生物化學：2蛋白質的分離純化

蛋白質分離純化及蛋白質測定方法及評價一、蛋白質分離純化方法研究蛋白質或酶的物理及化學性質,首先需進行純化

若要研究蛋白質或酶的主體結構及酶的活性中心,催化反應機理等,則還需清除最后殘留在分子中的微量其它蛋白和大分子化合物分離蛋白質及酶類要顧及最大的生產(chǎn)量要顧及最大的催化活性要使蛋白及酶純度盡可能達到最高1.蛋白質分離純化的技術路線設計及條件蛋白質的分離純化不可能有一個固定的程序適用于各種蛋白質的分離制備工作。蛋白質分離純化的總目標是增加制品的純度（purity）或比活（specificactivity）蛋白質分離要點:1.爭取時間2.能簡則簡親和層析電泳分離蛋白純品精分離粗分離前處理凝膠層析生物體組織細胞離心分離鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法蛋白質粗制品蛋白質粗抽提液組織粉碎細胞裂解蛋白釋放DNA釋放離子交換層析

蛋白質分離純化的一般技術路線2、材料的選擇及預處理分離純化蛋白質應先考慮選擇適當?shù)牟牧稀＿x材要依據(jù)研究、診斷的目的及遵循以下原則：一所含靶蛋白量高；二材料易得。進行預處理：剔除不必要的結締組織、脂肪組織等；取出的組織和器官要迅速處理；精制某些易在體內(nèi)被分解的活性蛋白質、酶或蛋白激素時，一般易用新鮮材料；培養(yǎng)的細胞中分離純化時，充分洗滌，離心收集細胞。3、細胞破碎的方法除了體液、細胞外某些靶蛋白不需要破碎細胞外，對于胞內(nèi)及多細胞生物組織中各種蛋白質的分離純化均需粉碎組織、裂解細胞，使蛋白質充分釋放至裂解液中。各種組織細胞破碎方法細胞破碎方法應用Ⅰ機械法1勻漿法機體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細菌、酵母Ⅱ物理法1超聲法細胞混懸液2反復凍融法培養(yǎng)細胞3冷熱交替法細菌、病毒4低滲裂解紅細胞Ⅲ化學法1有機溶劑細菌、酵母2表面活性劑組織、培養(yǎng)細胞3酶解法細菌、酵母材料的預處理及細胞破碎

使蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)及活性。常用的破碎組織細胞的方法有：1.機械破碎法：利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。2.滲透破碎法：在低滲條件使細胞溶脹而破碎。3.反復凍融法：生物組織經(jīng)凍結后，細胞內(nèi)液結冰膨脹而使細胞脹破。4.超聲波法：使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。5.酶法：如用溶菌酶破壞微生物細胞等。四、蛋白質的分離純化方法分離純化的方法一般有：①以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、分配層析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀和結晶等；②以分子大小及形狀差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾層析等；③以電離性質差異為依據(jù)的方法：電泳、離子交換層析等；④以生物學功能專一性為依據(jù)的方法：親和層析。分子大小：

透析、超濾、離心、凝膠過濾分子形狀：離心，過濾主要技術溶解度：

等電點沉淀、鹽溶和鹽析、有機溶劑、溫度電荷：

電泳、離子交換層析主要技術密度：離心親和力：

親和介質穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性、蛋白酶解穩(wěn)定性分配系數(shù)：雙水相萃取分離蛋白質粗制品的獲得

選用適當?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|與其它雜質分離開來。常用的有下列幾種方法：

1.等電點沉淀法

2.鹽析法

3.有機溶劑沉淀法樣品的進一步分離純化

凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。

有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。4.蛋白質的質量鑒定

1、純度鑒定

2、活性鑒定3、濃度鑒定蛋白質樣品的純度鑒定蛋白質的純度（purity）：指是不含有其它雜蛋白，但不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子在內(nèi)。目前常用的鑒定純度的方法有：有聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS、毛細管電泳（CE）、等電聚焦電泳（IFE）及高效液相色譜（HPLC）。只用一種方法鑒定蛋白質的純度是不夠的，至少應用兩種以上的方法，而且是兩種分離原理不同的方法，來判斷蛋白質的純度才比較可靠。最終的純度標準，唯一的氨基酸順序蛋白質的活性定量測定蛋白質混合物中某一特定靶蛋白的含量通常要用具有高度特異性的生物學方法?；钚缘臏y定和總蛋白量的測定配合起來可以用來表示分離純化過程中某一特定靶蛋白的純化程度。純化程度常用這一特定成分的含量（一般用活力單位）與總蛋白量（質量單位）之比來表示。定量蛋白質有如下假定所有蛋白質都是單純的多肽鏈，糖脂類及金屬有機物等均不計在內(nèi)，其含氮量平均為16%各種蛋白質理化性質雖不一樣，但與化學試劑的反應一致采用哪一種方法，一般考慮的是準確性、操作方便、影響因素少。二、蛋白質定量檢測方法蛋白質測定的基礎蛋白質含氮量16%重復的肽鍵結構蛋白質中所含的酪氨酸和色氨酸殘基對酚試劑反應或紫外吸收與色素的結合能力沉淀后的濁度或光折射改變（上述原理不但適合于總蛋白質的測定，也可用于分離出來的蛋白質組分的測定）臨床檢驗中測定蛋白質的幾種情況測定血清（漿）總蛋白蛋白質電泳以獲取各類蛋白質所占比例測定個別蛋白質蛋白質測定一般需要一個已知蛋白濃度的標準品來繪制標準曲線或作為標準管與樣品同時測定。凱氏定氮法測定蛋白質最古老方法當今蛋白質標準定值方法由于體內(nèi)的含氮物質以蛋白質為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質的大致含量凱氏定氮法

高溫,濃酸OH-蛋白質（N）——NH4＋——NH3——硼酸吸收——用酸堿滴定或納氏試劑測定氮含量——按6.25g蛋白質/1g氮計算蛋白質含量

凱氏定氮法樣品消化：消化反應方程式如下2NH3（CH2）2COOH+13H2SO4

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O蒸餾：在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應方程式如下：2NaOH+（NH4）2SO4

2NH3↑+Na2SO4+2H2O吸收與滴定：加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標準溶液滴定2NH3+4H3BO3

（NH4）2B4O7+5H2O（NH4）2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3

凱氏法的優(yōu)點是適用范圍廣，可用于動植物的各種組織、器官及食品等組成復雜樣品的測定，但操作比較復雜，含大量堿性氨基酸的蛋白質測定結果往往偏高，其他含氮物質對測定結果有干擾.

該法靈敏，準確，是目前建立各個具體方法時采用的參考標準方法。雙縮脲法（Biuret）臨床上首先推薦的蛋白質定量蛋白質中的肽鍵（－CONH－）在堿性溶液中能與銅離子作用產(chǎn)生紫紅色絡合物。此反應同兩個尿素分子縮合后生成的雙縮脲在堿性溶液中與銅離子作用形成紫紅色的反應形似，故稱為“雙縮脲反應”至少含有兩個－CONH－基團才能反應，故二肽以上才有上述現(xiàn)象蛋白質和多肽中的肽鍵在堿性溶液中與銅離子共熱，生成紫紅色的絡合物。顯色強度和蛋白濃度成正比。O=CC=ONHHNR-CHCH-RO=CC=ONHHNR-CHCH-RCu2+標本采集病人準備：無特殊要求。最好用禁食的標本以減少乳糜血的干擾。類型：血清或血漿。標本存放20～25℃保存可穩(wěn)定6天；4～8℃保存可穩(wěn)定4周；-20℃保存至少可穩(wěn)定1年。標本運輸室溫條件下運輸參考值范圍[g/L]成人：60～80兒童/青少年男女1～30天42～62

41～631～6個月44～66

47～676個月～1歲56～79

55～701～18歲57～80

57～80（注：各實驗室應有自己的參考范圍。）參考值因性別、年齡、飲食和地域的不同而有所差別。根據(jù)好的實驗室經(jīng)驗，每個實驗室應建立自己的參考值。操作簡單快速，重復性好，干擾物質少，不同蛋白質之間影響小。清、球蛋白產(chǎn)生的顏色反應相近；適于自動化分析，線形范圍：0.5--150g/L靈敏度較低100ug/ml精密度：批內(nèi)重復性小于3%，總不精密度小于3%。檢測限：0.5g/L干擾物質：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。靜脈滴注大量右旋糖酐的病人血清或血漿，使用雙縮脲方法的檢測結果會明顯增高；

主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要非常精確的蛋白質測定。

Folin-酚試劑法

（Lowry法）是檢測可溶性蛋白質含量最靈敏的經(jīng)典方法之一作用機理主要是蛋白質中的肽鍵與堿性銅鹽產(chǎn)生雙縮脲反應，同時蛋白質中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應后生成藍色化合酸。蛋白質與福林（Folin）-酚試劑反應，產(chǎn)生藍色復合物，呈色強度與蛋白質含量成正比。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入Folin—酚試劑，以增加顯色量，提高了檢測蛋白質的靈敏度。本法靈敏，受多種還原性物質干擾，不同蛋白質之間差異大Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。優(yōu)點:靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多缺點:費時，需精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。注意:進行測定時，加Folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發(fā)生，故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發(fā)生。

此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。

干擾物質：

雙縮脲反應發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。容易受到非蛋白物質的影響；含EDT

A，Tritonx-100，ammoniasulfate等物質的蛋白不適合此種方法。操作簡單，重復性好，無需昂貴設備，適于一般實驗室使用。靈敏度：1ug/ml此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。測定范圍是20~250mg。

干擾物質多，反應速度慢，不同蛋白質間差異大，準確性差。染料結合法

（dyeconjugation）酸性環(huán)境中蛋白質分子可解離出帶有正電荷的-NH3+基團，它可與陰離子的染料產(chǎn)生顏色反應，與同樣處理的標準溶液比較即可求得樣品中蛋白質的含量染料有CBBG-250、氨基黑、麗春紅、鄰苯三酚紅－鉬酸鈉、銀、膠體金等考馬斯亮藍G-250染料結合法血清總蛋白測定最常用的染料是考馬斯亮藍G-250（CBBG-250），即Bradford法染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。

在595nm下測定的吸光度值A595，在酸性條件下，CBBG-250與蛋白質結合后由棕紅色變?yōu)樗{色，反應迅速而穩(wěn)定，最大光吸收從465nm移至595nm,呈色與蛋白質濃度成正比。

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。

優(yōu)點：

（1）靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。

（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。

（3）干擾物質少。

缺點：

（1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差。

（2）干擾物質有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。

本法簡便快速，重復性好，靈敏度高，但特異性不高，MW大于3000的多肽也參與反應，強堿和去垢劑會影響呈色，清、球蛋白呈色強度不同。紫外吸收法紫外吸收法蛋白質中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基含有共軛雙鍵，在280nm處有吸收峰蛋白質中肽鍵在220-238nm左右存在光吸收應用：總蛋白含量測定與核酸鑒別：生物樣品中?；煊泻怂?，其最大吸收峰在260nm，因此可進行鑒別1．A280nm光吸收法原理:蛋白質的芳香環(huán)殘基在紫外區(qū)內(nèi)對一定波長的光具有選擇吸收作用。在（280mm波長下，光吸收程度與蛋白質濃度（3～８mg／mL）成直線關系，因此，通過測定蛋白質溶液的吸光度，并參照事先用凱氏定氮法測定蛋白質含量的標準樣所作的標準曲線，即可求出樣品蛋白質含量。本法操作簡便迅速2．A260nm和A280nm比值法原理凡是有共軛雙鍵的物質，均具有紫外吸收值。因此，若樣品中含核酸，則嘌呤、嘧啶兩類堿基對蛋白質的測定產(chǎn)生干擾，應加以校正。核酸在260nm處的紫外吸收值大于280nm處的紫外吸收值，但蛋白質恰恰相反。由于不同的蛋白質和核酸對紫外吸收不同，校正后的測定結果還存在一定的誤差。Lowry－kaleker公式

蛋白質濃度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260Warburg－Christian公式

蛋白質濃度(mg/ml)=1.55A280-0.76A260Waddell公式

蛋白質濃度(mg/ml)=144×

（A215-A225）核酸對測定蛋白質濃度的干擾較正公式3．A215nm和A225nm的吸收差法原理對于蛋白質的稀溶液，由于蛋白質含量低而不能使用280nm的光吸收測定，可用215nm和225nm吸收值之差求算蛋白質濃度。方法分別測定樣品A215nm和A225nm，并求出差值，與蛋白質標準溶液吸收差值作對照，求出樣品的蛋白質含量。

本法在20～100mg/L蛋白質范圍內(nèi)呈良好線性關系。4．肽鍵紫外光測定法原理蛋白質溶液在238nm下均有光吸收，其吸收強弱與肽鍵多少成正比，根據(jù)這一性質，可測定樣品在238nm下的吸收值，與蛋白質標準液作對照，求出蛋白質含量。本法比280nm吸收法靈敏紫外吸收法簡便快速，樣本可回收再利用，但儀器昂貴，不同蛋白質之間差異大（法1-2），且游離酪氨酸、色氨酸、尿酸和膽紅素等也存在紫外光吸收。臨床上極少用于體液蛋白質含量的測定？幾種方法的比較方法靈敏度化學干擾不同蛋白質間差異快速性與復雜性雙縮脲100μg中等小快速簡易

福林-酚1μg嚴重大較復雜CBBG-2501μg低大快速簡單紫外分光光度法10μg較嚴重大快速簡單比濁法

（turbiditymethod）某些強酸（三氯醋酸、磺基水楊酸等）能與生物堿結合而沉淀，稱為生物堿試劑。它們可與蛋白質結合產(chǎn)生細微沉淀，通過比濁求得蛋白質含量在酸性溶液中蛋白質帶有正電荷，可與帶負電荷的生物堿試劑結合形成細微沉淀，經(jīng)測定懸浮液的濁度，與同樣處理的蛋白質標準品比較，即可求得樣品中蛋白質的含量此法操作簡便，試劑易得，但濁度強弱受多種因素影響折光測定法

（ratioofrefraction）溶解在溶液中的固體可以增加溶液的光折射，通過測定血清的折射指數(shù)可以計算出總固體的含量由于每升正常血清中含有約16g非蛋白固體，它們對折射指數(shù)的影響必須進行校正折射率＝1.3353＋蛋白質濃度（g/dl）×

0.00191此法準確性較差，且清、球蛋白的折射率不同OPA熒光法OPA：o-phthalaldehyde,o-苯二醛在巰基乙醇存在條件下，OPA與主胺發(fā)生反應生成一種具有強烈藍色熒光的物質，其最大激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為455nm。本法靈敏度高，線性范圍廣白蛋白（Albumin）測定白蛋白是血清中含量最多的蛋白質將清、球蛋白分離后測定：鹽析法不分離清、球蛋白直接測定：染料結合法染料結合法測定白蛋白含量白蛋白能通過離子鍵或疏水鍵結合低分子物質（包括生理性代謝物和外源性物質）能力強，故可不分離清、球蛋白直接測定染料多用溴甲酚綠（BCG）、溴甲酚紫（BCP）藥物（青霉素等）、膽色素等能與染料競爭結合白蛋白，故可干擾測定結果靈敏度高，操作簡便，重復性好溴甲酚綠（BCG）法測定白蛋白BCG:bromcresolgreen,一種陰離子染料,全稱:3,3’,5,5’-四溴-間-甲酚磺酞在pH4.2及非離子去垢劑Brij-35存在條件下，BCG可與白蛋白緊密結合形成蘭綠色復合物，于630nm處有強的光吸收BCG與白蛋白的復合物會發(fā)生部分沉淀，且BCG的特異性較差，能與球蛋白反應，但呈色強度較弱，同時反應速度較慢標本采集：病人：無特殊要求。最好用禁食的標本以減少乳糜血的干擾。血清、肝素或EDTA血漿。標本存放：留取標本后請盡快分離血清/血漿。在室溫條件下（15～25℃）可以穩(wěn)定一周，在冰箱保存的條件下（2～8℃）穩(wěn)定一個月，-20℃保存至少可以穩(wěn)定3個月。線性范圍2～60g/L

精密度：小于3%重復性：AU1000批內(nèi)重復性小于3%，總不精密度。靈敏度：2g/L。干擾：當樣品中抗壞血酸濃度1704mol/L，膽紅素濃度684mol/L，血紅蛋白濃度

4.00g/L，甘油三酯濃度5.63mmol/L時沒有觀察到干擾。溴甲酚紫（BCP）法測定白蛋白化學結構與BCG相似在pH5.2及brij-35存在條件下，可與白蛋白形成紫色復合物，于603nm處有光吸收BCP與白蛋白的反應是即時完全反應BCP與白蛋白反應特異性高，與血清非蛋白成分反應微弱，干擾小球蛋白測定臨床檢驗中多用總蛋白與白蛋白之差計算乙醛酸直接測定：在酸性溶液中，蛋白質的色氨酸殘基與乙醛酸反應，產(chǎn)生紫色化合物，稱Hopkins-Cole反應，可于540nm比色，球蛋白中色氨酸約2％～3％，而白蛋白僅0.2％白蛋白與球蛋白比值（A/G比值）：

衡量肝臟疾病的嚴重程度

正常值：1.5-2.5:1<1,比值倒置，為慢性肝炎或肝硬化的特征之一That’sallThankyou！透析法：根據(jù)分子量的大小，用透析袋將大、小分子物質分開。去除溶液中的鹽分、有機溶劑、小分子抑制劑、過剩的反應物、底物等最常見、最方便的方法。超濾法：利用高壓力或離心力，使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。離心：蛋白質在離心通過溶液運動時，或通過膜、凝膠過濾填料顆?；螂娪灸z中的小孔運動時，都會受到形狀的影響

凝膠過濾：根據(jù)被分離物質的分子大小不同來進行分離.等電點沉淀：蛋白質在等電點時其溶解度、導電性、粘度、滲透壓最小，且較不易溶解。+++++++帶正電荷的蛋白質－－