品半邊蓮的指紋圖譜

S1～S6：25～30號(hào)樣品

3.2相似度分析采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件對(duì)從各地購(gòu)得的半枝蓮藥材的指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生成對(duì)照指紋圖譜為對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算各樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度。相似度計(jì)算結(jié)果見表X-3。根據(jù)相似度分析結(jié)果，24個(gè)半枝蓮藥材的相似度均在0.7以上。

表X-3不同來源半枝蓮樣品的相似度評(píng)價(jià)4討論4.1圖X-5標(biāo)定了14個(gè)共有峰，為1到13及16號(hào)峰，指認(rèn)了4個(gè)色譜峰，6號(hào)峰為參照物野黃芩苷，12、14、15號(hào)峰分別為木犀草素、黃芩素和漢黃芩素。圖X-5

HPLC-UV色譜圖

A.半枝蓮樣品B.對(duì)照品6.野黃芩苷12.木犀草素14.黃芩素15.漢黃芩素4討論4.2表X-3可見，24個(gè)半枝蓮藥材的相似度均在0.7以上。其中10批在0.9以上，11批在0.8-0.9之間，只有3批在0.7-0.8之間。結(jié)果表明，各樣品間相似度有一定差異。表X-3不同來源半枝蓮樣品的相似度評(píng)價(jià)4.3對(duì)樣品圖譜進(jìn)行分析可以看出，各個(gè)樣品中主要的色譜峰基本一致，但各峰的面積差異較大?？梢?，不同產(chǎn)地半枝蓮成分組成基本一致，但各成分的含量