微生物學(xué)：15四體+真菌

螺旋體的檢驗(yàn)

P237

重慶醫(yī)科大學(xué)Lunan

一、概述

螺旋體（Spirochete）是一類細(xì)長、柔軟、彎曲呈螺旋狀，運(yùn)動活潑的原核細(xì)胞型微生物。

生物學(xué)性狀介于細(xì)菌與原蟲之間。

似細(xì)菌：有CW，原始核，二分裂方式繁殖，對抗生素敏感，可人工培養(yǎng)。

似原蟲：運(yùn)動有賴于菌體內(nèi)鞭毛的屈曲與收縮。所致疾病能周期性再發(fā)。

第一節(jié)分類分子生物分類的發(fā)展2004年《伯杰細(xì)菌分類手冊》將螺旋體分為1目3科13屬

螺旋體廣泛存在自然界和動物體內(nèi)，種類多，

致病性螺旋體主要有下述3個(gè)屬：

疏螺旋體屬（Borrelia）密螺旋體屬（Treponema）鉤端螺旋體屬（leptospira）

問號狀鉤端S→野鼠、豬（儲存宿主）→腎→尿→水→疫水→接觸易感者的破損皮膚粘膜→鉤體病，國內(nèi)以該種S為主。雙曲鉤端S→接觸感染者的破損皮膚粘膜→一般不致病

第二節(jié)鉤端S屬（Leptospira）一、臨床意義

鉤體病是一種典型的人獸共患?。蝗澜缰辽僖寻l(fā)現(xiàn)200多種動物為問號狀鉤體的攜帶者。鉤體病遍布世界各地，我國也是一個(gè)常見病和多發(fā)病，秋收季節(jié)（打谷時(shí)）高發(fā)，故又名打谷黃。早期臨床癥狀為：寒熱、酸痛、一身Pa、眼紅、腿痛、淋巴大（有差異）。

其他癥狀：P238二、鉤端螺旋體的檢驗(yàn)

鉤端S型別多，型與型之間無交叉免疫，應(yīng)用暗視野顯微鏡凝集溶解試驗(yàn)（MAT）和凝集吸收試驗(yàn)（AAT）可將鉤端S屬進(jìn)行血清群和血清型分類。

目前把問號狀鉤體至少分為25個(gè)血清群，273個(gè)血清型，我國使用的問號狀鉤體參考菌株有15群15型，其中大多數(shù)為我國流行的群或型，參見表16-2。

（一）檢驗(yàn)程序(圖16-2)

直接鏡檢，分離培養(yǎng)，動物實(shí)驗(yàn)

（二）標(biāo)本采集

發(fā)病第一周內(nèi)采血液1-2ml。

發(fā)病第二周開始采尿（30-50ml）和腦脊液（0.5-1.0ml）。

測Ab采雙份血清（6-10天，3-4周各采一次）

尸檢時(shí)采肝、腎、腦、肺等臟器。

（三）標(biāo)本直接鏡檢

1、直接顯微鏡觀察

①標(biāo)本→差速離心→沉淀→1滴+蓋破片→暗野觀察

②標(biāo)本→鍍銀染色（S+AgNO3+甲醛）→普通顯微鏡觀察：S呈棕色

③標(biāo)本→直接免疫熒光法→熒光顯微鏡觀察

2、核酸檢測DNA探針檢測標(biāo)本中鉤體核酸可檢出含有200條鉤體的標(biāo)本。加用PCR技術(shù)擴(kuò)增鉤體特異DNA片段：23sDNA，可檢測出全血、血清、腦脊液、尿液可檢出10條鉤體；引物序列：P241；（四）分離培養(yǎng)

標(biāo)本（血，尿）→柯氏（Korthof）培養(yǎng)基（28~30℃1周）→云霧狀混濁→暗野顯微鏡觀察→有鉤體存在→已知診斷的血清→鑒定其血清群和型。若無鉤體存在→繼續(xù)培養(yǎng)30天，仍無鉤體生長→則判為陰性。

目的意義：

（1）可確診病人。

（2）查明鉤體菌型的分布狀態(tài)，疫源地存在的特點(diǎn)和研制相應(yīng)的疫苗，進(jìn)而為防控鉤體病的流行提供可靠資料。

（3）充實(shí)國家標(biāo)準(zhǔn)菌株。

（五）抗體檢測

采取疑似病人發(fā)病初期和3-4周的雙份血清或腦脊液，56℃30min滅活。

1、顯微鏡凝集溶解試驗(yàn)：測疑似鉤體病人雙份血清中的Ab效價(jià)，一般效價(jià)>1：300有診斷意義，或雙份血清效價(jià)增高4倍以上，則可確診本病。

原理：鉤體病人血清中同時(shí)存在凝集素和溶解素，故在凝集反應(yīng)的同時(shí)往往伴有溶解現(xiàn)象。

用途：因本試驗(yàn)具有高度型的特異性，故可用已知Ag測未知Ab，也可用已知Ab來鑒定未知Ag，從而協(xié)助鉤體病的診斷或分型。

方法：

（1）用PBS倍比稀釋患者血清（0.1ml/管）：

1：50、1：100、1：200……1：1600

（2）加入等量活鉤體Ag(0.1ml/管)：

輕搖混均，28~30℃2小時(shí)。

（3）于暗視顯微鏡下判鉤體的效價(jià)

“1+”25%的菌體凝集

“2+”50%以上菌體凝集或溶解

“3+”75%以上菌體凝集或溶解

“4+”近100%菌體凝集或溶解

“—”全部菌體正常，與鹽水對照相同。

結(jié)果：Ab效價(jià)>1：300或雙份血清Ab效價(jià)相差4倍以上為陽性。

2、間接凝集試驗(yàn)

鉤體屬特異Ag→載體（乳膠顆粒、活性碳、干血細(xì)胞）→（致敏顆粒）+病人血清（Ab）→載體的間接凝集。

3、ELISA

用ELISA法和IgM-斑點(diǎn)-ELISA法可間接檢測鉤體病人血清中特異Ab，可用于鉤體病的快速診斷。被檢血清須經(jīng)56℃30min滅活，當(dāng)OD值為陰性對照血清OD值的2倍時(shí)為陽性。也可用肉眼直接觀察結(jié)果。

（六）動物試驗(yàn)

幼齡豚鼠或金地鼠對鉤體敏感，稱為鉤體的“生物濾器”，故可用來檢查疫水或有雜菌污染的標(biāo)本。但費(fèi)用高，操作復(fù)雜。

防治措施：“三早一就”。防鼠滅鼠，保護(hù)水源，接種疫苗等。

伯氏S→硬蜱（媒介）→萊姆?。╨ymedisease）：游走性紅斑，圓形皮損，發(fā)熱，頭痛。

第三節(jié)疏S屬（Borrelia）：萊姆病檢驗(yàn)螺旋稀疏且兩端稍尖；周漿鞭毛有2~100根以上，與運(yùn)動有關(guān)；Giemsa染色為淡紫色，鍍銀染色為棕褐色；營養(yǎng)要求高，微需氧，5%~10%CO2促進(jìn)生長，常用BSK培養(yǎng)基（長鏈飽和與不飽和脂肪酸，氨基酸和牛血清蛋白及滅活兔血清等），生長緩慢；奮森S→梭b協(xié)同→機(jī)體免疫力下降→奮森咽峽炎、牙齦炎、口頰壞疽、潰瘍性口腔炎?；貧w熱流行性回歸熱(虱傳回歸熱)地方性回歸熱(蜱傳回歸熱)反復(fù)發(fā)熱緩解3-10次蒼白(梅毒)亞種→性傳播→梅毒(STD)

地方亞種→粘膜損傷→地方性梅毒

極細(xì)(雅司)亞種→接觸皮損→雅司病第四節(jié)密S屬（Treponema）品他S→皮損→品他病蒼白S：分三個(gè)亞種梅毒（syphilis）

只感染人類：性病梅毒，先天梅毒，輸血后梅毒。性病性梅毒按照病程分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期早期

Ⅰ期梅毒：傳染性極強(qiáng)，無痛性硬下疳。一年

Ⅱ期梅毒：梅毒疹，淋巴結(jié)腫大。十年

Ⅲ期梅毒：傳染性小但破壞性大，神經(jīng)梅毒，心血管梅毒，梅毒瘤最常見?；静∽兪锹匀庋磕[。梅毒螺旋體的檢驗(yàn)

（一）標(biāo)本的采集

下疳分泌物，皮疹滲出液，組織塊→組織懸液，血清或血漿（4℃或-20℃送檢）。

（二）檢驗(yàn)程序：圖16-6

（三）檢驗(yàn)方法

1、直接鏡檢

標(biāo)本→玻片→暗視野顯微鏡→有幼小的密螺旋體，有診斷意義。也可用鍍銀法或直接熒光檢測法。

免疫熒光染色鍍銀染色2、分離培養(yǎng)

棉尾兔上皮細(xì)胞在1.5%O2、5%CO2、93.5%N233℃條件下經(jīng)9-12天獲培養(yǎng)成功，并保持毒力，但條件高，僅適用實(shí)驗(yàn)室研究。必要時(shí)可作兔睪丸接種保存菌種，但毒力消失。

3、PCR

多個(gè)靶基因，常規(guī)用PCR，巢氏PCR，熒光PCR。診斷血清學(xué)陰性的早期梅毒和神經(jīng)梅毒，以及區(qū)分胎傳梅毒和母體梅毒有意義。

4、血清學(xué)試驗(yàn)

由于潛伏期和晚期梅毒不出現(xiàn)皮膚粘膜病損，得不到直接檢出的標(biāo)本，加之梅毒螺旋體不能在體外迅速分離和生長，所以血清學(xué)試驗(yàn)非常重要。有兩個(gè)試驗(yàn)類型的試驗(yàn)：

(1)非密螺旋體Ag：用牛心肌的心脂質(zhì)作為Ag測病人血清中的反應(yīng)素（抗脂質(zhì)Ab），陽性率高，有診斷價(jià)值，常用有2種試驗(yàn)（VDRL、RPR）。

(2)密螺旋體Ag試驗(yàn)：用密螺旋體Ag檢測病人血清中特異Ab，有5種試驗(yàn)（FTA-ABS、FTA-ABSDS、MHA-TP、ELISA和IBT），由于梅毒螺旋體和雅司螺旋體Ag相似，故血清學(xué)試驗(yàn)不能區(qū)別這些密螺旋體所致疾病。此外自身免疫性疾病有時(shí)也可以出現(xiàn)假陽性。

上述血清學(xué)試驗(yàn)的選擇原則：

WHO初篩試驗(yàn)：VDRL、RPR，

確認(rèn)試驗(yàn)：FTA-ABS、FTA-ABS-DS、

MHA-TP、ELISA和IBT。

對疑為先天性梅毒者：

可用RPR半定量試驗(yàn)每月檢測一次，連續(xù)6個(gè)月，檢測反應(yīng)素效價(jià)?；蛴肰DRL定量試驗(yàn)檢測Ab效價(jià)的變化。如Ab效價(jià)增高或穩(wěn)定在高水平，表明是先天梅毒，如Ab是來自母體IgG，通常2-3月內(nèi)消失。

瓦氏反應(yīng),Wassermannreaction利用抗原抗體復(fù)合物同補(bǔ)體結(jié)合，把含有已知濃度的補(bǔ)體反應(yīng)液中的補(bǔ)體消耗掉使?jié)舛葴p低的現(xiàn)象，以檢出抗原或抗體的試驗(yàn)，為高敏度檢出方法之一，特別是根據(jù)抗原物質(zhì)的特性，抗原抗體反應(yīng)不能用沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng)觀察時(shí)也可以利用此法；綿羊紅細(xì)胞+抗體溶血反應(yīng)，檢測還有多少補(bǔ)體存在；思考題：

1、何謂顯微鏡凝集溶解試驗(yàn)（概念、原理、用途、方法）？

2、某地秋收季節(jié)疑有鉤體病流行，你應(yīng)如何確診病人？并采取哪些防治措施？

3、簡述梅毒病的微生物學(xué)檢驗(yàn)。

支原體的檢驗(yàn)

一、概念

支原體（Mycoplasma）是一類缺乏細(xì)胞壁、呈高度多形性，能通過除菌濾器，在無生命的培養(yǎng)基中能生長繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物。（能形成有分支的長絲）

缺乏CW，呈多形性（球狀、絲狀、酒瓶狀）d=0.2μm±，能通過細(xì)菌濾器，能在無生命的人工培養(yǎng)基中繁殖（二分裂法，分枝出芽……）。菌落為“油煎蛋”狀。含DNA和RNA兩種遺傳物質(zhì)。

其大小似病毒，生活方式似細(xì)菌，它是一類微小的原核M。

生物學(xué)特征

支原體與L型細(xì)菌的區(qū)別1、在遺傳上與細(xì)菌無關(guān)2、CM含高濃度膽固醇3、大多需高滲培養(yǎng)基支原體L型細(xì)菌1、與原菌相關(guān)，?？梢曰謴?fù)2、CM不含膽固醇3、在一般培養(yǎng)基穩(wěn)定4、生長慢，菌落小，d0.1-0.3mm4、菌落稍大，d0.5-1.0mm5、液體培養(yǎng)混濁度低5、液體培養(yǎng)有一定混濁度，可粘附于管壁或管底二、主要致病支原體肺炎支原體溶脲脲原體人型支原體生殖器支原體穿通支原體1、肺炎支原體——肺炎，支氣管炎，肺外并發(fā)癥（腦膜炎、心肌炎、心包炎、腎炎等）。兒童青少年居多，秋冬多發(fā)。嬰兒有間質(zhì)性肺炎時(shí)應(yīng)考慮。

2、溶脲脲原體——非淋菌性尿道炎（NGU）、不育癥、慢性前列腺炎、流產(chǎn)、不孕癥、新生兒低體重等癥。

3、生殖器支原體——可能與持續(xù)性、復(fù)發(fā)性非淋菌性尿道炎、V急性盆腔炎、陰道炎、慢性前列腺炎（泌尿生殖道感染）。

4、穿通支原體——多見于艾滋?。ㄊ羌铀貯IDS進(jìn)程的一個(gè)協(xié)同因子）

5、人型支原體——非淋菌性尿道炎、慢性前列腺炎、宮頸炎與盆腔炎。（泌尿生殖道感染）。

三、M檢驗(yàn)

采取合格標(biāo)本：病人痰、咽拭子、鼻咽洗液、支氣管分泌物、胸水；（肺炎支原體）

尿液（晨尿中段）、泌尿道分泌物、前列腺分泌物、陰道分泌物、宮頸分泌物等（脲原體）

檢驗(yàn)程序見圖17-3P256

1、直接鏡檢：EM下可發(fā)現(xiàn)d200nm大小有三層細(xì)胞膜的Giemsa染色呈淡紫色顆粒。沒有細(xì)胞壁。2、分離培養(yǎng)（營養(yǎng)要求相似細(xì)菌）：Hayflick培養(yǎng)基：牛心消化液+20%小牛血清+新鮮酵母浸膏+抑菌物+醋酸鉈+CO2，pH7.6-8.0，37℃1-4周方長出油煎蛋樣菌落（LP或HP），陽性率僅64%。

肺炎支原體“油煎蛋”菌落(10×)3、鑒定本培養(yǎng)和檢測根據(jù)肺炎支原體在宿主細(xì)胞內(nèi)代謝累積分解葡萄糖，通過化學(xué)顯色的方法在較短的時(shí)間內(nèi)快速檢測出肺炎支原體。支原體之間的鑒別（圖17-1）。

支原體葡萄糖精氨酸尿素吸附細(xì)胞致病性肺炎支原體+--紅細(xì)胞肺炎、支氣管炎泌尿生殖道感染泌尿生殖道感染人型支原體-+--生殖器支原體+---穿通支原體++-紅細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞條件感染、多見于艾滋病溶脲脲原體--+-泌尿生殖道感染4、PCR：查肺炎支原體的DNA，快速敏感、特異、防感染。（敏感。避免污染）

5、抗體檢測：ELISA（可靠，特異性和敏感性高）；冷凝集試驗(yàn)（4℃凝集，37攝氏度散開）；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)；間接血凝試驗(yàn)（肺支和生殖道支有交叉反應(yīng)）。

冷凝集試驗(yàn)

肺炎支原體引起的肺炎患者血清中常產(chǎn)生冷凝集素（非特異性自身Ab，IgM），它與2%O型人或自身的RBC，在4℃過夜，出現(xiàn)RBC凝集現(xiàn)象，效價(jià)>1：64（常規(guī)法），50%的病人發(fā)病1-2周后呈陽性反應(yīng)，是一種非特性血清學(xué)反應(yīng)。

呼吸道合胞V、腮腺炎V、流感V等感染后也可出現(xiàn)血中冷凝集素效價(jià)升高。

解脲脲原體

（Ureaplasmaurealyticum，Uu

）也稱“溶脲脲原體”。是人類泌尿生殖道最常見的寄生菌。與性接觸的多少和有無有關(guān)。液體培養(yǎng)基陽性可初步報(bào)告。檢驗(yàn)程序（圖17-5）培養(yǎng)結(jié)果相應(yīng)固體培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基中硫酸鎂與氨反應(yīng)，氫氧化鎂黑色沉淀—黑色菌落陽性陰性衣原體的檢驗(yàn)（Chlamydia）

一、概念

衣原體（Chlamydia）是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生，有獨(dú)特發(fā)育周期，能通過細(xì)菌濾器的原核細(xì)胞型微生物。

似細(xì)菌：

有兩種遺傳物質(zhì)（DNA+RNA），有核糖體和復(fù)雜的酶系統(tǒng)，有CW，二分裂法繁殖，對抗生素敏感。

似病毒：

體積微小，能通過細(xì)菌濾器，活C內(nèi)寄生。

二、致病情況

沙眼CH→沙眼，是致盲的主要原因。尚可引起包涵體結(jié)膜炎，數(shù)周或數(shù)月可痊愈。

淋巴肉芽腫CH→淋巴肉芽腫。

上述兩種CH是致嚴(yán)重的性傳播疾病之病原，引起泌尿生殖道感染。

鸚鵡熱CH→肺炎

肺炎CH→肺炎。

三、微生物學(xué)檢驗(yàn)

疑為CH感染的患者，要確定診斷必須對患者進(jìn)行CH的檢驗(yàn)。操作的實(shí)驗(yàn)室必須注意安全，以防環(huán)境污染和實(shí)驗(yàn)室感染，尤其是操作鸚鵡熱的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格按強(qiáng)毒株實(shí)驗(yàn)室管理?xiàng)l例修建和操作。

（一）直接鏡檢：

1、找包涵體：疑為沙眼CH感染，應(yīng)取眼穹窿及眼結(jié)合膜或?qū)m頸（上皮或分泌物）刮片，經(jīng)干燥固定后姬姆薩染色，查包涵體，只要查見有包涵體(密度較低，疏松，呈空泡型，內(nèi)含糖原，碘液染色呈陽性)則有診斷價(jià)值，此法簡便、快速，但敏感性差，陽性率僅為30-40%。

2、IF檢查Ag：用直接熒光Ab法檢測上皮細(xì)胞內(nèi)典型CH-Ag

（二）酶免疫檢測：檢測標(biāo)本中可溶性Ag

（三）膠體金法檢測衣原體（常用）

（四）核酸檢測：

DNA探針雜交：敏感，特異，快速，僅1h。

PCR技術(shù)：敏感、特異、快速、僅4-5h

（五）分離培養(yǎng)與鑒定

采取適當(dāng)標(biāo)本→處理→分離培養(yǎng)：

細(xì)胞培養(yǎng):（最可靠的方法）

沙眼CH、淋巴肉芽腫CH→McCoy、Hela-229。

尚可用HEP-2和H-292分離培養(yǎng)肺炎CH。

雞胚卵黃囊：沙眼CH（湯飛凡.1956）

小白鼠：鸚鵡熱CH→腹腔、滴鼻。

鑒定試驗(yàn)：

Giemsa染色→暗野鏡檢：沙眼CH成熟包涵體(主要為原體，嗜酸性)呈紫紅色，而其幼稚型包涵體(主要含始體，嗜堿性)呈暗藍(lán)色，且均位于上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。（圖18-2）

Lugol碘液染色→HP→在黃色背景上見到紅褐色胞質(zhì)內(nèi)包涵體，可作為鑒別沙眼CH與其他CH(不含糖原)的參考。

IF-Ab染色法：為特異血清學(xué)鑒定?？设b定CH的型別；

抗外膜蛋白(MOMP)單克隆抗體鑒別生殖道標(biāo)本培養(yǎng)物的沙眼CH。

抗LPS單抗用于鑒別呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)物的鸚鵡熱CH和肺炎CH。

（五）抗體檢測：

可用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF），微量免疫熒光測驗(yàn)(MIF），酶免疫法等測Ab，但在臨床診斷中價(jià)值不大。不易獲得衣原體感染者急性期、恢復(fù)期雙份血清，另性傳播疾病的高危人群原有Ab水平較高，因限制了血清學(xué)診斷CH感染的價(jià)值。

立克次體的檢驗(yàn)

一、概念

（Rickettsia）天然寄生于節(jié)肢動物體內(nèi)（虱、蚤、蜱、螨），并以節(jié)肢動物為傳播媒介進(jìn)行傳播的一類G-小桿狀或球桿狀的專性寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖的原核細(xì)胞微生物。

為了紀(jì)念因研究斑疹傷寒不幸感染而獻(xiàn)身的US青年醫(yī)生Ricketts，為紀(jì)念他的貢獻(xiàn)，便以他的名字而命名此類微生物。

立克次體的共同特點(diǎn)是：

1.大小介于細(xì)菌與病毒之間；

2.有細(xì)胞壁，但形態(tài)多樣；

3.絕大多數(shù)為專性細(xì)胞內(nèi)寄生；

4.含有DNA和RNA兩種核酸，以二分裂方式繁殖；

5.大多是人畜共患病原體，引起人類發(fā)熱出疹性疾?。?/p>

6.以節(jié)肢動物為傳播媒介或?yàn)閮Υ嫠拗鳎?/p>

7.對四環(huán)素、氯霉素等抗菌藥物敏感。

二、致病情況

1、普氏R→人虱→流行性斑疹傷寒，在世界各地流行。

2、莫氏R→鼠蚤→地方性斑疹傷寒，在世界各地流行。

3、恙蟲病R→恙螨→恙蟲熱病，在臺灣、福建、兩廣、浙江、江蘇、東南亞、日本、有報(bào)導(dǎo)。

4、貝納柯克斯體(Q熱R)→蜱→Q熱，在世界各地流行

5、埃立克體→蜱→埃立克體病

6、漢賽巴通體→接觸貓→貓抓病、桿菌性血管瘤-桿菌性紫殿（HIV，tumor，organtransplantation）……共20余種

三、M檢驗(yàn)

R的實(shí)驗(yàn)室診斷是確診R感染和進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的重要措施。R的傳染性強(qiáng)，必須注意實(shí)驗(yàn)室的安全與防護(hù)，實(shí)驗(yàn)室工作者應(yīng)事先接種疫苗，必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行藥物預(yù)防。

（一）采取合格標(biāo)本（血液，活檢或尸檢標(biāo)本）→適當(dāng)處理

（二）標(biāo)本直接檢測：

1.免疫熒光檢測:臟器印片、切片，檢測Ag；

2.核酸檢測:PCR敏感性高。

（三）分離培養(yǎng)：GP腹腔接種：發(fā)熱、陰囊腫脹；雞胚卵黃囊接種:收獲卵黃囊；細(xì)胞培養(yǎng)：HeLa、Vero…。

（四）血清學(xué)診斷（雙份血清，測Ab效價(jià)，或用已知Ab，鑒定未知Ag）：

IFA（間接免疫熒光）、ELISA、CF（補(bǔ)結(jié)）、MA（微量凝集）、IHA（間接血凝）、LA（乳膠凝集）和外斐試驗(yàn)（Weil-Felixreaction）。

外斐試驗(yàn)：

因?yàn)榻^大部分R（Q熱等除外）與某些變形桿菌（OX19、OX2、OXk）有共同的耐熱性多糖類屬Ag，所以利用變形桿菌這些菌株代替R作為Ag，檢測疑為R患者血清中相應(yīng)的Ab的一種非特異性交叉凝集反應(yīng)。用以協(xié)助R病的診斷，一般效價(jià)>1：160為陽性，若在病程中有4倍增長更有診斷價(jià)值。

特點(diǎn)：Ag易得，方法簡便；但缺乏敏感性與特異性。有試管法和玻片法兩種。

思考題：

1、簡述支原體、衣原體、立克次體的概念和基本檢驗(yàn)技術(shù)。

2、為什么衣原體、立克次體和支原體是介于細(xì)菌和V之間的M？它們可分別引起哪些疾??？

3、試比較L型菌和支原體有何異同？

4、名詞解釋：

外斐試驗(yàn)、冷凝集試驗(yàn)

真菌的檢驗(yàn)

一、概述

真菌（Fungus）為不分根、莖、葉和不含葉綠素的一大類真核細(xì)胞微生物。

真菌分布廣，種類多。目前公認(rèn)的有8000個(gè)屬，100萬個(gè)種。

大多真菌對人類是有益的，其中有些真菌為人類創(chuàng)造了巨大的物質(zhì)財(cái)富：如食用菌（香菇、木耳、銀耳）、藥用真菌（神曲、茯苓、靈芝、麥角等）、工業(yè)真菌（制醬、釀醋、釀酒、制革、生產(chǎn)抗生素等）、農(nóng)業(yè)真菌（9.20生長制激素、醣化飼料、微生物飼料添加劑等）。

但有少數(shù)真菌（400種）可引起人致病，叫病原性真菌。

按其侵犯部位不同，病原性真菌可分為淺部感染真菌（表面真菌、皮膚癬真菌和皮下組織感染真菌）和深部感染真菌（假絲酵母菌、隱球菌、曲霉、毛菌目真菌、組織胞漿菌和卡氏肺孢菌）。

近年來由于抗生素、免疫抑制劑和放射療法等在臨床廣泛應(yīng)用，招致菌群失調(diào)和機(jī)體免疫因素降低，引起真菌二重感染與日俱增，應(yīng)引起醫(yī)務(wù)工作者的高度重視。另有大量文獻(xiàn)報(bào)告黃曲霉素可導(dǎo)致肝臟變性、肝細(xì)胞壞死、肝硬化，也可誘發(fā)家兔、GP等動物的實(shí)驗(yàn)性肝癌，可能與人的肝癌相關(guān)。

鐮刀菌——胃癌，胰腺癌，垂體和腦腫瘤。

青霉菌——甲狀腺瘤，肝臟腫瘤。

展青霉素——肉瘤。臨床上疑為真菌病的患者要明確診斷，必須進(jìn)行真菌的檢驗(yàn)。

一、正確采集與處理標(biāo)本

根據(jù)真菌感染的部位采集不同的標(biāo)本，要求保質(zhì)、保量、保鮮和無污染。

原則：早期采集；無菌采集；根據(jù)目的菌的特征性用不同的方法采集；采集適量標(biāo)本；安全采集。1、痰：采晨痰，采前清潔口腔、深咳取痰5-10

ml于滅菌容器中，2h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，若>2h則需加入抗生素（“氯”0.05mg/ml或“青”20u/ml，“鏈”40u/ml）于4℃中冷藏，注意無菌操作，有條件者應(yīng)取支氣管沖洗液。若痰液粘稠，則用N-乙酰半胱氨酸或二硫丙醇稀釋，再取0.5ml接種于培養(yǎng)基。

2、腦脊液、尿液、膿汁：應(yīng)在無菌條件下穿刺取材，2000rpm15min離心，取沉淀物涂片鏡檢，并取0.1ml沉淀物接種適當(dāng)培養(yǎng)基。

3、血液：無菌條件下取抗凝血，置于適當(dāng)培養(yǎng)基中30℃有O2培養(yǎng)，每周檢查一次，并取培養(yǎng)物于肉湯中培養(yǎng)，連續(xù)觀察6周。

4、皮屑：清潔皮膚，用75%酒精消毒局部皮膚，用無菌水擦去酒精，再取標(biāo)本。

5、毛發(fā)：取病發(fā)15根、消毒。3-5根直接鏡檢

，5-10根接種于SDA斜面。

6、甲屑：鉆取交界處組織培養(yǎng)。

7、活檢標(biāo)本：取2份，一份鏡檢培養(yǎng)，另一份送病理檢驗(yàn)。二、直接鏡檢

標(biāo)本→制片（標(biāo)本+10%KOH，加蓋玻片，并微加熱）→鏡檢（LPorHP）：菌絲、孢子。

該法可直接快速準(zhǔn)確地確定有無真菌感染，但陰性結(jié)果也不能完全除外真菌感染。

三、分離培養(yǎng)

可確定真菌的菌種，彌補(bǔ)直接鏡檢之不足。

培養(yǎng)基：常用沙氏培養(yǎng)基

培養(yǎng)條件：

淺部真菌常用22～28℃（平均25℃），需O2、潮濕、PH5.5，生長緩慢、1-2W才長出菌落。

深部真菌條件似普通細(xì)菌，35℃～37℃，3-4天可見菌落。

培養(yǎng)方法：

1、大培養(yǎng)：標(biāo)本→沙氏斜面→菌落形態(tài)：酵母型(如酵母菌、新生隱球菌)；類酵母型(如白色假絲酵母)；絲狀型(皮膚絲狀菌…)。

2、小培養(yǎng)

標(biāo)本→玻片培養(yǎng)基+蓋玻片→直接鏡檢菌絲、孢子

注意真菌的臨床標(biāo)本檢驗(yàn)主要依靠直接鏡檢及分離培養(yǎng)技術(shù)，只要在臨床標(biāo)本中連續(xù)3次檢出同種形態(tài)的菌絲和孢子及某種特殊結(jié)構(gòu)，則可認(rèn)為所查真菌為致病性真菌。

四、動物接種

是研究真菌的重要方法之一。

動物實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、分離病原性真菌。

2、確定菌種的致病性；

3、觀察真菌在組織內(nèi)的形態(tài)及組織學(xué)變化；

4、可恢復(fù)和加強(qiáng)菌種的毒力；

5、用于真菌的基礎(chǔ)研究。

如新生隱球菌—小白鼠敏感，腹腔或顱內(nèi)注射，小白鼠很快發(fā)病，并可于腹腔或顱組織中找到本菌。

又如白色假絲酵母—家兔感染最敏感和強(qiáng)烈，用1ml1%NS菌懸液靜脈注射，4-5天內(nèi)可死亡，腎臟可見小膿腫，鏡檢可見2.5-4.0μm的芽生細(xì)胞。

再如皮膚絲狀菌懸液外涂于GP或家兔的皮膚，可引起皮膚感染。

五、病理組織檢驗(yàn)

是診斷真菌病，特別是深部真菌及鑒定雙相真菌（在動物體內(nèi)和37℃含動物蛋白的培基內(nèi)呈酵母型，在22℃沙氏培養(yǎng)基上出現(xiàn)絲狀型菌落）的重要方法。真菌引起的病理變化為非特異性，但